ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
כאן אנו מתארים שיטה לגרום פגיעת ראש סגור מוח הטראומתי (TBI) בדרוזופילה. שיטה זו מספקת שער לחקור את המנגנונים התאיים ומולקולריים העומדים בבסיס פתולוגיות TBI באמצעות המגוון הרחב של כלים וטכניקות ניסיוניים זמינים לזבובים.
Abstract
פגיעה מוחית טראומטית (TBI) משפיעה על מיליוני אנשים בכל שנה, גורמת לירידת ערך של פיזי, קוגניטיבית, ופונקציות התנהגותיות ומוות. מחקרים באמצעות תסיסנית תרמו פריצות דרך חשובות בהבנת תהליכי נוירולוגיות. לפיכך, במטרה להבין את הבסיס התאי ומולקולרי של מחלות TBI בבני אדם, שפיתחנו מכשיר הגבוה השפעת הטראומה (HIT) להסב את הראש סגור TBI בזבובים. זבובים נתון לפנוטיפים תצוגת מכשיר HIT בקנה אחד עם TBI אדם כגון נבצרות זמניות וניוון מוחיה מתקדם. מכשיר HIT משתמש במנגנון המבוסס על קפיץ כדי להניע את הזבובים על הקיר של בקבוקון, וגרם לנזק מכאני למוח הזבוב. המכשיר הוא זול וקל לבנייה, הפעלתו היא פשוטה ומהירה, והיא מייצרת תוצאות לשחזור. כתוצאה מכך, מכשיר HIT יכול להיות משולב עם כלים ניסיוניים קיימים וטכניקות לזבובים כדי לטפל בבסיסייםשאלות על TBI שיכול להוביל לפיתוח של כלי אבחון וטיפולים לTBI. בפרט, מכשיר HIT ניתן להשתמש כדי לבצע מסכי גנטיים בקנה מידה גדולה כדי להבין את הבסיס הגנטי של מחלות TBI.
Introduction
פגיעה מוחית טראומטית (TBI) מוגדרת כפגיעה במוח מכוח מכאני חיצוני. הנפוץ ביותר, תוצאות TBI מכוחות הראש סגורים כגון כוחות בוטים והאצת אינרציה וכוחות ההאטה שגורמים למוח להכות את החלק הפנימי של הגולגולת. בארצות הברית, ההערכה היא כי 50,000 אנשים מתים בכל שנה מTBI ו2.5-6,500,000 אנשים חיים עם ההשלכות של TBI, כוללים מתישים פיזי, קוגניטיבית, ובעיות התנהגות 1,2. ההשלכות של TBI הן לא רק עקב פציעות מכאניות עיקריות למוח, אלא גם לפציעות המשניות תאיות ומולקולריות למוח, כמו גם רקמות אחרות המתרחשות לאורך זמן 3-5. הפיתוח של גישות לאבחון וטיפול TBI הוכיח להיות קשה כי TBI הוא תהליך מחלה מורכב. הטבע המשתנה של פציעות עיקריות, פיזיולוגיה אנושית, וגורמים סביבתיים גורם לi המשנית הטרוגניתnjuries ופתולוגיות. גורמים משתנים בסיסי כוללים את חומרת הפגיעה הראשונית, זמן בין פציעות עיקריות החוזרות ונשנות, וגיל וגנוטיפ של הפרט. הבנה כיצד כל גורם משתנה תורם להשלכות של TBI עשויה לסייע בפיתוח של גישות לאבחון וטיפול TBI 6,7.
כאן אנו מתארים שיטה לגרימת TBI הראש הסגור בmelanogaster דרוזופילה (זבובי פירות), שניתן להשתמש כדי לשרטט את תרומתם של גורמים משתנים להשלכות של TBI. השיטה מבוססת על תצפית ראשונית שמאוד להכות את הצד של בקבוקון תרבות זבוב על כף יד שנגרמה פרא-סוג טס להופכים באופן זמני נכה, תוצאה סבירה של TBI. לפיכך, אנו נבנו מכשיר הטראומה (HIT), השפעה הגבוה לשחזר כוחות התאוצה וההאטה מהפעולה ביד להכות. סרט במהירות גבוהה מראה כי שביתה אחת מHIT מכשיר גורם זבובים ליצור קשר עם קיר הבקבוקון מספר פעמים עם הראש וגופם 8. במידה מסוימת, את כל אנשי הקשר עלולים לגרום למוח הזבוב ליתיר ולעוות נגד הקפסולה הראש, דומה למה שקורה לבני אדם בנפילות ותאונות דרכים 9. בהתאם לכך, זבובים שטופל בפנוטיפים תצוגת מכשיר HIT בקנה אחד עם פגיעה מוחית, כולל נבצרות זמניות ואחריו אטקסיה, התאוששות הדרגתית של ניידות, שינויי ביטוי גנים בראש, וניוון של מערכת עצבים מתקדמות במוח 10. לפיכך, מכשיר HIT מאפשר ללמוד TBI באמצעות הארסנל העצום של כלים וטכניקות שפותחו לזבובים ניסיוניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בנייה של מכשיר HIT
- צרף את האביב ללוח באמצעות שני מלחציים וארבעה ברגים (איור 1 א). מרכז את מהדק ביחס לרוחב הלוח ונוגח אותם אחד נגד השני עם סומק המהדק החיצוני עם הקצה של הלוח. לפני מצרף את מהדק, לכופף אותם באמצעות צבת שיתאים היטב על האביב.
הערה: ראה טבלת 1 לתיאורים של החומרים הנדרשים לבניית מכשיר HIT. הסוף מהודק של האביב צריך להיות 1/8 אינץ '(3.2 מ"מ) מקצה הלוח, ואת הקצה החופשי צריך להרחיב על הלוח על ידי 3/4 אינץ' (19 מ"מ). התאם את האביב, כך שהוא נמצא במקביל לאורכו של הלוח. - עטוף את הקצה החופשי של הקפיץ פעם אחת סביב עם רצועת הדבק של לולאות סקוטש. הקצה החיצוני של סקוטש צריך להיות מיושר עם סוף האביב. סקוטש הוא חשוב משום שהוא משמש כדי לאבטח את הבקבוקון למעיין על ידי creating הולם דחיסה חזק. סקוטש גם מאפשר חיבור קל וההסרה של בקבוקונים, המאפשר בקבוקונים רבים להיות מעובד בתקופה קצרה של זמן.
- הנח את כיסוי דלי הקרח הפוך, מרוכז, חזק נגד לוח העץ. כוון את האזור המורם של כיסוי דלי הקרח כך שהקצה הארוך מקביל לרוחב של הלוח. שים לב שהאזור שהועלה של דלי הקרח הוא 1/2 אינץ '(13 מ"מ) גבוה יותר מאשר לוח העץ, כך שכאשר בקבוקון מחובר לאביב האביב לא לשכב על הלוח.
- חלק את כל המכשיר נגד אובייקט קבוע כגון קיר, כך שכיסוי דלי הקרח תקוע בין הלוח והאובייקט ולא זז.
- קלטת מד זווית נייר לתחתית קרטון לטוס מגש בקבוקון ולסבול את זה על קצה נגד האורך של הלוח כך שהסימן 90 ° מיושר עם האביב כאשר הוא נסוג למצב אנכי בצורה מושלמת.
2.מבצע של מכשיר HIT
- מקום בין CO 1 ו -60 2 -anesthetized זבובים בבקבוקון ריק ופקק הבקבוקון באמצעות כדור צמר גפן הדוק.
- להגביל את הזבובים לאינץ 'התחתון 1 (2.5 סנטימטרים) של הבקבוקון על ידי לחיצה על כדור צמר גפן לתוך הבקבוקון עד שהוא 1 אינץ' (2.5 סנטימטרים) מהתחתית. זה מועיל למתוח קו על הבקבוקון בסימן 1 אינץ '(2.5 סנטימטרים). שים לב שמגביל זבובים לאזורים גדולים יותר או קטנים יותר של הבקבוקון יכול להשפיע על החומרה של פנוטיפים.
- חכה 5 דקות לזבובים להתאושש ניידות מCO 2. שים לב שזה לא ידוע אם 5 דקות מספיקות כדי להסיר את ההשפעות של CO 2 לחלוטין.
- הכנס את הקצה של האביב לתוך הבקבוקון עד הקצה הפנימי של סקוטש הוא מיושר עם החלק העליון של הבקבוקון (איור 1). כאשר באביב הוא שוכב, 1 אינץ '(2.5 סנטימטרים) של הבקבוקון צריך לחפוף את האזור המורם של כיסוי דלי קרח. ניתן לעשות שימוש חוזר בקבוקי מ 'כל זמנים.
- בעת שישב, להחזיק את הבקבוקון באזור סקוטש באמצעות האגודל והאצבע של יד שמאל. החזק את הלוח הדוק לbenchtop ביד הימין שלך. לחלופין, להשתמש C-מהדק להחזיק את הלוח ההדוק לbenchtop.
- משוך את האביב בצורה מושלמת ישר בחזרה לזווית הרצויה. שחרר את האביב. לאפשר האביב להגיע לעצירה מוחלטת.
- הסר את הבקבוקון מהמעיין ולאפשר הזבובים להתאושש במשך ≥5 דקות. להכפיף את הזבובים לשביתה נוספת או להעביר את הזבובים לבקבוקון עם אוכל לטוס.
הערה: מגוון רחב של מבחני יכול לשמש כדי להעריך את ההשפעות פנוטיפי של שביתות ממכשיר HIT. לדוגמא, השפעות על תוחלת חיים יכולות להיקבע על ידי ניתוח אחוזים מזבובים שלשרוד בזמנים לאחר פציעה, השפעות על מורפולוגיה המוח יכולות להיקבע על ידי ניתוח היסטולוגית של הראש, והשפעות על ביטוי גנים יכולות להיקבע על ידי ניתוח כמותי של רמות ה- mRNA 10. - Determinהשפעות אלקטרוניים של ההליך שאינן בשל שביתות על ידי זהה טיפול זבובי שליטה שאינם נתון לשביתות. ללבוש שמיעת הגנה מפני ההשפעה של הבקבוקון נגד כיסוי דלי הקרח מייצרת רעש חזק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנחנו מעוניינים להבין מדוע זבובים מתים זמן קצר לאחר פגיעה ראשונית. כדי לכמת מוות, קבענו מדד התמותה ב 24 שעות (MI 24), המהווה את האחוז של זבובים שמת בתוך 24 שעות של הפגיעה העיקרית. זבובים נתון לשביתות ממכשיר HIT הודגרו של 25 מעלות צלזיוס בבקבוקון עם אוכל לטוס, ומספר הזבובים המתים נספר לאחר 24 שעות. אנחנו השתמשנו בגישה זו כדי לזהות גורמים המשפיעים על 24 MI ומצאנו כי 24 MI אינו מושפע ממספר הזבובים בבקבוקון (10 עד 60 זבובים נבדקו), את הזמן בין שביתות חוזרות ונשנות (1 עד 60 דקות נבדקו ), או המין של הזבוב 10. לעומת זאת, מצאנו שגיל בעת הפגיעה הראשונית וגנוטיפ עשה משפיע על 24 MI. היו זבובים בוגרים 24 MI גבוה מזבובים צעירים, והיו לי זבובים של גנוטיפים שונים MI 24 זה שונה באופן משמעותי.
באיור 2, בדקנו אם חומרת הפגיעה העיקרית משפיעה על 24 MI. כדי לשנות את חומרת הפגיעה הראשונית, שהסטנו את האביב לזוויות שונות. עבור כל זווית, בקבוקונים של שני היום הישן w 1,118 זבובים (זן מעבדה סטנדרטי) או 0-7 20-27 נחשפו לארבע שביתות עם 5 דקות בין שביתות. שלושה בקבוקונים של 60 זבובים נבדקו לכל זווית. זבובים הועברו לצלוחיות עם מזון מולסה, טופחו על 25 מעלות צלזיוס, ואת מספר הזבובים המתים נספר לאחר 24 שעות. השגיאה הממוצעת 24 MI ותקן של הממוצע חושבה עבור כל זווית. נתונים אלה מראים כי זוויות גדולות יותר של סטייה, כלומר., פציעות עיקריות חמורות יותר, לגרום 24 MI גבוה מזוויות קטנות יותר של סטייה, כלומר., פציעות חמורות פחות. זה נצפה לשני זבובים הישנים 0-7 ו20-27 היום. יתר על כן, בהסכם עם אל Katzenberger et. 10 fl ישן 20-27 יום,היה לי ies ישנים זבובי MI הגבוה באופן משמעותי מאשר 24 יום 0-7 בזוויות ≥50 מעלות. לפיכך, נתונים אלה מצביעים על כך שבגילים מרובים 24 MI בקורלציה עם חומרת הפגיעה הראשונית.
איור תרשים של מכשיר HIT (א) לצפייה בחלק העליונה של המכשיר נפגע במצב המנוחה: איור 1.. איור (ב) למבט מהצד של מכשיר HIT. האביב מוצג במצב המנוחה (אדום כהה) והסיט עד 90 מעלות (אור אדום).
איור 2:. חומרת פציעה העיקרית בקורלציה עם 24 MI קבענו 24 MI ל0-7 יום ישן w
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת מכשיר HIT נבדל משיטות אחרות שתגרומנה לפגיעה טראומטית בזבובים על ידי כך שהיא גורמת לראש סגור ולא חודר 11 TBI. יתר על כן, שיטת מכשיר HIT לוקחת פחות זמן, מאמץ, מיומנות ולגרום TBI בזבובים רבים, ולכן השיטה היא נוחה יותר מאשר בשיטות אחרות למסכים גנטיים בקנה מידה גדולה. לבסוף, העובדה שהפציעות עיקריות שנגרמו על ידי מכשיר HIT אינן מוגבלות למוח הוא גם מגבלה ויתרון. זה הגבלה כי מחקרים נוספים נדרשים להעריך האם פנוטיפים הם עקב פציעה טראומטית למוח או לחלקים אחרים בגוף. מצד השני, polytrauma (פגיעה טראומטית לחלקי גוף שונים) לעתים קרובות מלווה TBI, והוא חשב לווסת פנוטיפים TBI, ולכן שיטת מכשיר HIT ניתן להשתמש כדי לחקור את התרומה של polytrauma לפנוטיפים TBI. מודל TBI הזבוב יש גם יתרונות על פני מכרסמים ודגמי TBI קופים שאינם בני אדם
פרוטוקול זה מתאר את ההקמה והפעלה של מכשיר HIT, שנועד לגרום TBI הראש הסגור בזבובים. אנחנו השתמשנו במכשיר HIT בשיתוף עם 24 MI </ Sub> assay ללמוד מות האורגניזם הבא 7 TBI. עם זאת, מודל TBI זבוב ניתן להשתמש בדרכים רבות אחרות כדי להבין מוות, כמו גם השלכות אחרות של TBI. לדוגמא, תוצאות פיזיות של TBI ניתן למדוד באמצעות מבחני לפרמטרים כגון טיפוס או טיסה, והשלכות התנהגות של TBI ניתן למדוד באמצעות מבחני לפרמטרים כגון שינה ולמידה וזיכרון 10,12-14. השפעות מבניות במוח ניתן לקבוע באמצעות שיטות הדמיה כגון מיקרוסקופיה immunofluorescence ומיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. תופעות מולקולריות במוח ניתן לקבוע באמצעות מבחני הגנומי כגון RNA-seq או מבחני proteomic כגון ספקטרומטר מסה. השפעות גנטיות על המוח ניתן לקבוע באמצעות גישות כגון מציאה גן מותנית וביטוי יתר. השפעות סביבתיות על ההשלכות של TBI יכולות להיקבע על ידי פרמטרים מראש או לאחר פציעה שונה כגון טמפרטורת דגירה ודיאטה או פרמטרים שלמכשיר HIT כגון זווית ההטיה האביב או הזמן בין שביתות חוזרות ונשנות. לבסוף, מכשיר HIT יכול לשמש למסכים גנטיים בקנה מידה גדולה כדי לענות על שאלות בסיסיות כגון מדוע ההשלכות של TBI הן גרועות באנשים מבוגרים יותר מאנשים צעירים, כמו גם למסכי סמים בקנה מידה גדולה שיכול לשמש לזיהוי טיפולים ל ההשלכות של TBI.
כאשר משתמש באופן עקבי, מצאנו כי מכשיר HIT מייצר פנוטיפים לשחזור בין ניסויים ומשתמשים עצמאיים. פרמטרים שיכולים להשפיע על שחזור הם ההגדרה והפעלה של מכשיר HIT. פנוטיפים יכולים להיות מושפעים באופן משמעותי על ידי שינויים קטנים בעמדה של דלי קרח הכיסוי ביחס ללוח, את עמדתו של כדור צמר גפן בבקבוקון הזבוב, ואת עמדתו של בקבוקון ביחס לרצועת סקוטש. יתר על כן, כפי שמוצג באיור 2, פנוטיפים יכולים להיות מושפעים באופן משמעותי על ידי שינויים קטנים בזווית של סטיית האביב. כך, משתמשים חדשים של מכשיר HIT צריכים להיות במעקב כדי לוודא שההגדרה והתפעול זהות לזה של משתמשים אחרים. אנחנו באופן שיגרתי לכייל משתמשים חדשים על ידי שיש להם לקבוע את MI 24 של 0-7 יום ישן w 1,118 זבובים. לבסוף, מכשיר HIT לא צריך להיות זהה לזה שתואר בפרוטוקול. אנו מצפים שרוב חלקי מכשיר HIT ניתן לשנות תוך שמירה על היכולת לגרום TBI בזבובים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו ניגוד עניינים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומי לבריאות מענק, R01 AG033620 (BG) ועל ידי רוברט דרייפר טכנולוגיה חדשנות מימון (דאו).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zinc plated compression spring | The Hillman Group | 540189 | 9 7/8 inch (length, 2.2 cm), 15/16 inch (outer diameter, 2.4 cm), 0.12 inch (wire size, 0.3 cm) |
| Wooden board | 9 inch (length, 22.9 cm), 6.5 inch (width, 16.5 cm), 0.75 inch (height, 1.9 cm) | ||
| Clamps | Sigma Electrical Manufacturing Corporation | 49822 | 3.10 inch (length, 7.9 cm), 0.68 inch (width, 1.7 cm), 1.11 inch (height, 2.8 cm), EMT Two Hole Straps, click on type for 1 inch (2.5 cm) steel EMT conduit |
| Loop half of self-adhesive velcro | 3 inch (length, 7.6 cm), (3/4 inch width, 1.9 cm) | ||
| Polyurethane ice bucket cover | Fisher Scientific | 02-591-45 | 9 1/8 inch (length, 23.2 cm), 9 1/8 inch (width, 23.2 cm), 1 1/4 inch (height, 3.2 cm) |
| Plastic fly vials | Applied Scientific | AS-510 | 3 11/16 inch (height, 9.4 cm), 1 1/16 inch (inner diameter, 2.7 cm), 1 1/8 inch (outer diameter, 2.9 cm) |
| Large cotton balls | Fisher Scientific | 22-456-883 | |
| Paper protractor | 10 inch (diameter, 25.4 cm) |
References
- Harrison-Felix, C. L., Whiteneck, G. G., Jha, A., DeVivo, M. J., Hammond, F. M., Hart, D. M. Mortality over four decades after traumatic brain injury rehabilitation: A retrospective cohort study. Arch Phys Med Rehabil. 90, 1506-1513 (2009).
- Coronado, V. G., et al. Surveillance for traumatic brain injury-related deaths – United States. MMWR Surveill Summ. 60, 1-32 (1997).
- Masel, B., DeWitt, D. S. Traumatic brain injury: A disease process, not an event. J. Neurotrauma. 27, 1529-1540 (2010).
- Blennow, K., Hardy, J., Zetterberg, H. The neuropathology and neurobiology of traumatic brain injury. Neuron. 76, 886-899 (2012).
- Prins, M., Greco, T., Alexander, D., Giza, C. C. The pathophysiology of traumatic brain injury at a glance. Disease Models Mech. 6, 1307-1315 (2013).
- Menon, D. K. Unique challenges in clinical trails in traumatic brain injury. Crit Care Med. 37, S129-S135 (2009).
- Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M.
- Balsiger, Z., Leudkte, J., Mawer, S., Willey, M. HIT device high speed analysis. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=hkmCXwPacBQ (2014).
- Davceva, N., Janevska, V., Illevski, B., Petrushevska, G., Popeska, Z. The occurrence of acute subdural haematoma and diffuse axonal injury as two typical acceleration injuries. J Forensic Leg Med. 19, 480-484 (2012).
- Katzenberger, R. J., Loewen, C. A., Wassarman, D. R., Petersen, A. J., Ganetzky, B., Wassarman , D. A. A Drosophila. model of closed head traumatic brain injury. Proc Natl Acad Sci USA. 110, E4152-E4159 (2013).
- Fang, Y., Bonini, N. M. Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila .models of nerve injury. Annu Rev Cell Biol. 28, 575-597 (2012).
- Babcock, D. T., Ganetzky, B. An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila. J Vis Exp. (84), e51223 (2014).
- Tully, T., Preat, T., Boynton, S. C., Vecchio, M. D. Genetic dissection of consolidated memory in Drosophila. Cell. 79, 35-47 (1994).
- Andretic, R., Shaw, P. J. Essentials of sleep recordings in Drosophila.: moving beyond sleep time. Methods Enzymol. 393, 759-772 (2005).
Tags
Neuroscience גיליון 100,Erratum
Formal Correction: Erratum: A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila
Posted by JoVE Editors on 07/14/2015.
Citeable Link.
An author's name was corrected in the publication of A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila. The second to last author's was spelled incorrectly. It has been updated from:
Barry Ganetky
to:
Barry Ganetzky
