Introduction
세포의 핵산의 형질 과학 연구에서 다양한 응용 프로그램을 가지고있다. 예로는 (1) 리포터 유전자, 유전자 발현의 다른 유전자 요소의 역할을 연구하기 위해 (2) 단백 발현 플라스미드 관심 단백질을 과발현, 및 (3) 작은 RNA 간섭하는 유전자 발현을 하향 조절하기 위해 포함된다. 특정 유전자의 발현 량을 조작하는 등의 조작 차동 효과를 측정함으로써, 연구자들은 선택된 생물학적 시스템에서 유전자 기능을 추론 할 수있다. 모든 형질 전환 방법은 동일한 형질 전환 효율을 제공하고, 심지어 같은 형질 전환 방법은 균등 한 모든 유형의 세포를 형질 감염되지 않는다. 따라서, 다른 형질 전환 방법은 인산 칼슘 법, DEAE 덱스 트란, 양이온 성 지질 형질 감염, 비 양이온 성 지질 - 폴리머 형질 감염, 전기 천공, 및 2,3- nucleofection 등이 개발되었다.
대식 세포로 형질은 ESPE입니다cially 어려운 의한 대 식세포 (메틸화) DNA (4) 파생 된 박테리아를 포함하여 이물질에 매우 민감 전문 식세포가 있다는 사실에. 외래 DNA의 도입은 사이토 카인과 산화 질소 (5, 6)의 생산을 유도하는 수신자 같은 수용체 9 (TLR9) 경로를 활성화합니다. 이 활성화 된 대 식세포는 연구자가 조사하고자하는 치료에 덜 반응 할 수있다.
우리 연구소는 정기적으로 루시퍼 라제 리포터 유전자와 RAW264.7 대식 세포주를 transfects, 우리는 배경보다 훨씬 높은 루시 페라 제 신호가 충분히 강력 프로토콜을 개발하지만, 대 식세포가 휴식 상태로 유지하기에 충분한 또한 부드러운했다. 형질 감염된 세포의 행동은 IκBζ (pGL3- IκBζ)의 프로모터 영역을 은닉 반딧불이 루시퍼 라제 - 리포터 유전자에 의해 평가 하였다. IκBζ 발현 박테리아 세포벽 성분의 립에 의해 상향 조절되고opolyssacharide (LPS) 7,8, 및 항 염증성 사이토 카인에 의해 하향 조절, 인터루킨 10 (IL-10) 8. 웰 중에서 형질의 변화를 고려하기 위해 정규화 상업적 레 닐라 루시퍼 라제 유전자 (예 phRL-TK)를 포함하는 제어 플라스미드 - 형질 공동. 설명 프로토콜은 DNA 플라스미드의 다양한 형질 타이밍, 형질 전환 시약의 종류, 형질 전환 시약의 플라스미드 DNA의 양을 포함한 파라미터뿐만 아니라 형질 전환 시약의 비율 테스트 후 최적화된다. 이 프로토콜에 포함 된 두 개의 형질 전환 시약 (1) 지질 계 형질 전환 시약 및 (2) 단백질 / 폴리아민 계 형질 감염 시약이다.
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Protocol
1. 플라스미드 DNA를 정제
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 maxiprep 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출합니다. TE 완충액 500 μL에 재현 탁 플라스미드 DNA.
- 클로로포름 : 페놀 수행 아밀 알코올 추출 및 이소프로판올 침전 세균 잔류 오염물을 제거 하였다. LPS의 존재는 형질 9 방해한다.
- 플라스미드 DNA (1, pH가 8 25 : 24), 15 초 동안 격렬하게 흔들어 이소 아밀 알코올 : 클로로포름 : 페놀의 500 μl를 추가합니다. 페놀은 피부에 심한 화상을 일으키는 심각한 손상이 될 때까지 화상 항상 생각되지 않도록 마취입니다. 흄 후드에서 이소 아밀 추출 및주의하십시오 : 클로로포름 : 페놀을 수행합니다.
- RT에서 5 분 동안 혼합물을 인큐베이션. 실온에서 10 분 동안 13,000 XG에 원심 분리기. 새로운 1.5 ml의 수집 관에 위 수상의 350 μl를 전송합니다.
- 하부 유기상을 포함하는 튜브에 TE 완충액 350 μl를 추가. 15 초 동안 격렬하게 흔들어. 실온에서 5 분 동안 13,000 XG에 원심 분리기. 같은 1.5 ml의 수집 관에 위 수상의 350 μl를 전송합니다.
- 3 M 아세트산 나트륨 (PH 5.2)의 70 μl를 넣고 잘 섞는다. 100 % 이소프로판올 700 μl를 추가합니다. 잘 혼합하고 실온에서 10 분을 품어. 10 minat 4 ℃에서 13,000 XG에 원심 분리기. 상층 액을 제거합니다.
- 펠렛에 75 % 에탄올 500 μl를 추가합니다. 소용돌이 샘플은 4 ℃에서 5 분 동안 5,000 XG에 혼합하고 원심 분리한다. 상층 액을 제거합니다. DNA는 펠렛입니다.
- 튜브의 캡을 열고 공기가 5 실온에서 펠렛을 건조 - 10 분. 펠렛은 반투명하게한다. DNA 펠렛을 재현 탁하는 TE 버퍼의 500 μl를 추가합니다. 50 ℃에서 열 - 10 분 동안 60 °의 C는 DNA 펠렛을 용해.
- 260 nm의 (A260) 및 분광계와 280 nm의 (A280)에서 흡광도를 측정한다. 50 NG / μL로 A260 값을 곱함으로써 DNA의 농도를 계산한다. calculatin 의한 DNA의 품질을 평가G A260 / A280 비율. 2.0 - 고품질의 DNA는 1.8 A260 / A280 비율을 제공해야합니다.
2. 세포 배양 및 시드
- DMEM에서 배양 된 RAW264.7 세포는 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 9 % 태아 송아지 혈청 (DMEM / 9 % FCS)으로 보충. 각 통과하는 동안, 파스퇴르 피펫을 사용하여 연속 피펫으로 판에서 세포를 분리. 통로는 세포 2 일마다, 1.5 씨앗 - 주식으로 10cm 조직 배양 처리 접시에 2 백만 세포를. 6 주 - 셀마다 5의 새로운 주식을 해동.
- 트랜 스펙 션 당일, DMEM / 9 % FCS 500 μL 부피의 24 웰 플레이트에 웰 당 200,000 세포를 시드. 37 ° C 배양기에서 4 시간 동안 세포를 품어.
- 형질 세포 중 지질 계 시약 (단계 3.1) 또는 단백질 / 폴리아민 계 시약 (스텝 3.2)과.
3. 형질
- 지질 기반 형질 :
- 형질 전환 reagen을 따뜻하게T는 어둠 속에서 실온까지. 무 혈청 배지와 DMEM / 9 % FCS에 37 ° C를 따뜻하게.
- 1.5 ML 튜브에서 무 혈청 배지의 플라스미드 DNA 0.5 μg의 50 μl를 추가합니다. 액체의 표면 아래에 피펫 팁과 형질 전환 시약의 2 μl를 추가합니다. 6 초 동안 소용돌이.
- 실온에서 30 분 동안 어두운 데에서 시약 / DNA 혼합물을 남기기.
- 30 분 동안 배양, 우물에서 미디어를 제거하고 각 웰에 신선한 DMEM / 9 % FCS 250 μl를 추가합니다.
- 30 분 후, 반응물 / DNA 혼합물에 DMEM / 9 % FCS 250 μl를 추가한다. 로 pipetting 아래로 잘 섞는다.
- 각 웰에 희석 된 혼합물의 300 μl를 추가합니다. 37 ℃, 5 % CO 2 배양기에서 4 시간 - 2 품어.
- 형질 전환 솔루션을 제거하고 DMEM / 9 % FCS 500 μl를 추가합니다. 세포 자극하기 전에 37 ℃, 5 % CO 2 배양기에서 48 시간 - 24 품어.
- 단백질 / 폴리아민 기반 형질 :
- 워밍업 무 혈청매체 및 37 ° C의 DMEM는 / 9 % FCS.
- 무 혈청 배지의 18.75 μL에 형질 전환 시약의 0.75 μl를 추가합니다. 소용돌이는 간단히 혼합한다. 5 분 동안 실온에서 인큐베이션. 희석 된 형질 전환 시약에 1 μg의 / μL DNA의 0.5 μl를 추가합니다. 실온에서 10 분 동안 인큐베이션.
- 10 분 배양 동안, 24- 웰 플레이트의 각 웰로부터 매체를 제거하고, 각 웰에 250 ㎕의 신선한 DMEM / 9 % FCS를 추가한다.
- 10 분 후, 반응물 / DNA 혼합물에 DMEM / 9 % FCS 250 μl를 추가한다.
- 우물에 희석 혼합물의 270 μl를 추가합니다. 4 시간 - 2, 37 ℃, 5 % CO 2 배양기에서 품어.
- 형질 전환 솔루션을 제거하고 DMEM / 9 % FCS 500 μl를 추가합니다. 37 ℃, 5 % CO 2 배양기에서 48 시간 - 24 품어.
4. 세포 자극과 루시 페라 제의 분석
- 신선한 DMEM / 9 % FCS의 잘 250 μL 미디어를 교체합니다.
- 50 LPS의 μL 또는 LPS + IL 추가우물에 원하는 농도 -10. 37 ℃, 5 % CO 2 배양기에 플레이트를 돌려줍니다. 6 시간 - 2 자극한다.
- , 흡인에 의해 자극 솔루션을 제거 얼음 차가운 PBS로 세척하고, 1X 수동 용해 버퍼 200 μl를 추가합니다. 실온에서 30 분 동안 바위. 긁고 1.5 ml의 튜브에 해물을 전송하고 4 ℃에서 10 분 동안 20,000 XG에 원심 분리하여 세포 파편을 제거합니다.
- 전송 제조 업체의 프로토콜에 따라 루시 페라 제 신호를 결정하기 위해 흰색, 분명 바닥 96 웰 플레이트에 분해물 (상층 액)의 40 μL.
- 전체 가시 광선 스펙트럼에 걸쳐 루미와 루시 페라 제 신호를 읽어보십시오.
5. 데이터 분석
- 각 우물에서 레 닐라 루시퍼의 값으로 반딧불 루시 페라 제의 개별 값을 나누어 레 닐라 비율 : 반딧불을 계산합니다.
- 에 의해 잘 치료의 레 닐라 비율 : 반딧불을 나누어 배의 변화를 계산치료 잘하는.
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Representative Results
그림 1은 RAW264.7에있는 두 개의 형질 전환 시약의 형질 전환 효율을 비교합니다. 단백질 / 폴리아민 계 형질 감염은 약 5 %의 효율 (도 1a)의 결과 동안 지질 계 시약은 통상적으로 약 25 %의 형질 도입 율을 주었다. 형질 감염 효율에 차이는 pGL3-IκBζ 프로모터 리포터 (도 1b)로 형질 RAW264.7 세포에서 루시페라아제 신호가 관찰되었다. 이러한 형질 감염된 세포에 LPS를 첨가 반딧불 루시 페라 제 신호, IκBζ 프로모터 기자의 증가 전사 활성의 직접적인 지시 증가했다. 즉, 결과는 LPS 이전보고와 일치 7,8 IκBζ 유전자의 발현을 상향 조절한다는 것을 제안했다. (2) 본 실험에서 얻어진 전형적인 결과를 보여주고, 예를 들어 지질 계 형질 감염을 사용. 인터넷에서 개별 신호 값을 얻은 후refly 루시페라아제 및 레 닐라 루시퍼 라제 (도 2a 및도 2b)은, 개똥 벌레 루시페라아제 신호 레 닐라 루시퍼 라제 신호 (도 2C)로 표준화했다. 정규화 인해 형질 전환 효율에 잘 - 투 - 잘 변화에 좋습니다. 처리 조건 (LPS 또는 LPS + IL-10) 반딧불 리포터 신호 변경 여부를 결정하기 위해 : 레 닐라 비율 (즉, 정규화 된 신호) 처리 군은 미처리 (자극되지 않은) 샘플 (도 2D와 비교 하였다 ). 우리의 데이타는 LPS로 처리 RAW264.7 세포를 LPS가 IκBζ 유전자의 전사 수준을 증가되었음을 나타내는 pGL3-IκBζ 프로모터 리포터의 활성을 상향 조절되는 것으로 나타났다. IL-10의 존재하에 IκBζ 프로모터 리포터는 IL-10 유전자의 IκBζ LPS 유도 전사를 억제 할 수 있었던 것을 암시 낮은 활성을 가졌다. 단백질 / 폴리아민 기반 형질 보통반딧불 루시 페라 제와 레 닐라 루시퍼 라제 신호 모두 낮은 값을 주었다. (3) 형질과 자극 (24 시간 또는 48 시간) 사이의 휴식 시간을 비교하고, 루시 페라 제 신호는 시간이 지남에 따라 감소 된 것을 보여줍니다. 지질 계 형질 감염 시약 (도 3A)을 이용한 경우의 신호의 감소는 데이터 해석을 방해하지 않았다; IL-10에 의한 LPS 및 억제에 의해 유도는 여전히 나머지 48 시간 후에 관찰되었다. 단백질 / 폴리아민 계 트랜 스펙 션 시약 (도 3b), 특히 레 닐라 루시퍼 라제 신호를 사용한 경우에는, 신호의 저하는 더욱 중요했다. 그 결과, 처리 군 간의 차이는 나머지 48 시간 후에 관찰되지 않았다.
세포 사멸의 정도에 각 형질 전환 방법의 영향을 평가 하였다되도록 형질 하나 원치 않는 효과는 세포 사망이다. 세포를 형질 감염 여부 및 넥신 V 및 프로피 듐 요오다 이드를 실시 하였다 (PI)염색. 이러한 세포 용 해물로부터 제조에도 그대로 절단하고 폴리 ADP 리보스 중합 효소 (PARP) 단백질의 존재에 대해 분석 하였다. 넥신 V / PI 염색 된 세포의 유세포 분석은 형질 감염되지 않은 세포에 비해 단백질 / 폴리아민 계 형질 감염은 (도 4a) 않는 동안 지질 계 형질 약간 넥신 V 양성 세포의 비율이 증가한다고 제안 . 마찬가지로, 단백질 / 폴리아민 기반 형질 (그림 4B)하지 않았지만 절단 PARP의 비율을 증가 약간 형질 전환 된 지질은 기반. 그러나, 세포 사멸 세포의 높은 숫자에도 불구하고, 광학 현미경으로 세포의 형태 (그림 4C)을 변경하지 않았다. 더욱 중요한 지질 계 형질 세포의 생물학적 반응은 형질 감염되지 않은 세포 (도 4d)과 동일 남았다. 세포 ^ IL-10 ± LPS 및 TNF의 양 자극 하였다5; 배양액으로 분비는 ELISA로 정량 하였다. 두 형질 감염되지 않은 지질 계 형질 감염된 세포는 LPS에 반응하여 TNFα의 유사한 양 만들었고 IL10의 첨가에 의해 억제되었다. 세포가 자극되지 않은 경우 어떤 TNFα는하지 않았다 (그림 4D)은 세포가 형질 전환 후 순진 남아 있음을 시사한다.
지질 기반 형질 1. 그림은 단백질 / 폴리아민 기반 형질보다 높은 형질 전환 효율을했다. (A) RAW264.7 세포 중 지질 - 기반 또는 단백질 / 폴리아민 계 형질 전환 시약과 GFP 발현 플라스미드를 형질 감염시켰다. GFP 신호는 계측법 24 시간 후에 흐름에 의해 측정 하였다. (B) RAW264.7 세포 pGL3-IkBζ 프로모터 리포터로 형질 감염시켰다. 48 시간 휴식, C 후ELL 학생은 6 시간 동안 LPS로 자극했다. 반딧불 루시 페라 제 신호가 제조업체의 지침에 따라 측정 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2의 전형적인 루시페라아제 분석 데이터. RAW264.7 세포 TK-및 레 닐라 IkBζ 프로모터 리포터로 형질 감염시켰다. 나머지 24 시간 후, 세포를 2 시간 동안 IL-10 ± LPS로 자극 하였다. (A) 반딧불 루시퍼 라제 및 (B) 레 닐라 루시퍼 라제 신호는 루시퍼 라제 분석을 제조자의 지시에 따라 측정 하였다. (C) 리포터 활성 TK-레 닐라 신호 정규화이었고 반딧불이 / 레 닐라 비율로서 플롯. (D)의 변화를 배량 나누어 계산반딧불 :. 자극되지 않은 샘플의 의해 자극 샘플의 레 닐라 비율 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
루시퍼 신호의 강도도 3은 시간에 의존한다. (A) 지질 계 형질 감염 및 (B) 단백질 / 폴리아민 계 형질 세포에 대한 쉬게했다 24 시간 또는 48 시간 전에 IL-10 ± LPS 자극에 어느 2 시간 동안. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
프로토콜은 전적으로 형질 감염 효율에 집중하지 않고 여기에서 설명하지만, 세포의 생리 학적 상태의 효율과 보존 사이의 균형을 유지하는 것을 목표로하고있다. 구체적으로, 우리의 방법은 형질 전환 시약의 독성을 최소화하고 루시페라아제 신호를 최대화하는데 성공.
프로토콜의 하나의 중요한 단계는 셀의 상태이다. 자란 배양 그들의 생리 변화하고, 또한 셀 (10)의 표현형 및 기능을 변경할 수 장시간 RAW264.7 세포의 연속 배양 등의 형질에 적합하지 않다. 낮은 통로 번호가 갓 해동 세포를 형질 전환을 위해 사용하는 것이 좋습니다.
또 다른 중요한 고려 사항은 형질 전환 시약의 선택입니다. 지질 기반 형질 전환 시약은 전형적으로 사용 및 상용화의 용이성에 연구에 사용됩니다. 그러나 이러한 시약 중 일부는 unintende 발생D (통상은 원하지 않는) 형질 감염된 세포를 11,12 글로벌 유전자 발현 변화. 이 문제를 해결하기 위해, 셀은 대신 전형적인 O / N의 몇 시간 동안 형질 전환 시약과 함께 배양되고, 또는 비 지질 계 시약은 형질 감염을 위해 선택된다. 형질 감염 시약으로 긴 배양 시간은 형질 전환 효율이 증가 할뿐만 아니라, 실험 설계를 방해 할 수있는 둘 세포 사멸 또는 세포 활성화를 야기하는 세포 하나에 유해 할 수있다. 단백질 / polyamine- 것을도 4a 및도 4b 쇼 피규어 기반 형질 형질 감염되지 않은 세포에 비해 세포 사멸 또는 괴사를 유발하지 않았다. 지질 계 형질 감염은, 심지어 짧은 배양 시간과, 세포 사멸의 높은 수준을 일으켰다. 이것은 지질 계 형질 전환 시약의 높은 트랜 스펙 션 효율에 상관된다. 형질 감염된 세포를 현미경으로 관찰 그러나, 주목할만한 형태 변화가 없었다S (그림 4C). 활성화 된 대 식세포는 일반적으로 거대한 모양을 채택,하지만 모두 형질 감염되지 않은 및 형질 감염된 세포는 그들의 휴식 상태에 있던 것을 나타내는, 자극 이전에 활성화의 조짐을 보이지 않았다. 또한, 형질 감염된 세포를 형질 감염되지 않은 세포 (도 4d)과 같은 LPS 자극 IL-10과 유사하게 반응했다. 이러한 관찰은 집합이 형질 전환 절차는 세포의 자연적인 행동을 변경하지 않는 것을 나타냅니다.
형질 전환 실험 처리 (휴식 시간) 사이의 시간도 중요하다. 충분한 시간을 표현하는 루시 페라 제 유전자와 그들의 휴식 상태를 다시 설정하는 세포 부여 할 필요가; 그러나, 긴 인큐베이션 형질 전환 효율이 높지 않을 때, 특히 루시퍼 라제 신호를 감소시킬 수있다.
여기서 절차는 연구실에서 사용되는 특정 루시퍼 라제 리포터 유전자에 적용된다. 약간의 조정은 옛 성은됩니다DED 다른 기자가 사용됩니다. 레 닐라 루시퍼 비율, 형질 전환 및 치료, 치료 조건 사이의 휴식 시간 : 테스트해야 매개 변수는 다른 반딧불의 루시 페라 제 기자를 포함한다. 50 : pGL3-IκBζ 1 비율 : phRL - TK는 일반적으로 사용되지만, 비율은 1의 범위 : 1 : 1-100. 그것은 세포의 형질 전환 솔루션의 제거 및 실험 치료의 시작 사이에 24 시간의 휴식이 가장 좋은 신호를 준 것으로 나타났습니다. 48 시간 후, 루시퍼 라제 신호는 감소하기 시작하고, 처리 군 간의 차이는 감소되거나 심지어 폐지 하였다.
설명 된 형질 전환 절차는 루시페라아제 리포터 분석법에 제한되지 않는다. 동질적인 인구를 필요로하지 않는 기타 실험 설계는 혜택을 될 것입니다; 예, 각각의 세포에서 관찰에 의존 형광 현미경. 한 가지 단점은 형질 감염되지 않은 대응 사이에서 성공적으로 형질 전환 된 세포를 찾을 수 있지만 것적은 시간과 노동 집약적 인 더 바람직 할 수 있다는 장점. 안정한 세포주가 바람직 경우, 우리는 프로토콜 안정한 세포주가 생성 될 때 실험 절차는 최적화 될 수있는 초기 실험의 평균을 제공한다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Life Technologies | K210007 | Any maxiprep kit will work |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Life Technologies | 15593-049 | Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container. |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30396.03 | Inactivated at 56 °C water bath for 45 min before use. |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Warm to at least room temperature before use. |
| XtremeGene HP DBA transfection reagent | Roche | 6366236001 | Warm to room temperature before use. |
| GeneJuice | EMD Millipore | 70967 | Warm to room temperature before use. |
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E1941 | 30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 |
References
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