ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
نحن هنا تصف طريقة لإلحاق رئيس مغلقة إصابات في الدماغ (TBI) في ذبابة الفاكهة. وهذه الطريقة توفر بوابة للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية التي تكمن وراء الأمراض المصرف التجاري العراقي باستخدام مجموعة واسعة من الأدوات والتقنيات التجريبية المتاحة للذباب.
Abstract
إصابات في الدماغ (TBI) يؤثر على الملايين من الناس كل عام، مما تسبب في انخفاض قيمة المادي والمعرفي، والوظائف السلوكية والموت. وقد ساهمت الدراسات التي تستخدم ذبابة الفاكهة اختراقات مهمة في فهم العمليات العصبية. وهكذا، وذلك بهدف فهم الأساس الخلوي والجزيئي للأمراض المصرف التجاري العراقي في البشر، قمنا بتطوير عالية التأثير صدمة (HIT) جهاز لإلحاق رئيس مغلقة TBI في الذباب. الذباب تتعرض للالظواهر شاشة الجهاز HIT تتفق مع TBI الإنسان مثل عجز مؤقت والتنكس العصبي التدريجي. يستخدم الجهاز HIT آلية القائم الربيع لدفع الذباب ضد جدار القارورة، تسبب التلف الميكانيكي للدماغ الذبابة. الجهاز غير مكلفة وسهلة لبناء وتشغيل لها بسيطة وسريعة، وأنها تنتج نتائج يمكن استنساخه. ونتيجة لذلك، فإن الجهاز HIT يمكن دمجها مع أدوات وتقنيات الذباب لمعالجة الأساسي التجريبية القائمةأسئلة حول TBI التي يمكن أن تؤدي إلى تطوير وسائل التشخيص والعلاج لTBI. على وجه الخصوص، الجهاز HIT يمكن أن تستخدم لأداء شاشات الوراثية على نطاق واسع لفهم الأساس الجيني للأمراض TBI.
Introduction
يتم تعريف إصابات في الدماغ (TBI) كما إصابة في الدماغ من قوة ميكانيكية الخارجية. الأكثر شيوعا، ونتائج المصرف التجاري العراقي من القوات الرأس المغلقة مثل قوات حادة وتسارع بالقصور الذاتي وقوات التباطؤ الذي تسبب في الدماغ لضرب داخل الجمجمة. في الولايات المتحدة، يقدر أن 50،000 الأفراد يموتون سنويا من TBI و2،5-6٬500٬000 الأفراد الذين يعيشون مع عواقب TBI، بما في ذلك المنهكة المادي والمعرفي، والمشاكل السلوكية 1،2. عواقب TBI هي ليس فقط بسبب الإصابات الميكانيكية الأولية إلى الدماغ ولكن أيضا إلى وقوع إصابات الخلوية والجزيئية الثانوية إلى الدماغ فضلا عن الأنسجة الأخرى التي تحدث على مر الزمن 3-5. وقد ثبت وضع نهج لتشخيص وعلاج TBI ليكون صعبا بسبب TBI هو عملية معقدة المرض. طبيعة متغيرة من الإصابات الأولية، علم وظائف الأعضاء البشرية، والعوامل البيئية نتائج في الاول الثانوي غير متجانسةnjuries والأمراض. وتشمل العوامل المتغيرة الأساسية شدة الإصابة الأولية، والوقت بين الإصابات المتكررة الابتدائية، والسن والتركيب الوراثي للفرد. فهم كيفية مساهمة كل عامل متغير إلى عواقب TBI غير المرجح أن يساعد في وضع نهج لتشخيص وعلاج TBI 6،7.
نحن هنا تصف طريقة لإلحاق رئيس مغلقة TBI في ذبابة الفاكهة (ذبابة الفاكهة) التي يمكن استخدامها لتحديد مساهمة العوامل المتغيرة لعواقب TBI. وتستند هذه الطريقة على الملاحظة الأولية التي تصل بشكل مكثف جانب قارورة ثقافة ذبابة ضد كف اليد الناجمة من النوع البري يطير لتصبح عاجزا مؤقتا، نتيجة محتملة للTBI. وبالتالي، فإننا شيدت الصدمة (HIT) جهاز تأثير كبير أن ألخص قوات التسارع والتباطؤ من الإجراءات التي اتخذت لضرب اليد. ويظهر الفيلم عالية السرعة التي بضربة واحدة منHIT يسبب جهاز الذباب في الاتصال جدار القارورة عدة مرات مع رئيس والجسم 8. إلى حد ما، من المحتمل أن تسبب في الدماغ يطير إلى الإرتداد وتشوه ضد كبسولة الرأس، على غرار ما يحدث للإنسان في السقوط وحوادث السيارات 9 كافة جهات الاتصال. وفقا لذلك، الذباب تعامل مع الظواهر شاشة الجهاز HIT تتفق مع إصابات الدماغ، بما في ذلك عجزا مؤقتا تليها ترنح، والانتعاش التدريجي للحراك، والتغيرات في التعبير الجيني في الرأس، والتنكس العصبي التدريجي في الدماغ 10. وبالتالي، يجعل الجهاز HIT من الممكن لدراسة TBI باستخدام ترسانة هائلة من الأدوات والتقنيات المتقدمة لالذباب التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. بناء على HIT الأجهزة
- إرفاق الربيع لمجلس باستخدام اثنين من المشابك وأربعة مسامير (الشكل 1A). توسيط المشابك النسبية لعرض لوحة وبعقب لهم حتى ضد بعضهم البعض مع تدفق المشبك الخارجي مع حافة الرقعة. قبل ربط المشابك، والانحناء لهم باستخدام كماشة لتناسب محكم خلال فصل الربيع.
ملاحظة: انظر الجدول رقم 1 لأوصاف المواد اللازمة لبناء الجهاز HIT. وينبغي أن تكون نهاية فرضت الربيع 1/8 بوصة (3.2 مم) من حافة الرقعة، ونهاية خالية ينبغي أن تمتد على المجلس من خلال 3/4 بوصة (19 مم). ضبط الربيع بحيث انها تقع بالتوازي مع طول اللوحة. - التفاف نهاية خالية من الربيع مرة واحدة حولها مع شريط لاصق من الحلقات الفيلكرو. يجب أن يكون الطرف الخارجي للحافة الفيلكرو مطاردة مع نهاية فصل الربيع. الفيلكرو مهم لأنه يستخدم لتأمين القارورة لفصل الربيع من قبل لجنة المساواة العرقيةأثناء التشغيل ضغط ضيقة. كما يسمح الفيلكرو اتصال سهلة وإزالة قارورة، مما يتيح العديد من قارورة بحيث تتم معالجتها في فترة قصيرة من الزمن.
- وضع غطاء دلو الجليد رأسا على عقب، تركز، مشددة على لوح خشبي. توجيه المنطقة رفعت الغطاء دلو الثلج بحيث الحافة الطويلة موازية للعرض اللوحة. نلاحظ أن المنطقة التي أثيرت من دلو الجليد 1/2 بوصة (13 مم) أعلى من لوح خشبي، بحيث عندما يتم إرفاق قارورة لربيع وربيع لا الاستلقاء على متن الطائرة.
- حرك الجهاز كله ضد كائن ثابت مثل جدار، حتى أن غطاء الجليد دلو تنحصر بين مجلس الإدارة والكائن ولا يتحرك.
- الشريط المنقلة ورقة في الجزء السفلي من الورق المقوى يطير علبة قنينة والوقوف على حافة مقابل طول اللوح بحيث يتم محاذاة علامة 90 درجة مع فصل الربيع عندما يتم سحبها مرة أخرى إلى الوضع الرأسي تماما.
2.تشغيل جهاز HIT
- في الفترة ما بين 1 و 60 CO 2 -anesthetized الذباب في قنينة فارغة وسدادة القنينة باستخدام القطن الكرة ضيقة.
- حصر الذباب إلى أسفل 1 بوصة (2.5 سم) من القارورة عن طريق دفع الكرة القطن في قارورة حتى يتم 1 بوصة (2.5 سم) من القاع. ومن المفيد لرسم خط على القارورة عند علامة 1 بوصة (2.5 سم). لاحظ أن حصر الذباب إلى مناطق أكبر أو أصغر من القارورة يمكن أن تؤثر على شدة الظواهر.
- الانتظار 5 دقائق لالذباب لاسترداد التنقل من CO 2. لاحظ أنه من غير المعروف ما إذا كانت 5 دقائق كافية تماما لإزالة آثار CO 2.
- إدراج نهاية الربيع في قارورة حتى الحافة الداخلية من الفيلكرو هو مطاردة مع الجزء العلوي من القنينة (الشكل 1B). عندما الربيع هو الاستلقاء، يجب أن 1 بوصة (2.5 سم) من القارورة تتداخل المنطقة رفعت الغطاء دلو الجليد. قارورة يمكن إعادة استخدامها مفي اي وقت.
- أثناء الجلوس، عقد القارورة في المنطقة الفيلكرو باستخدام الإبهام والسبابة من اليد اليسرى. عقد مجلس مشددة لالفوق باستخدام يدك اليمنى. بدلا من ذلك، استخدم C-المشابك لعقد مجلس مشددة لالفوق.
- سحب الربيع تماما مباشرة إلى زاوية المرجوة. الافراج عن الربيع. السماح الربيع للتوصل إلى وقف كامل.
- إزالة قارورة من فصل الربيع، والسماح للذباب لاستعادة ل≥5 دقيقة. إخضاع الذباب إلى إضراب آخر أو نقل الذباب إلى قارورة مع ذبابة الغذاء.
ملاحظة: مجموعة متنوعة من فحوصات يمكن استخدامها لتقييم آثار المظهرية لضربات من الجهاز HIT. على سبيل المثال، يمكن تحديد الآثار المترتبة على طول العمر من خلال تحليل المئة من الذباب التي تعيش في بعض الأحيان بعد الإصابة، يمكن تحديد آثارها على بنية الدماغ عن طريق التحليل النسيجي للرئيس، ويمكن تحديد الآثار المترتبة على التعبير الجيني عن طريق التحليل الكمي لمستويات مرنا 10. - Determinالآثار (ه) من الإجراء الذي لا بسبب الإضرابات عن طريق علاج مماثل الذباب التحكم التي لا تخضع للضربات. ارتداء حماية السمع بسبب تأثير القارورة ضد غطاء دلو الجليد تنتج ضوضاء عالية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ونحن مهتمون في فهم لماذا الذباب يموت بعد الإصابة الأولية في وقت قريب. لتحديد الموت، ونحن مصممون على مؤشر الوفيات في 24 ساعة (MI 24)، وهي النسبة المئوية من الذباب الذي توفي خلال 24 ساعة من الإصابة الأولية. وحضنت الذباب تعرض لضربات من الجهاز HIT عند 25 درجة مئوية في قارورة مع ذبابة الطعام، وكان يحسب عدد الذباب الميت بعد 24 ساعة. استخدمنا هذا النهج لتحديد العوامل التي تؤثر على MI 24، ووجدت أن MI 24 لا يتأثر عدد الذباب في قارورة (تم اختبار 10-60 الذباب)، والوقت بين الضربات المتكررة (تم اختباره 1-60 دقيقة )، أو جنس الذبابة 10. في المقابل، وجدنا أن العمر وقت الإصابة الأولية وراثى لم تؤثر على MI 24. وكان الذباب القديمة أعلى MI 24 من الذباب الأصغر سنا، وكان الذباب من المورثات مختلفة اختلافا كبيرا MI 24 ق.
في الشكل 2، نحن اختبار ما إذا كانت شدة الإصابة الأولية تؤثر على MI 24. لتغيير شدة الإصابة الأولية، ونحن نحيد الربيع لزوايا مختلفة. لكل زاوية، وتعرض قارورة إما 0-7 أو 20-27 يوم من العمر ث 1118 الذباب (سلالة مختبر قياسي) إلى أربع ضربات مع 5 دقائق بين الضربات. تم فحص ثلاث قوارير من 60 الذباب عن كل زاوية. تم نقل الذباب إلى قارورة مع دبس الغذاء وحضنت في 25 ° C، وأحصى عدد من الذباب الميت بعد 24 ساعة. تم حساب متوسط MI 24 ومعيار الخطأ من المتوسط لكل زاوية. وتكشف هذه البيانات التي زوايا أكبر من انحراف، أي. والإصابات الأولية أشد، يؤدي إلى أعلى MI 24 من زوايا أصغر من انحراف، أي، إصابات أقل شدة. وقد لوحظ ذلك بالنسبة لكل من الذباب القديمة 0-7 و20-27 يوما. وعلاوة على ذلك، بما يتوافق مع Katzenberger وآخرون 10، 20-27 يوم من العمر فلوريداكان المنشأ الذباب القديمة أعلى بكثير MI 24 من 0-7 اليوم في زوايا ≥50 درجة. وهكذا، وهذه البيانات تشير إلى أن في العصور المتعددة MI 24 يرتبط مع شدة الإصابة الأولية.
الشكل 1: رسم تخطيطي لجهاز HIT (A) رسم توضيحي للرأي العلوي من الجهاز HIT في وضع الراحة. (B) رسم توضيحي لعرض جانب الجهاز HIT. يظهر الربيع في موقف يستريح (الأحمر الداكن)، وتسديدة إلى 90 درجة (الضوء الأحمر).
الشكل 2: شدة الإصابة الأولية يرتبط مع MI 24 نحن مصممون على MI 24 ليوم 0-7 القديم ث
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويتميز أسلوب جهاز HIT من الطرق الأخرى التي تسبب الإصابة المؤلمة في الذباب من حقيقة أنه يسبب رئيس مغلقة بدلا من اختراق TBI 11. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة جهاز HIT يأخذ أقل الوقت والجهد والمهارة لإلحاق TBI في كثير من الذباب، لذلك فإن هذه الطريقة أكثر استعدادا من الأساليب الأخرى لشاشات الوراثية على نطاق واسع. وأخيرا، فإن حقيقة أن الإصابات الأولية من قبل الجهاز HIT حقت لا تقتصر على الدماغ على حد سواء والحد منها، وميزة. وهو الحد لأن هناك حاجة لدراسات إضافية لتقييم ما إذا الظواهر هي نتيجة لإصابة مؤلمة إلى الدماغ أو إلى أجزاء أخرى من الجسم. من ناحية أخرى، الإصابات المتعددة (صدمة مؤلمة لأجزاء الجسم متعددة) غالبا ما ترافق TBI ويعتقد أن تعدل الظواهر المصرف التجاري العراقي، وبالتالي فإن طريقة جهاز HIT يمكن استخدامها لتحقيق مساهمة الإصابات المتعددة إلى الظواهر المصرف التجاري العراقي. لديه نموذج الطيران TBI أيضا من المزايا أكثر من القوارض ونماذج المصرف التجاري العراقي الرئيسيات غير البشرية
يصف هذا البروتوكول على إنشاء وتشغيل الجهاز HIT، الذي يهدف إلى إلحاق رئيس مغلقة TBI في الذباب. وقد استخدمنا الجهاز HIT بالتزامن مع MI 24 </ دون> مقايسة لدراسة الموت العضوي التالية TBI 7. ومع ذلك، فإن نموذج TBI الذبابة يمكن استخدامها في العديد من الطرق الأخرى لفهم الموت، فضلا عن غيرها من عواقب TBI. على سبيل المثال، الآثار الجسدية للTBI يمكن قياسها باستخدام فحوصات لمعلمات مثل تسلق الجبال أو الطيران، والعواقب السلوكية للTBI يمكن قياسها باستخدام فحوصات لمعلمات مثل النوم والتعلم والذاكرة 10،12-14. يمكن تحديد تأثيرات هيكلية على الدماغ باستخدام تقنيات التصوير مثل المجهر المناعي والمجهر الإلكتروني النافذ. يمكن تحديد الآثار الجزيئية في الدماغ باستخدام فحوصات الجينومية مثل RNA وما يليها أو فحوصات البروتين مثل مطياف الكتلة. يمكن تحديد التأثيرات الجينية على الدماغ باستخدام أساليب مثل الشرطي ضربة قاضية الجينات وoverexpression. يمكن تحديد الآثار البيئية على عواقب TBI من خلال تغيير قبل أو بعد التعرض للإصابة المعلمات مثل درجة حرارة التحضين واتباع نظام غذائي أو المعلمات منالجهاز HIT مثل زاوية انحراف الربيع أو الوقت بين الضربات المتكررة. وأخيرا، فإن الجهاز HIT يمكن استخدامها لشاشات الوراثية على نطاق واسع لمعالجة المسائل الأساسية مثل لماذا عواقب TBI أسوأ في الأفراد الأكبر سنا من الأفراد الأصغر سنا وكذلك لشاشات المخدرات على نطاق واسع والتي يمكن استخدامها لتحديد العلاجات ل عواقب TBI.
عندما تستخدم بطريقة متناسقة، وجدنا أن الجهاز HIT تنتج الظواهر استنساخه بين التجارب المستقلة والمستخدمين. المعلمات التي يمكن أن تؤثر على التكاثر هي انشاء وتشغيل الجهاز HIT. الظواهر يمكن أن تتأثر بشكل كبير من التغييرات الصغيرة في الموقف من الغطاء دلو الجليد بالنسبة للمجلس، والموقف من الكرة القطن في قارورة الطاير، والموقف من قنينة بالنسبة للقطاع الفيلكرو. وعلاوة على ذلك، كما هو مبين في الشكل 2، الظواهر يمكن أن تتأثر بشكل كبير من التغييرات الصغيرة فيزاوية انحراف الربيع. وبالتالي، يجب مراقبة المستخدمين الجدد للجهاز HIT للتأكد من أن انشاء وتشغيل متطابقة إلى أن من المستخدمين الآخرين. نحن بشكل روتيني معايرة مستخدمين جدد من خلال وجود لهم تحديد MI 24 من 0-7 يوم القديم ث 1118 الذباب. وأخيرا، لا يحتاج الجهاز HIT أن تكون مطابقة للواحد هو موضح في البروتوكول. نتوقع أن معظم أجزاء الجهاز HIT يمكن تغييرها مع الحفاظ على القدرة على إلحاق TBI في الذباب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا أي تضارب في المصالح في الكشف عنها.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة، R01 AG033620 (BG) وروبرت دريبر التكنولوجيا والابتكار التمويل (شعبة النهوض بالمرأة).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zinc plated compression spring | The Hillman Group | 540189 | 9 7/8 inch (length, 2.2 cm), 15/16 inch (outer diameter, 2.4 cm), 0.12 inch (wire size, 0.3 cm) |
| Wooden board | 9 inch (length, 22.9 cm), 6.5 inch (width, 16.5 cm), 0.75 inch (height, 1.9 cm) | ||
| Clamps | Sigma Electrical Manufacturing Corporation | 49822 | 3.10 inch (length, 7.9 cm), 0.68 inch (width, 1.7 cm), 1.11 inch (height, 2.8 cm), EMT Two Hole Straps, click on type for 1 inch (2.5 cm) steel EMT conduit |
| Loop half of self-adhesive velcro | 3 inch (length, 7.6 cm), (3/4 inch width, 1.9 cm) | ||
| Polyurethane ice bucket cover | Fisher Scientific | 02-591-45 | 9 1/8 inch (length, 23.2 cm), 9 1/8 inch (width, 23.2 cm), 1 1/4 inch (height, 3.2 cm) |
| Plastic fly vials | Applied Scientific | AS-510 | 3 11/16 inch (height, 9.4 cm), 1 1/16 inch (inner diameter, 2.7 cm), 1 1/8 inch (outer diameter, 2.9 cm) |
| Large cotton balls | Fisher Scientific | 22-456-883 | |
| Paper protractor | 10 inch (diameter, 25.4 cm) |
References
- Harrison-Felix, C. L., Whiteneck, G. G., Jha, A., DeVivo, M. J., Hammond, F. M., Hart, D. M. Mortality over four decades after traumatic brain injury rehabilitation: A retrospective cohort study. Arch Phys Med Rehabil. 90, 1506-1513 (2009).
- Coronado, V. G., et al. Surveillance for traumatic brain injury-related deaths – United States. MMWR Surveill Summ. 60, 1-32 (1997).
- Masel, B., DeWitt, D. S. Traumatic brain injury: A disease process, not an event. J. Neurotrauma. 27, 1529-1540 (2010).
- Blennow, K., Hardy, J., Zetterberg, H. The neuropathology and neurobiology of traumatic brain injury. Neuron. 76, 886-899 (2012).
- Prins, M., Greco, T., Alexander, D., Giza, C. C. The pathophysiology of traumatic brain injury at a glance. Disease Models Mech. 6, 1307-1315 (2013).
- Menon, D. K. Unique challenges in clinical trails in traumatic brain injury. Crit Care Med. 37, S129-S135 (2009).
- Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M.
- Balsiger, Z., Leudkte, J., Mawer, S., Willey, M. HIT device high speed analysis. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=hkmCXwPacBQ (2014).
- Davceva, N., Janevska, V., Illevski, B., Petrushevska, G., Popeska, Z. The occurrence of acute subdural haematoma and diffuse axonal injury as two typical acceleration injuries. J Forensic Leg Med. 19, 480-484 (2012).
- Katzenberger, R. J., Loewen, C. A., Wassarman, D. R., Petersen, A. J., Ganetzky, B., Wassarman , D. A. A Drosophila. model of closed head traumatic brain injury. Proc Natl Acad Sci USA. 110, E4152-E4159 (2013).
- Fang, Y., Bonini, N. M. Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila .models of nerve injury. Annu Rev Cell Biol. 28, 575-597 (2012).
- Babcock, D. T., Ganetzky, B. An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila. J Vis Exp. (84), e51223 (2014).
- Tully, T., Preat, T., Boynton, S. C., Vecchio, M. D. Genetic dissection of consolidated memory in Drosophila. Cell. 79, 35-47 (1994).
- Andretic, R., Shaw, P. J. Essentials of sleep recordings in Drosophila.: moving beyond sleep time. Methods Enzymol. 393, 759-772 (2005).
Tags
علم الأعصاب، العدد 100،Erratum
Formal Correction: Erratum: A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila
Posted by JoVE Editors on 07/14/2015.
Citeable Link.
An author's name was corrected in the publication of A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila. The second to last author's was spelled incorrectly. It has been updated from:
Barry Ganetky
to:
Barry Ganetzky
