Introduction
ترنسفكأيشن من الأحماض النووية في خلايا لديه تطبيق متنوعة في مجال البحث العلمي. ومن الأمثلة على ذلك (1) الجينات مراسل لدراسة دور العناصر الجينات المختلفة في التعبير الجيني، (2) البلازميدات التعبير البروتين إلى بإفراط البروتين من الفائدة، و (3) الصغيرة بالتدخل RNA إلى downregulate التعبير الجيني. عن طريق التلاعب في مستوى التعبير عن جينات معينة وقياس الأثر التفاضلي لهذه التلاعبات، يمكن للباحثين استدلال على وظائف الجينات في النظم البيولوجية الذي تم اختياره. ليس كل طرائق نقل توفر نفس الكفاءة ترنسفكأيشن، وحتى نفس الأسلوب ترنسفكأيشن لا transfect جميع أنواع الخلايا على قدم المساواة 1. وبالتالي، تم وضع طرائق نقل مختلفة مثل طريقة فوسفات الكالسيوم، DEAE ديكستران، الموجبة الدهون ترنسفكأيشن، الموجبة البوليمر ترنسفكأيشن غير الدهون، Electroporation لل، وnucleofection 2،3.
ترنسفكأيشن إلى الضامة هو ESPEمن الصعب السيما يرجع ذلك إلى حقيقة أن الضامة هي البالعات المهنية التي هي حساسة جدا للمواد الأجنبية بما في ذلك البكتيريا المستمدة (الميثيلي) DNA (4). إدخال DNA الخارجية ينشط مسارا-تول مثل مستقبلات 9 (TLR9) مما يؤدي إلى إنتاج السيتوكينات وأكسيد النيتريك 5،6. هذه الضامة تفعيلها قد تكون أقل استجابة للعلاج أن ينوي الباحثون إلى دراسة.
لدينا مختبر transfects بشكل روتيني خط خلية بلعم RAW264.7 مع الجينات luciferase المراسل، ونحن قد وضعت البروتوكول الذي هو قوي بما يكفي ليكون إشارة luciferase المراسل أعلى بكثير من الخلفية، ولكن أيضا لطيف بما فيه الكفاية لالضامة أن تظل في حالة الراحة الخاصة بهم. تم تقييم السلوكيات من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل عن طريق الجينات مراسل يراعة، luciferase المراسل إيواء منطقة المروج من IκBζ (pGL3- IκBζ). وupregulated IκBζ التعبير من قبل جدار الخلية البكتيرية مكون الشفةopolyssacharide (LPS) 7،8، وdownregulated من قبل خلوى المضادة للالتهابات، انترلوكين 10 (IL-10) 8. لحساب التباين بين ترنسفكأيشن الآبار، شاركنا في transfect البلازميد التحكم التي تحتوي على Renilla luciferase المراسل الجين (على سبيل المثال، phRL-TK) لأغراض التطبيع. هو الأمثل بروتوكول صفها بعد اختبار معايير مختلفة بما في ذلك توقيت ترنسفكأيشن، نوع من الكواشف ترنسفكأيشن، وكميات من الكواشف ترنسفكأيشن وDNA البلازميد، وكذلك نسبة كاشف ترنسفكأيشن إلى البلازميد الحمض النووي. الكواشف ترنسفكأيشن اثنين الواردة في هذا البروتوكول هي (1) كاشف ترنسفكأيشن الدهون على أساس و(2) بروتين / القائم البوليامين كاشف ترنسفكأيشن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. البلازميد DNA تنقية
- استخراج DNA البلازميد باستخدام طقم maxiprep وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. و resuspend DNA البلازميد في 500 ميكرولتر من TE العازلة.
- إجراء الفينول: الكلوروفورم: أيزو أميلي استخراج الكحول والأيسوبروبانول هطول الأمطار لإزالة الملوثات البكتيرية المتبقية. وجود LPS يتداخل مع ترنسفكأيشن 9.
- إضافة 500 ميكرولتر من الفينول: الكلوروفورم: كحول أيزو أميلي (25: 24: 1، ودرجة الحموضة 8) إلى DNA البلازميد ويهز بقوة لمدة 15 ثانية. الفينول يسبب حروقا جلدية شديدة وغير مخدر حتى لا يشعر حروق دائما حتى لا يكون هناك ضرر شديد. أداء الفينول: استخراج أيزو أميلي في غطاء الدخان وتوخي الحذر: الكلوروفورم.
- احتضان الخليط لمدة 5 دقائق على RT. أجهزة الطرد المركزي في 13000 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. نقل 350 ميكرولتر من المرحلة المائية العليا في أنبوب جديد 1.5 مل المجموعة.
- إضافة 350 ميكرولتر من TE العازلة إلى الأنبوب الذي يحتوي على أقل المرحلة العضوية. هزة بقوة لمدة 15 ثانية. أجهزة الطرد المركزي في 13000 x ج لمدة 5 دقائق على RT. نقل 350 ميكرولتر من المرحلة المائية العلوية إلى نفس 1.5 مل أنبوب جمع.
- إضافة 70 ميكرولتر من 3 M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2) وتخلط جيدا. إضافة 700 ميكرولتر من 100٪ الأيزوبروبانول. تخلط جيدا واحتضان 10 دقيقة في RT. الطرد المركزي في 13000 x ج لمدة 10 minat 4 ° C. إزالة طاف.
- إضافة 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 75٪ لبيليه. عينات دوامة لخلط وأجهزة الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. إزالة طاف. الحمض النووي هو في بيليه.
- فتح غطاء الأنبوب والهواء الجاف بيليه في RT ل5-10 دقيقة. وينبغي أن تصبح بيليه شفافة. إضافة 500 ميكرولتر من TE عازلة لresuspend الكرية DNA. الحرارة في 50-60 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة إلى حل بيليه DNA.
- قياس الامتصاصية في 260 نانومتر (A260) و 280 نانومتر (A280) مع مطياف. حساب تركيز الحمض النووي عن طريق ضرب قيمة A260 بنسبة 50 نانوغرام / ميكرولتر. تقييم نوعية الحمض النووي عن طريق calculatinز نسبة A260 / A280. DNA ذات جودة عالية يجب أن تعطي نسبة A260 / A280 من 1،8-2،0.
2. زراعة خلية والبذر
- خلايا RAW264.7 الثقافة في DMEM تستكمل مع 9٪ مصل العجل الجنين (DMEM / 9٪ FCS) في 37 ° C، 5٪ CO 2 الحاضنة. خلال كل مرور، فصل الخلايا من لوحة من قبل pipetting المستمر باستخدام ماصة باستور. مرور الخلايا كل أيام 2، والبذور 1،5-2٬000٬000 الخلايا على طبق نسيج الثقافة 10 سم يعامل سهم. ذوبان الجليد مخزون جديد من الخلايا كل 5-6 أسابيع.
- في يوم ترنسفكأيشن، البذور 200،000 الخلايا لكل بئر في لوحة 24-جيدا في حجم 500 ميكرولتر من DMEM / 9٪ FCS. احتضان الخلايا لمدة 4 ساعات في C حاضنة 37 درجة.
- خلايا Transfect إما مع كاشف القائم على الدهون (الخطوة 3.1) أو كاشف يستند البوليامين البروتين / (الخطوة 3.2).
3. ترنسفكأيشن
- الدهون على أساس ترنسفكأيشن:
- الاحماء reagen ترنسفكأيشنر لRT في الظلام. الاحماء المصل خالية المتوسطة وDMEM / 9٪ FCS إلى 37 درجة مئوية.
- إضافة 0.5 ميكروغرام من DNA البلازميد إلى 50 ميكرولتر من المصل خالية المتوسطة في أنبوب 1.5 مل. إضافة 2 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن مع طرف ماصة تحت سطح السائل. دوامة لمدة 6 ثانية.
- ترك الخليط كاشف / DNA في الظلام في RT لمدة 30 دقيقة.
- أثناء الحضانة 30 دقيقة، وإزالة وسائل الاعلام من البئر وإضافة 250 ميكرولتر من جديد FCS DMEM / 9٪ إلى كل بئر.
- بعد 30 دقيقة، إضافة 250 ميكرولتر من DMEM / 9٪ FCS إلى خليط كاشف / DNA. مزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
- إضافة 300 ميكرولتر من خليط المخفف إلى كل بئر. احتضان لمدة 2-4 ساعة في 37 ° C، 5٪ CO 2 الحاضنة.
- إزالة الحل ترنسفكأيشن وإضافة 500 ميكرولتر من DMEM / 9٪ FCS. احتضان لمدة 24 - 48 ساعة في 37 ° C، 5٪ CO 2 الحاضنة قبل التحفيز الخلية.
- بروتين / القائم البوليامين ترنسفكأيشن:
- الاحماء المصل خاليةالمتوسطة وDMEM / 9٪ FCS إلى 37 درجة مئوية.
- إضافة 0.75 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن إلى 18.75 ميكرولتر من المصل خالية المتوسطة. دوامة لفترة وجيزة لخلط. في احتضان RT لمدة 5 دقائق. إضافة 0.5 ميكرولتر من 1 ميكروغرام / DNA ميكرولتر في كاشف transfected المخفف. في احتضان RT لمدة 10 دقيقة.
- أثناء الحضانة 10 دقيقة، وإزالة وسائل الإعلام من كل بئر من 24 لوحة جيدا وإضافة 250 ميكرولتر الطازجة DMEM / 9٪ FCS إلى كل بئر.
- بعد 10 دقيقة، إضافة 250 ميكرولتر من DMEM / 9٪ FCS في خليط كاشف / DNA.
- إضافة 270 ميكرولتر من خليط المخفف إلى البئر. احتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 حاضنة لل2-4 ساعة.
- إزالة الحل ترنسفكأيشن وإضافة 500 ميكرولتر من DMEM / 9٪ FCS. احتضان لمدة 24 - 48 ساعة في 37 ° C، 5٪ CO 2 الحاضنة.
4. تحفيز الخلية وluciferase المراسل الفحص
- استبدال وسائل الإعلام في البئر مع 250 ميكرولتر من الطازجة DMEM / 9٪ FCS.
- إضافة 50 ميكرولتر من LPS أو LPS + IL-10 عند التراكيز المطلوبة إلى البئر. العودة إلى لوحة 37 ° C، 5٪ CO 2 الحاضنة. تحفيز ل2-6 ساعة.
- إزالة حل التحفيز بواسطة الشفط، ويغسل مع الثلج الباردة PBS، وإضافة 200 ميكرولتر من 1X السلبي الاحتياطي تحلل. موسيقى الروك في RT لمدة 30 دقيقة. كشط ونقل المحللة إلى 1.5 مل أنابيب وإزالة الحطام الخلية عن طريق الطرد المركزي في 20000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- نقل 40 ميكرولتر من المحللة تطهيرها (طاف) إلى الأبيض، واضح أسفل لوحة 96-جيدا لتحديد إشارات luciferase المراسل وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- قراءة إشارة luciferase المراسل مع luminometer عبر ضوء كامل الطيف المرئي.
5. تحليل البيانات
- حساب يراعة: نسبة Renilla بقسمة القيم الفردية من يراعة luciferase من قيم Renilla luciferase المراسل من كل بئر.
- حساب التغير أضعاف بقسمة يراعة: نسبة Renilla من معاملة حسنة من قبلأن البئر غير المعالجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1 يقارن كفاءة ترنسفكأيشن من اثنين من الكواشف ترنسفكأيشن في RAW264.7. أعطى كاشف القائم على الدهون عادة معدل ترنسفكأيشن حوالي 25٪، في حين أدى ترنسفكأيشن أساس البوليامين البروتين / في حوالي 5٪ كفاءة (الشكل 1A). وقد لوحظ الفرق في الكفاءة ترنسفكأيشن أيضا في إشارات luciferase المراسل في الخلايا RAW264.7 مع transfected المروج مراسل pGL3-IκBζ (الشكل 1B). إضافة LPS لهذه الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل زادت إشارة يراعة luciferase، مؤشرا مباشرا لزيادة النشاط النسخ لمراسل المروج IκBζ. وبعبارة أخرى، أشارت النتائج إلى أن LPS upregulated التعبير عن الجين IκBζ، بما يتفق مع التقارير السابقة 7،8 الشكل 2 يوضح نتائج نموذجية تم الحصول عليها في تجاربنا، وذلك باستخدام ترنسفكأيشن الدهون على أساس كمثال على ذلك. بعد الحصول على قيم الإشارات الفردية من فايluciferase المراسل refly وRenilla luciferase المراسل (أرقام 2A و 2B)، وكانت الإشارات يراعة luciferase تطبيع للRenilla luciferase المراسل إشارة (الشكل 2C). يوصى تطبيع نظرا لاختلاف جيد إلى جيد في كفاءة ترنسفكأيشن. لتحديد ما إذا كانت الظروف العلاج (LPS أو LPS + IL-10) غيرت إشارات مراسل واليراع: نسبة Renilla (أي إشارات طبيعية) وقورنت المجموعات المعالجة مع أن من غير المعالجة (unstimulated) عينة (الشكل 2D ). وأظهرت البيانات المتوفرة لدينا أن علاج الخلايا RAW264.7 مع LPS upregulated النشاط لمراسل المروج pGL3-IκBζ، مشيرا إلى أن LPS زيادة مستوى نسخ من الجين IκBζ. في ظل وجود IL-10، وكان مراسل المروج IκBζ انخفاض النشاط، مما يشير إلى أن IL-10 كانت قادرة على كبح يسببها LPS-نسخ من الجين IκBζ. و/ ترنسفكأيشن القائم على البوليامين البروتين عادةأعطى انخفاض القيم في كل يراعة luciferase وإشارات luciferase المراسل Renilla الشكل 3 يقارن طول وقت الراحة بين ترنسفكأيشن والتحفيز (24 ساعة أو 48 ساعة)، ويدل على أن إشارات luciferase المراسل انخفضت مع مرور الوقت. لم انخفاض في إشارة لا تتداخل مع تفسير البيانات عند استخدام الدهون على أساس كاشف ترنسفكأيشن (الشكل 3A)؛ تحريض من قبل LPS وعن طريق تثبيط IL-10 لا تزال لوحظ بعد 48 ساعة من الراحة. ومع ذلك، كان الانخفاض في إشارة أكثر أهمية عندما تم استخدام البروتين / القائم البوليامين كاشف ترنسفكأيشن (الشكل 3B)، وخصوصا إشارات luciferase المراسل Renilla. ونتيجة لذلك، لم يكن لوحظ الفرق بين مجموعات العلاج بعد راحة 48 ساعة.
واحد أثر غير مرغوب فيه من ترنسفكأيشن هو موت الخلايا بحيث تم تقييم تأثير كل طريقة ترنسفكأيشن على درجة من موت الخلايا المبرمج. و transfected الخلايا، أم لا، وتعرض لAnnexin-V ويوديد propidium (PI)تلطيخ. وقد تم تحليل لست] أعدت من هذه الخلايا أيضا لوجود سليمة والمشقوق بولي ADP الريبوز البلمرة (PARP) البروتين. اقترح تحليل تدفق cytometric من Annexin-V / PI ملطخة الخلايا التي ترنسفكأيشن الدهون على أساس زيادة طفيفة في نسبة الخلايا إيجابية Annexin-V بالمقارنة مع الخلايا untransfected، في حين لم ترنسفكأيشن أساس البوليامين البروتين / لا (الشكل 4A) . وبالمثل، القائم على الدهون وtransfected زيادة نسبة PARP المشقوق حين لم ترنسفكأيشن أساس البوليامين البروتين / لا (الشكل 4B) قليلا. ومع ذلك، على الرغم من أرقام مرتفعة من الخلايا أفكارك، مورفولوجيا الخلايا بواسطة المجهر الضوئي لم تتغير (الشكل 4C). الأهم من ذلك، ظلت الاستجابة البيولوجية للالخلايا المصابة بالعدوى بالنقل القائم على دهون مطابقة لتلك الخلايا untransfected (الشكل 4D). وقد حفز الخلايا مع LPS ± IL-10، ومبالغ TNF ^5؛ تفرز في طاف الثقافة وكميا بواسطة ELISA. كل من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل untransfected والقائم على الدهون جعلت كميات مماثلة من TNFα ردا على LPS وكانت تحول دون بإضافة IL10. لم يبذل أي TNFα عندما لم حفز الخلايا (الشكل 4D) مما يشير إلى أن الخلايا لا تزال ساذجة بعد ترنسفكأيشن.
أعطى الشكل 1. ترنسفكأيشن استنادا للدهون، أعلى كفاءة ترنسفكأيشن من البروتين / ترنسفكأيشن القائم على البوليامين. و transfected (A) خلايا RAW264.7 البلازميد، معربا عن GFP سواء مع الكواشف ترنسفكأيشن أساس البوليامين البروتين / الدهون على أساس أو. وقد تم قياس إشارة GFP التدفق الخلوي بعد 24 ساعة. و transfected (B) خلايا RAW264.7 مع مراسل المروج pGL3-IkBζ. بعد 48 ساعة من الراحة، جوقد حفز ملتعلمي اللغة اإلنكليزية مع LPS لمدة 6 ساعة. وقد تم قياس اليراع إشارة luciferase المراسل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
و transfected الشكل 2. البيانات luciferase المراسل فحص النموذجية. الخلايا RAW264.7 مع TK-Renilla وIkBζ مراسل المروج. بعد 24 ساعة من الراحة، وتحفيز الخلايا مع LPS ± IL-10 لمدة 2 ساعة. تم قياس (A) و luciferase اليراع (B) Renilla إشارات luciferase المراسل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة luciferase المراسل فحص و. كان (C) النشاط مراسل تطبيع للإشارة TK-Renilla وتآمر بوصفها نسبة اليراع / Renilla. يتم احتساب (D) أضعاف تغيير بقسمةيراعة: نسبة Renilla من العينات التي تحفزها من العينة unstimulated الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. قوة الإشارة luciferase المراسل غير المعتمدة على الزمن. وقد استراح (A) transfected القائم على الدهون و (ب) الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل استنادا البوليامين البروتين / إما 24 ساعة أو 48 ساعة قبل التحفيز مع LPS ± IL-10 لمدة 2 ساعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصف بروتوكول هنا لا يركز فقط على كفاءة ترنسفكأيشن، ولكن يهدف إلى تحقيق التوازن بين الكفاءة والحفاظ على الدول الفسيولوجية للخلايا. على وجه التحديد، نجحت إجراءاتنا في التقليل من سمية ترنسفكأيشن الكاشف وتعظيم إشارة luciferase المراسل.
خطوة حاسمة في البروتوكول هو صحة الخلايا. ثقافات متضخمة ليست مناسبة للترنسفكأيشن عن التغيرات علم وظائف الأعضاء، وزراعة المستمرة لخلايا RAW264.7 لفترة طويلة من الزمن يمكن أيضا تغيير النمط الظاهري وظيفة الخلايا 10. ينصح الخلايا إذابة حديثا التي لديها عدد مرور منخفض لاستخدامه في ترنسفكأيشن.
اعتبار آخر مهم هو اختيار الكواشف ترنسفكأيشن. وعادة ما تستخدم الكواشف ترنسفكأيشن في دهون البحوث نظرا لسهولة الاستخدام والتوافر التجاري. ومع ذلك، فإن بعض هذه الكواشف تسبب unintendeد (وعادة غير مرغوب فيه) التغيرات في التعبير الجيني العالمي في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل 11،12. لمعالجة هذه المشكلة، يتم تحضين الخلايا فقط مع الكواشف ترنسفكأيشن لبضع ساعات بدلا من O نموذجي / N، أو يتم اختيار كاشف غير القائمة على دهون، لترنسفكأيشن. سوف أطول فترة حضانة مع كاشف ترنسفكأيشن زيادة كفاءة ترنسفكأيشن، ولكن يمكن أيضا أن تكون ضارة للخلايا إما يسبب موت الخلايا أو تنشيط الخلايا، وكلاهما يمكن أن تتداخل مع التصميم التجريبي. أرقام 4A و 4B تبين أن البروتين / polyamine- لم ترنسفكأيشن لا يقوم يسبب موت الخلايا المبرمج أو نخر، بالمقارنة مع خلايا untransfected. ترنسفكأيشن الدهون على أساس، حتى مع وجود فترة حضانة قصيرة، تسبب مستوى أعلى من موت الخلايا. ويرتبط ذلك إلى كفاءة ترنسفكأيشن أعلى من الدهون على أساس كاشف ترنسفكأيشن. ومع ذلك، عندما لوحظت في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل تحت المجهر، لم يكن هناك تغيير ملحوظ الصرفيالصورة (الشكل 4C). الضامة تنشيط عادة ما تعتمد على الشكل المترامية الأطراف، ولكن كل من خلايا untransfected وtransfected لا تظهر علامات تنشيط قبل التحفيز، مما يشير إلى أنها كانت في ولايات يستريح بها. وبالإضافة إلى ذلك، ردت الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل على نحو مماثل لLPS وIL-10 التحفيز مثل خلايا untransfected (الشكل 4D). هذه الملاحظات تشير مجتمعة إلى أن هذا الإجراء ترنسفكأيشن لا يغير سلوك الخلايا الطبيعية.
الوقت بين ترنسفكأيشن والعلاج التجريبي (في وقت الراحة) هو أيضا في غاية الأهمية. ما يكفي من الوقت يحتاج إلى أن تعطى للجينات luciferase المراسل في التعبير عن وللخلايا لإعادة تأسيس الدولة يستريح فيها؛ ومع ذلك، يمكن للحضانة طويلة يقلل إشارات luciferase المراسل، وخصوصا عندما الكفاءة ترنسفكأيشن ليست عالية.
الإجراء هنا ينطبق على محدد الجين مراسل luciferase المراسل المستخدمة في مختبرنا. سوف تعديلات طفيفة يكون نيدائرة التنمية الاقتصادية عند استخدام مراسل آخر. المعلمات التي تحتاج لفحصها تشمل مختلف مراسل يراعة luciferase المراسل: Renilla نسبة luciferase المراسل، ووقت الراحة بين ترنسفكأيشن والعلاج، وشروط العلاج. A 50: 1 نسبة من pGL3-IκBζ: وعادة ما تستخدم phRL-TK، ولكن هذه النسبة يمكن أن تتراوح من 1: 1 1: 100. وقد وجد أن بقية 24 ساعة بين إزالة الحل ترنسفكأيشن من الخلايا وبدء العلاج التجريبي أعطت أفضل إشارة. بعد 48 ساعة، بدأت إشارات luciferase المراسل في الانخفاض، وخفضت الاختلافات بين مجموعات العلاج أو حتى إلغاؤها.
ولا يقتصر الإجراء ترنسفكأيشن وصف لفحوصات مراسل luciferase المراسل. وسوف يستفيد التصاميم التجريبية الأخرى التي لا تحتاج إلى السكان متجانسة. على سبيل المثال، المجهر الفلورسنت التي تعتمد على ملاحظات من الخلايا الفردية. وعيب واحد أن يكون لتحديد موقع الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل بنجاح بين نظرائهم untransfected، ولكنفوائد كونها أقل استهلاكا للوقت وكثيفة العمالة قد تكون أكثر المرجوة. في الحالات التي يفضل خطوط الخلايا مستقرة، ويوفر بروتوكول لدينا وسيلة لإجراء التجارب الأولية التي يمكن أن يكون الأمثل إجراء التجارب عندما يتم الآن إنشاء خطوط الخلايا مستقرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Life Technologies | K210007 | Any maxiprep kit will work |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Life Technologies | 15593-049 | Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container. |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30396.03 | Inactivated at 56 °C water bath for 45 min before use. |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Warm to at least room temperature before use. |
| XtremeGene HP DBA transfection reagent | Roche | 6366236001 | Warm to room temperature before use. |
| GeneJuice | EMD Millipore | 70967 | Warm to room temperature before use. |
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E1941 | 30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 |
References
- Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10 (1), 9-18 (2010).
- Thompson, C. D., Frazier-Jessen, M. R., Rawat, R., Nordan, R. P., Brown, R. T. Evaluation of methods for transient transfection of a murine macrophage cell line RAW 264.7. Biotechniques. 27 (4), 824-835 (1999).
- Kim, T., Eberwine, J. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Stacey, K. J., Sweet, M. J., Hume, D. A. Macrophages ingest and are activated by bacterial DNA. Journal of immunology. 157 (5), 2116-2122 (1996).
- Jiang, W., Reich, I. C., Pisetsky, D. S. Mechanisms of activation of the RAW264.7 macrophage cell line by transfected mammalian DNA. Cell Immunol. 229 (1), 31-42 (2004).
- Jiang, W., Pisetsky, D. S. The induction of HMGB1 release from RAW 264.7 cells by transfected DNA. Mol Immunol. 45 (7), 2038-2046 (2008).
- Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-147 (2009).
- Cheung, S. T., So, E. Y., Chang, D., Ming-Lum, A., Mui, A. L. Interleukin-10 inhibits lipopolysaccharide induced miR-155 precursor stability and maturation. PLoS One. 8 (8), e71336 (2013).
- Weber, M., Moller, K., Welzeck, M., Schorr, J. Short technical reports. Effects of lipopolysaccharide on transfection efficiency in eukaryotic cells. Biotechniques. 19 (6), 930-940 (1995).
- Berghaus, L. J., et al. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 33 (5), 443-456 (2000).
- Fiszer-Kierzkowska, A., et al. Liposome-based DNA carriers may induce cellular stress response and change gene expression pattern in transfected cells. BMC Mol Biol. 12 (1), 27-36 (2011).
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (7), 617-626 (2009).
