Introduction
Medizinische Forschung immens aus dem Studium der sowohl menschliche Zelllinien und Tiermodellen profitiert. Zelllinien ermöglichen eine bessere Steuerung der Komponenten in einem System, sowie die Verwendung von Zellen aus dem richtigen Organismus. Arbeiten mit menschlichen Zellen, während repräsentativer, präsentiert eine drastisch vereinfacht Momentaufnahme der Mechanismen, die für die Gesundheit und Krankheit verantwortlich sein können, denn Zelllinien möglicherweise nicht die Auswirkungen von anderen Zellen, Stromazellen Komponenten und Organe, die Reaktionen 1 auswirken können rekapitulieren. Auf der anderen Seite, Tiermodelle, die aber nicht völlig genau bei der Wiedergabe menschlicher Erkrankungen und genetische Heterogenität bieten weitere Einsicht, indem für die Eingabe von ganzen Tiersystemen in den meisten Modellen 2,3.
Mängel beiseite, beide Methoden haben ihre Vorteile und ergänzen. Allerdings bleibt das Hauptziel, die menschliche Zellen und Organen, in einem vollen Körper, Multi-Organ-System zu studieren. Dementsprechend hat der translationalen Forschung taken große Fortschritte bei der Erleichterung der Untersuchung von menschlichen Organen und Geweben von Patienten extrahiert werden, um besser zu verstehen, die Mechanismen zugrunde liegenden Krankheit. Translationale Forschung bietet den Vorteil, das Studium der Folge der Behandlungen und Krankheiten in der gesamten Körper und in geeignete Zellen, wodurch das Beste aus beiden Welten zwischen Zell- und Tier Arbeiten 4.
Translationale Forschung ist auch nicht ohne Mängel. Geernteten Proben von menschlichen Patienten, bei der Entnahme aus dem Host sofort auf Ischämie und andere externe Faktoren, aus denen sie sonst geschützt unterzogen. Dies kann zu Stress-induzierten molekularen und genetischen Veränderungen führen und verursachen Verzerrungen bei der nachfolgenden Studien. Daher wurde viel Mühe in Gewinnung und Verarbeitung Gewebe durch strenge Methoden zur Organ- und Zellintegrität zu bewahren besten für nachgelagerten Studien 5 gesetzt. Wichtig ist, dass zukünftige Anwendungen eng bei der Auswahl von Methoden o berücksichtigt werdenf Verarbeitung menschlichen Proben, wie bestimmte Methoden können sich negativ auf zelluläre Komponenten und Signalwege bei der Sparsamkeit andere.
Für jede Forschung mit menschlichen Geweben, müssen Regulierungsfragen angesprochen werden. Nach den Tuskegee und Belmont Berichte gab es eine wachsende Akzeptanz der Tatsache, dass die biomedizinische Forschung wurde mit inhärenten Risiken häufig zu unvermeidbaren ethischen Dilemmata 6 verbunden. Das Bedürfnis nach nationalen Standards erkannt wurde und die Bundesregierung erstellt Institutional Review Boards (IRBs) als Mittel, um die Prinzipien der Belmont Bericht zu wahren (Achtung der Personen, Wohltätigkeit, Justiz).
IRB jeder Institution ist ein Ausschuss von Ärzten, Forschern und Mitgliedern der Gemeinschaft für den Schutz der Studienteilnehmer verantwortlich sind. Es erfordert, dass freiwillige Zustimmung aller Teilnehmer der biomedizinischen Forschung Studien erhalten werden kann, und dass diese Zustimmung in einer informierten Einwilligung fo dokumentiert werden rm. Die Einwilligungsprozess zielt darauf ab, eine angemessene Information an einen Teilnehmer bereitzustellen, so dass eine fundierte Entscheidung treffen können, ob oder nicht, in einer Studie aufnehmen, oder die Teilnahme fortsetzen werden. In diesem Zusammenhang muss die Einwilligungsdokument gute Lesbarkeit und sollte in der Sprache, die leicht von der Zielgruppe verstanden werden kann (6. bis 8. Klasse Leseniveau) geschrieben werden. Die Möglichkeit, Nötigung oder unzulässigen Beeinflussung minimiert werden müssen, und das Thema muss ausreichend Zeit gegeben, um die Teilnahme zu erwägen. Der Teilnehmer muss außerdem die Möglichkeit haben, ihr Recht auf Zustimmung zu irgendeinem Zeitpunkt während des Verlaufs der Studie ohne Strafe zurückziehen auszuüben. Freiwillige Einwilligung nach Aufklärung ist eine obligatorische Voraussetzung für die Teilnahme einer Person in der Forschung und es ist auch rechtswirksam 7.
Gemäß den Vorschriften für den Schutz der menschlichen Probanden 21 CFR 50.25 (/45cfr46.html">http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8), muss die Studienteilnehmer der Zweck der Untersuchung informiert werden, die Verfahren in der Forschung, Alternativen zur Teilnahme Alle erkennbaren Risiken und Beschwerden (einschließlich nicht nur zu Verletzungen, sondern auch psychologische, soziale oder wirtschaftliche Schaden, Beschwerden oder Unannehmlichkeiten), Nutzen der Forschung für die Gesellschaft und gegebenenfalls für den Einzelnen, wie lange das Thema wird erwartet, zu beteiligen, Person, die Antworten auf Ihre Fragen oder im Falle eines Forschungsbedingten Verletzungen oder Notfall, die Erklärung, dass die Teilnahme freiwillig zu kontaktieren und dass die Weigerung zur Teilnahme werden nicht in irgendwelche Folgen oder den Verlust von Leistungen wie einen Kompromiss in regelmäßigen klinischen Versorgung führen dass die Teilnehmer sonst berechtigt, als Ergebnis seiner / ihrer Diagnosen eine Erklärung über das Recht des Patienten auf Vertraulichkeit und Recht, von zurückzutreten erhalten, und schließlichdie Studie jederzeit ohne Folgen. Gewebeproben von Teilnehmern, die im Verlauf der Studie Einwilligung widerrufen sollte nicht angeschüttet werden und muss sofort verbraucht werden. Verzicht auf eines oder mehrere Elemente der Einwilligung kann von dem IRB für einige Forschungsprojekte, die in der Praxis nicht ohne eine Änderung der benötigten Elemente oder für Untersuchungen, bei denen erforderlichen Elemente sind nicht anwendbar getan werden konnte, erhalten werden. Muss darauf geachtet werden, um die Vertraulichkeit der Daten zu gewährleisten. Der Health Insurance Portability and Accountability Act (HIPAA) ist ein Bundesgesetz, das der Nutzung oder Offenlegung "geschützte Gesundheitsdaten" (PHI) ohne schriftliche Genehmigung von den Teilnehmern verhindert. PHI umfasst, ist jedoch nicht zu Gesundheitsinformationen übertragen lassen oder in irgendeiner Form oder Medium und enthält Felder, die verwendet werden könnten, um eine individuelle Identifizierung 9 begrenzt.
Durch diese Arbeit wollen wir das Protokoll, die während tissu befolgt werden müssen skizzierene Verarbeitung - einschließlich der Beschaffung und Lagerung und betonen, wie wichtig die folgenden strengen Richtlinien, um die Verzerrungen, die durch die Spannungen ein Gewebe, auf Extraktion unterworfen führen können, zu minimieren. Wir bemühen uns auch um eine kurze Übersicht über die nachgeschaltete Tests oder Analysen (Abbildung 1), die auf solchen Proben durchgeführt werden könnte, so dass Leser können eine qualifizierte Entscheidung über welche Assay (n) am besten ihren Bedürfnissen zu machen.
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Protocol
Ethik-Anweisung: Dieses Protokoll wird von der University of Texas MD Anderson Cancer Center genehmigt.
1. Probenbeschaffung
- Sammeln Forschung Gewebeproben von Tumorüberschuss und damit verbundene normale Gewebe 10-12. Lagern Sie die Proben auf nassem Eis, um Autolyse zu vermeiden.
- Senden Sie alle Gewebe, medizinische Geräte und Fremdkörper während eines chirurgischen Eingriffs an der Abteilung für Pathologie für notwendige Untersuchung entnommen, um eine pathologische Diagnose zu erleichtern.
- Griff Gewebe für die Forschung in Übereinstimmung mit den geltenden Forschung und Gewebebanken Richtlinien und Verfahren zugeordnet.
HINWEIS: Biospecimen Sammlung beinhaltet die Koordination der Pathologen, Pathologen Assistenten, histotechnologists und Gewebebeschaffungsspezialisten.
2. Pathologie Qualitätssicherung (QS)
- Vervollständigen und überprüfen Patientenakten als Früh QA Maßnahme und konsultieren Sie einen Pathologen zu Diagnose pa überprüfentienten Aufzeichnungen (Pathologie Berichten Gewebeschnitten, etc.) und Gewebeproben. Richter Gewebeproben auf morphologische Merkmale von Interesse, wie Prozentsatz der Tumor-Nekrose, Gewebetumor-Schnittstelle, etc. Dies ist in Übereinstimmung mit Biobanken Best Practices 10-12.
- Nach der ersten Überprüfung, führen regelmäßige Überprüfungen von Biobanken Daten und Forschungs Proben während der gesamten Dauer des Aufenthalts der Bioprobe.
- Link Ergebnisse und Anmerkungen von histopathologischen und weitere Untersuchungen zu den Proben und geben diese Daten an die Forscher über eine proprietäre Biobanken-Software-System.
HINWEIS: QA Prozesse gewährleistet die Integrität sowohl der klinischen und technischen Aspekte der Biobanken Operationen. - Führen genetischen und molekularen Tests, um zu überprüfen und zu charakterisieren, die Proben für die klinische Anwendung.
- Sammeln und Daten basierend auf Feedback von Forschern, die mit Hilfe wurden die Proben für Laborversuche zu analysieren. VerfolgenProben mittels Barcode-Technologie. Diese elektronische Tracking-System ist auch in biorespository Best Practices 10-12 befürwortet.
3. Proben / Gewebeverarbeitung
- So schnell wie möglich immer frische Gewebeproben auf nassem Eis und Prozess zu speichern, um die Änderungen, die durch Extraktion der Gewebeprobe aus seiner natürlichen Umgebung induzierten begrenzen. Prozess normalen tumor abgestimmt und Tumorgewebeproben separat um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.
HINWEIS: Basierend auf Forschungsprotokollen kann Bioprobe Verarbeitungs Sammlung von Proben in einem oder mehreren Medientypen beinhalten. - Vor Beginn des Prozesses, bereiten eine sterile Petrikulturschale, ein Skalpell, sowie eine Nadel oder Pinzette zur Gewebeverarbeitung. Stellen Sie sicher, dass Röhrchen wurden hergestellt, etikettiert und durchgeführt, um Zeit der Probenverarbeitung (Abbildung 2) zu begrenzen gelegt.
- Alle relevanten Gewebe Daten wie Patientenname, Anzahl, Behandlung, DatumChirurgie, und andere relevante Informationen, wie sie für das Studium geeignet sein, sollte in einem institutionellen Gewebedatenbank leicht zugänglich gemacht werden. Begrenzte Patientendaten sollten im Labor auf Papier oder in Tabellenform gehalten werden.
ANMERKUNG:. Nur zu sammeln, die für die Art der Forschung, nämlich Bioprobe Informationen biomedizinischen Grundlagenforschung, klinische Forschung, translationale Forschung, usw. Für krankheitsspezifischen Informationen, die Biobanken Mitarbeiter sollten Daten, die von der aktuellen Literatur für notwendig erachtet und Regierungsorganisationen zu sammeln sicherzustellen, die richtige Diagnose und sinnvolle Forschung. Dies umfasst, ist aber nicht an Tumororten und Cancer Staging Informationen. - Planen alle gewünschten nachfolgenden Experimenten im Voraus auf der Größe der Gewebeschnitte für jeden Typ der Analyse, sowie die Lage der Ausschnitte erforderlich zu entscheiden. Im Idealfall, wenn auch nicht möglich ist, alle Analysen sollten repräsentativ für die gesamte Gewebeschnitt, um die für die Gewebe heterogenei Konto seinty und Grenze Vorspannung der Downstream-Analysen. Legen Sie alle erforderlichen Produkte im Voraus, wie in Abbildung 2 dargestellt.
- Legen Sie die Gewebeprobe in der offenen Petrikulturschale, flach an der Oberfläche.
Hinweis: Lassen Sie nur autorisierte Biobanken Mitarbeiter identifiziert Proben handhaben und zu identifiziereGesundheitsDaten zu überprüfen. Die Ermittler sollten nur die Patientenkennungen wie von den unterzeichneten informierte Zustimmungen dürfen und wie durch den IRB regulierten Zugang. Alle Proben müssen ausreichend gekennzeichnet sein und sollte mindestens ein einzigartiges Gewebe Identifikationsnummer und Gewebetyp gehören. Sind keine PHI in den Etiketten gemäß HIPAA-Vorschriften. - Überprüfen Sie die Probe von allen Seiten, um ein besseres Verständnis ihrer Struktur und Dimensionen zu gewinnen. Pin der Probe auf den Boden der Schale mit der Nadel, und fahren Sie um das Gewebe entlang der größten und am besten Vertreter Achse halbieren.
- Schneiden Sie ein kleines Stück Gewebe und legen Sie sie in einem sterilen 1,5 ml microcentrifuge Rohr 1 ml RNA-Stabilisierungslösung enthält. Kann diese Probe auf Eis für den Rest des Verfahrens eingebracht und bei 4 ° C bis zum Gebrauch gelagert werden.
HINWEIS: Bei der Arbeit mit RNA, Schutzhandschuhe sollten immer getragen werden, und RNAse-freier Filterspitzen sollten verwendet werden, um die Chancen des Abbaus und RNA-Kontaminationen zu begrenzen. - Legen Sie eine offene und pre-markierten Biopsie-Kassette in den Deckel der Petrikulturschale. Schneiden Sie ein Stück Gewebe nicht dicker als 3 bis 5 mm und überträgt es auf der Kassette. Setzen Sie die Kassette in 10% neutral gepuffertem Formalin (NBF) für mindestens 72 Stunden. Übertragen Sie die Kassette in 70% Ethanol für langfristige Lagerung vor der Paraffineinbettung.
HINWEIS: Beschriftung von Kassetten sollten in Bleistift oder mit empfohlenen Marker als Verwendung von Xylol während der Verarbeitung sonst Etiketten zu löschen durchgeführt werden. - Schneiden Sie ein Stück Gewebe und legen Sie sie in einer Gewebeform. Bedecken Sie den Gewebeschnitt im optimalen Schneidtemperatur (OAT) Verbindung, und frieren Sie es sofortbei -20 ° C für Kryoschneiden. Dieser Gewebeschnitt kann bei -20 ° C, bis sie zur Kryoschneiden gespeichert werden.
- Schnitten eine oder mehrere Gewebestücke und übertragen sie in ein 50 ml Röhrchen mit MACS-Puffer (1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), 0,5% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)) für die nachfolgende Durchflusszytometrieanalyse . Für die Durchflusszytometrie können größere Proben zu bevorzugen sein, wie Zellen können während der Tumor Dissoziation, Zell Fixierung und Permeabilisierung verloren, wenn erforderlich. Allgemeiner kann dieser Abschnitt am Ende entnommen werden, sobald die noch andere Stücke verarbeitet wurden. Übrig gebliebenen kann repräsentativ Tumorprobe für die Durchflusszytometrie verwendet werden. Gegebenenfalls kann diese Röhrchen bei 4 ° CO gespeichert / N oder zur durchflusszytometrischen Färbung unmittelbar nach der Spaltung in eine Zellsuspension (siehe Schritt 4 - Durchflusszytometrischer Färbung) verwendet.
- Geschnitten restliche Gewebe in Stücke nicht größer als eine maximale Größe von 0,5 mm x 0,5 mm und sie auf kryogeneFläschchen für sofortige Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Diese Schnapp gefrorenen Proben kann verwendet werden für zukünftige Analysen und kollaborative Zwecke.
HINWEIS: Besondere Sorgfalt sollte beim Arbeiten mit flüssigem Stickstoff als direkten Kontakt können schwere Verletzungen verursachen genommen werden. Augen sollten mit Schutzbrille mit Seitenschutz oder mit einem Gesichtsschutz geschützt werden. Kryo-Handschuhe auch getragen werden, um von flüssigem Stickstoff Verbrennungen durch Spritzwasser und direkter Kontakt zu schützen. Handschuhe sollten richtig passen, aber locker genug sein sollte, um schnell mit flüssigem Stickstoff splash in sie entfernt werden.
4. Durchflusszytometrische Färbung
- Gewebehomogenisierung
- Vorbereitung Digestionsmedium mit DMEM (40 ml), DNase I (50 U / ml) und Kollagenase I (2 mg / ml). Platzieren frisch oder O / N-gespeicherten Tumor in MACS-Puffer in dem Deckel einer Petrischale, und tauchen mit Digestionsmedium.
HINWEIS:. Unterschiedliche Aufschlussmethoden existieren, die jeweils mit Vorteilen (zB Zelloberflächenprotein abpression, Lebensfähigkeit). Stellen Sie sicher, die richtige Methode für Ihr gewünschtes nachgeschalteten Anwendung haben. - Pin Tumor zum Boden der Schale mit einer Nadel und geschnitten von der Außenseite mit einem Skalpell zu zentrieren, bis der Tumor hat eine pastenartige Textur. Bringen Tumor Mischung in ein 50-ml-Tube, Dichtung und legen Sie in einem Plastikbeutel, um Lecks zu vermeiden. Überführungsrohr in einen Inkubator, und drehen bei 225 RPM, 37 ° C, 1 h.
- Filter Tumorzellsuspension durch ein 70 um Zellsieb. Zentrifuge Zellsuspension bei 250 × g, 4 ° C, 5 min. Resuspendieren Zellpellet in 1 ml FACS-Puffer (500 ml PBS, 1 ml 0,5 M Stamm EDTA, 10 ml FCS oder FBS).
- Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und resuspendieren in einer Konzentration von 1x10 & sup7; Zellen / ml. Transfer 100 ul pro Vertiefung (10 6 Zellen) in einer 96-Well-Rundbodenplatte für die Färbung.
- Vorbereitung Digestionsmedium mit DMEM (40 ml), DNase I (50 U / ml) und Kollagenase I (2 mg / ml). Platzieren frisch oder O / N-gespeicherten Tumor in MACS-Puffer in dem Deckel einer Petrischale, und tauchen mit Digestionsmedium.
- Lebensfähigkeit und Antikörper-Färbung
- Fügen Sie 200 ul der Lebensfähigkeit Fleckenlösung in jede Vertiefung und mischen. IncuBeize für 30 Minuten bei 4 ° C im Dunkeln. Spin down-Zellen bei 250 × g, 4 ° C, 5 min, und absaugen Überstand.
- In Antikörpermischung bei empfohlenen / titriert Konzentration (nach Hersteller) für die Oberflächenantigene in 200 ul FACS-Puffer. Inkubieren Zellen bei 4 ° C, 30 min, in der Dunkelheit. Spin down-Zellen bei 250 × g, 4 ° C, 5 min, und absaugen Überstand.
- Mit 200 ul FACS-Puffer waschen, Spin-down-Zellen bei 250 × g, 4 ° C, 5 min, und absaugen Überstand. Die Zellen in 200 ul FACS-Puffer, und fahren Sie Durchflusszytometer zur Erfassung und Analyse fließen.
HINWEIS: Bei der Durchführung der intrazellulären Durchflusszytometrie Färbung, führen Fixierung und Permeabilisierung Schritte und intrazelluläre Färbung zwischen den Schritten 4.2.2 und 4.2.3. Wenn die Durchführung Zytokin-Färbung sollte Zellen voraktivierten vorhergehenden Färbung wie empfohlen und ein Inhibitor der intrazellulären Proteintransport und Sekretion wie Monensin sollten bei der Aktivierung verwendet werdensicherzustellen Eigentums lösliche Faktoren. Fixierte Zellen können kurzfristige (eine Woche) bei 4 ° C im Dunkeln nach der Akquisition mit einem Durchflusszytometer gespeichert werden.
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Representative Results
Die Ergebnisse angezeigt unten zeigen Durchflusszytometrie Gating-Strategie für die breite Immun Phänotypisierung auf einem verarbeiteten Melanomtumor. Der Tag der Färbung wurde Gewebeprobe unter 225 RPM Dreh verdaut und homogenisiert mit Collagenase I und DNase I Inkubation für 60 min bei 37 ° C. Nach dem Verdau wurde die Zellsuspension durch ein 70 um Sieb filtriert, um Zelltrümmer zu beseitigen, und die Zellen wurden mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern Durchflusszytometrie für die Immunzelle Phänotypisierung gefärbt. Unten gezeigt (Figur 3) ist der Gating-Strategie und Färbung für mehrere Marker auf Gewebe gespeicherten O / N bei 4 ° C in MACS-Puffer. Wie gezeigt, Exemplare, wie beschrieben und gespeichert O / N im MACS-Puffer bei 4 ° C verarbeitet zeigen äußerst begrenzt Sterblichkeit. Darüber hinaus diese Zahl zeigt, dass Gewebeverarbeitung wie oben beschrieben, ermöglicht die Multi-Color breiten Phänotypisierung von Immunzelluntergruppen in Melanomtumoren.
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Abbildung 1. Die Analysen, die aus menschlichem Blut und Gewebeproben durchgeführt werden können. Übersicht von Assays, die folgende Verarbeitung durchgeführt werden können. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Einzelteile für die ordnungsgemäße Gewebeverarbeitung und Lagerung. Beispiel für Setup für Gewebeverarbeitung erforderlich. Gewebe kann in der Petri-Kulturschale (A) mit der Nadel und Skalpell zerschnitten werden. Repräsentative Gewebestücke anschließend dem Biopsiekassette (B), der somit zu einer NBF Behälter (C) für 3 Tage bei RT Fixierung übernommen werden soll. Ein weiteres Gewebestück soll in einem cryomold (D) in OCT Lösung vor b angeordnet und bedecktEing bei -20 ° C eingefroren. Ein großes Stück Gewebe sollte in ein 50 ml-Röhrchen (E) für die Durchflusszytometrie Färbung übertragen werden und kann bei 4 ° C in MACS-Puffer O / N gespeichert werden. Ein kleines Stück Gewebe sollte in ein 1,5-ml-Röhrchen mit RNA-Stabilisierungslösung (F) überführt und bei 4ºC bis zur RNA-Extraktion gelagert werden. Schließlich sollte übrig gebliebenen Gewebe in Stücke geschnitten und zu Kryoröhrchen (G) für die Schnapp Einfrieren in flüssigem Stickstoff und langfristige Speicherung übertragen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Durchflusszytometrische Gating-Strategie für die breite Immun Phänotypisierung. Beispiel für breite Immun Phänotypisierung Gating-Strategie mittels Durchflusszytometrie auf Melanomtumor gespeicherten O / N bei 4 °;. C in MACS-Puffer 13 Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Letztlich müssen die Verfahren zur Verarbeitung von durch die gewünschte Hypothese diktiert und erwarteten technischen Assays (Figur 1) ausgeführt werden kann. Der folgende Abschnitt dient als Überblick über potenzielle Assays, die auf solchen Gewebeschnitten durchgeführt werden können, zu beschreiben. Es ist keineswegs eine erschöpfende Übersicht, sondern soll Führungsprobenverarbeitungsmethoden und Wahl der Downstream-Assays mit der Beschreibung Techniken und Listing ihre Stärken und Schwächen zu helfen.
Durchflusszytometrie Färbung kann auf frisch sezierte Gewebeschnitten durchgeführt werden, oder Fragmente gespeichert O / N in MACS-Puffer bei 4 ° C. Durchflusszytometrie ermöglicht hochspezifische Phänotypisierung und Analyse von Zellpopulationen aus Gewebeproben extrahiert und ermöglicht Färbung von bis zu 17 Zelloberflächenmarker und intrazellulären Proteinen, Zytokinen und Proteasen in einer einzelnen Zelle. Darüber hinaus bestimmte Zytometern ermöglichen einzelne Zelle Vergrößerung, um festzustellen, localizatIonen von Proteinen innerhalb der Zelle und nicht nur Positivität und die Intensität von Signalen. Schließlich erlaubt Massen Cytometrie zur Quantifizierung von mehr als 35 Proteine in der gleichen Probe mit der Nachteil ist, dass Zellen müssen aufgeschlossen werden und kann daher nicht weiter gezüchtet werden, sortiert, oder insgesamt 14 analysiert. Diese Technik ermöglicht die Analyse von vielen Markern und Proteinen sowie detaillierte Charakterisierung in einer Einzelzellebene. Allerdings Fluss erfordert Zytometrie Gewebehomogenisierung und Verlust der Gewebearchitektur und muss auf frischem Gewebe durchgeführt, um Veränderungen in der Zell-Phänotyp zu minimieren. Wichtig ist, verzögert die Lagerung von Gewebe für die Durchflusszytometrie bestimmt sind, können Zellgehalt auswirken, da einige Zell-Untergruppen können anfälliger für Ischämie sein. Phosphoproteine kann auch schlecht von Flow-Zytometrie nachgewiesen werden, wenn die Verarbeitung Kinetik suboptimal 15.
Formalin-Fixierung und Paraffineinbettung (FFPE) von Geweben kann die beste Wahl für den Fall seinUnsicherheiten in Bezug auf zukünftige Analysen, weil es eine hohe Flexibilität in der Art der Tests, die durchgeführt werden können. Traditionell FFPE Abschnitte an einem Mikrotom in 5 um Abschnitte für die Immunhistochemie (IHC) oder Immunfluoreszenz (IF) Färbung geschnitten. Jedoch FFPE-Geweben sind gut konserviert sind, und können daher für verschiedene Zwecke verwendet werden. Tatsächlich Schneiden dicker Abschnitte von FFPE Blöcken ermöglicht sowohl DNA als auch RNA-Extraktion mit im Handel erhältlichen Kits, wie Reverse-Phase-Protein-Array (RPPA) -Analyse 16-18. Dementsprechend kann die Verarbeitung von Gewebeproben in FFPE den Vorteil der Erhöhung der Flexibilität sowie den Vorteil, die Gewebestruktur für die Immunfärbung und damit eine genauere in vivo artigen Darstellung von Gewebestrukturen und Zellpopulationen zu bieten. FFPE ermöglicht Gewebeschnitte über längere Zeiträume konserviert werden. Diese Technik hat jedoch einige Nachteile. Dünnschnitte für FFPE verwendet zu tunnicht zur Gewebe Heterogenität aus der sequenziellen Schnitten und Gewebeschnitten entfallen beginnen zu oxidieren, wenn der Umgebungsluft ausgesetzt, wodurch die RNA und DNA Qualität zu beeinträchtigen. Schließlich wird durch die Vernetzung, Co-Färbung von mehreren Proteinen durch IHC auf FFPE Abschnitten erfordert Optimierung.
Wenn Mikroskopie durch IHC oder IF gewünscht wird, ist die Verwendung eines OCT-Verbindung bevorzugt. Oktober gespeicherten Abschnitte müssen mit einem Kryotom, bevor sie auf Folien für IHC und IF gebracht und verwendet geschnitten werden. Oktober bewahrt Antigenität und minimiert Hintergrund und ist damit die optimale Technik für die Mikroskopie. Oktober erlaubt auch sofortige Einfrieren und Schneid Vergleich zu FFPE die mehrere Tage in NBF erfordert. Trotz dieser Vorteile ist Oktober in der Regel weniger stabil und weniger flexibel als FFPE weil nur IHC und IF können von Oktober-eingebetteten Gewebeschnitten durchgeführt werden.
In Bezug auf die RNA-Analyse wurden Proben bei 4 ° C in RNA-stabilisierenden Lösung verhärten gespeichert, wodurch bessere RNA eXtraction durch handelsüblichen Extraktions Kits und TRIzol, unter anderem. RNA-Extraktion ermöglicht Downstream-Analysen wie Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), um die Expression des transkribierten Genen, RNA-Sequenzanalyse zu quantifizieren und Breitspektrum-Analyse des modulierten Gene durch Mikroarray oder nano Analyse. Dementsprechend kann die RNA-Isolierung aus Geweben extrem High-Yield, indem sie umfangreiche Informationen über Genexpression und Signalwege durch Therapien und Krankheiten betroffen sein. Wichtig ist jedoch, RNA-Expression drastisch auf Gewebestruktur und Probenahme Größe variieren, sollte so besonders vorsichtig getroffen werden, um zu vermeiden Vorspann Analysen aufgrund von Probenahmestelle. Außerdem ist die Natur von RNA zeigt, dass dynamische Änderungen in den Expressionsniveaus können auftreten, also zusätzliche Ferner muß, um eine ordnungsgemäße Kinetik zu gewährleisten befolgt werden, um Gene und Signalwege von Interesse 19,20 untersuchen; Verarbeitung sollte nach Extraktion von RNA-Stabilisierung s begrenzt werdenlösung, um die Stabilität zu gewährleisten. Dementsprechend wird die Lagerung von komplementärer DNA (cDNA) mit erhöhter Stabilität gegenüber RNA bevorzugt (wenn entsprechend nachgeschaltete Analyse) 21. Schließlich, da RNA oft in Downstream-Analysen verstärkt, Minuten-Fraktionen verunreinigender Zellen können in großen Verzerrungen in erhaltenen Ergebnisse führen.
DNA-Analyse kann an zuvor schockgefroren Gewebeproben durchgeführt werden oder auf FFPE Gewebeschnitten. Diese Methoden erlauben nachfolgende ganze Exoms oder ganze Genom-Sequenzierung, zwei Techniken, die immense Versprechen durch Identifizierung von Mutationen und Polymorphismen, um das Ansprechen des Patienten und der Prognose in mehreren Krankheitszusammenhängen verbunden gezeigt haben. DNA-Extraktion kann ferner die Identifizierung der T-Zell und B-Zell-Rezeptor (TCR und BCR) in den Proben vorhandenen Sequenzen, um das Wissen in Bezug auf Antigenen und Immunantwort in der Therapie und Krankheits 20,21 erwerben. Im Vergleich zu RNA, DNA ist hochstabil einmal extrahiert jedoches berücksichtigt transkriptionalen und translationalen Regulation von Genen als auch post-translationale Modifikationen und Regelung 22 zu nehmen.
Protein kann direkt von Snap-Gefrierschnitten oder von FFPE-Proben, um die Western-Blot durchführen extrahiert werden analysiert, Co-Immunopräzipitation, um Protein-Interaktionen und Netzwerke zu identifizieren, sowie RPPA, ein High-Yield-Technik eine relative Quantifizierung der Hundert Proteine in einer einzigen Probe 23. Jedoch erlaubt diese Technik Identifizierung bekannter Proteine nur durch seine Anforderung spezifischer Antikörper. Wichtig ist, dass weitere posttranslationale Modifikation Analyse, wie zB Protein-Phosphorylierung, erfordert eine schnelle Verarbeitung von Gewebe aufgrund der Instabilität 15.
Snap-Einfrieren der Proben ist einfach und erfordert begrenzte Ressourcen. Es ermöglicht auch die langfristige Lagerung von Proben bei der Downstream-Analysen wurden noch nicht definiert wurde, außer in derBei der Durchflusszytometrie, die auf frische Proben durchgeführt werden müssen. Schockgefroren Proben können auch problemlos für die gemeinsame Zwecke genutzt werden.
Letztlich ist die Datenmenge, die aus einem einzigen Stück Gewebe extrahiert werden kann endlos. Es gibt kein universelles richtige Antwort auf die Assays sollten in jedem gegebenen Studie durchgeführt werden. Jeder Ermittler müssen daher sicherstellen, dass er / sie nimmt Berücksichtigung aller Hypothesen gewünschten Experimenten sowie verfügbaren Ressourcen vor der Rekrutierung von Patienten und Verarbeitung Gewebe, da dies einen dramatischen Einfluss auf die Gestaltung der Studien und die Antworten, die erhalten werden.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der philanthropischen Beiträge der John G. und Marie Stella Kenedy Memorial Foundation (Grants # 0727033) und dem Melanoma Research Alliance unterstützt. Die Autoren danken der University of Texas MD Anderson Cancer Center Institutional Tissue Bank (ITB) für die Koordinierung der Gewebeverteilung und Sammlung und die Erleichterung der translationalen Forschung, wie Dr. Ignacio Wistuba, Dr. Victor Prieto, dem MD Anderson Cancer Center Department of danken, sowie Pathologie und der Melanom-Mond-Schuss-Programm. Schließlich sind die Autoren danken allen Patienten und Familien, die von Melanom betroffen anzuerkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Needles | BD | 305167 | |
| Stainless steel disposable scalpels | Miltex | 4-410 | |
| Tissue culture dish | Corning | 353003 | |
| Biopsy Cassettes | Thermo Fisher | 58931 | |
| RNA-stabilizing solution | Ambion | AM7021 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Phenix | MAX-815 | |
| 50 ml tubes | Corning | 430290 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | StatLab Medical Products | 28600-5 | |
| Formalin Containers | Fisher Scientific | 23-032-059 | |
| Optimal cutting temperature solution (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura Finetek | 4557 | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Collagenase I | Roche | 11088793001 | |
| 70μm cell strainers | BD Bioscience | 352350 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3799 | |
| Live/Dead stain solution | Life Technologies | L34957 |
References
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