Introduction
Medisinsk forskning har hatt stor glede av å studere både humane cellelinjer og dyremodeller. Cellelinjer muliggjøre bedre styring av komponenter i et system, samt bruk av celler fra den riktige organismen. Arbeide med menneskeceller, mens mer representativt, presenterer en drastisk forenklet bilde av mekanismer som kan være ansvarlig for helse og sykdom, fordi cellelinjer ikke kan rekapitulere virkningen av andre celler, stromal komponenter, og organer som kan påvirke svarene en. På den annen side, dyremodeller, selv om ikke helt nøyaktig å reprodusere sykdom hos mennesker og genetisk heterogenitet, gir ytterligere innsikt ved at for tilførsel av hele dyresystemer i de fleste modeller 2,3.
Mangler side, begge metodene har sine fordeler og er komplementære. Men fortsatt er hovedmålet å studere menneskelige celler og organer, i en full body, multi-organ system. Følgelig har translasjonsforskning takno store fremskritt i å tilrettelegge studiet av menneskelige organer og vev hentet fra pasienter, for bedre å kunne forstå mekanismene bak sykdommen. Translasjonell forskning har fordelen av å studere resultatet av behandlinger og sykdommer i hele kroppen og i passende celler, og dermed gir det beste fra begge verdener mellom celle og dyr arbeidet fire.
Translasjonsforskning er heller ikke uten feil. Høstet prøver fra humane pasienter, etter fjerning fra verten, blir straks utsatt for ischemi og andre eksterne faktorer som de ellers ville være beskyttet. Dette kan resultere i stress-indusert molekylære og genetiske endringer, og føre til skjevhet i senere studier. Derfor har store anstrengelser blitt satt i utvinning og behandling av vev gjennom strenge metoder for å best bevare organ og celleintegritet for nedstrøms studier 5. Viktigere, må fremtidige søknader vurderes nøye ved valg av metoder?f behandlingen humane prøver, som visse metoder kan være skadelig for cellulære komponenter og signalveier mens sparsom andre.
For noen forskning som involverer menneskelig vev, må regulatoriske spørsmål tas opp. Etter Tuskegee og Belmont rapporter, var det en økende aksept for at biomedisinsk forskning var forbundet med risikoer som ofte resulterer i uunngåelige etiske dilemmaer 6. Behovet for nasjonale standarder ble gjenkjent, og den føderale regjeringen opprettet Institutional Review Boards (IRBs) som et middel for å opprettholde prinsippene i Belmont Report (Respekt for personer, velgjørenhet, Justice).
Enhver institusjonens IRB er en komité bestående av leger, forskere og medlemmer av lokalsamfunnet som er ansvarlig for å beskytte forskningsdeltakere. Det krever at frivillig samtykke innhentes fra alle deltakerne i biomedisinske forskningsstudier, og at dette samtykket dokumenteres i et informert samtykke fo rm. Informert samtykke prosessen tar sikte på å gi tilstrekkelig informasjon til en deltaker, slik at en avgjørelse kan gjøres om eller ikke å melde deg på et studium, eller å fortsette deltakelsen. I denne sammenheng må det informert samtykke dokumentet har god lesbarhet og skal være skrevet i et språk som lett kan forstås (6 th til 8 th klasse lesing nivå) av målgruppen. Muligheten for tvang eller utilbørlig påvirkning må minimeres, og motivet må gis god tid til å vurdere deltakelse. Deltakeren må også få lov til å utøve sin rett til å trekke tilbake samtykket når som helst i løpet av studiet uten straff. Frivillig informert samtykke er en obligatorisk forutsetning for et emne deltakelse i forskning, og det er også lovlig effektiv 7.
I henhold til de regler for beskyttelse av mennesker 21 CFR 50.25 (/45cfr46.html">http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8), må deltagerne bli informert om hensikten med forskningen, prosedyrer involvert i forskning, alternativer til deltakelse, alle forutsigbare risikoer og ubehag (herunder ikke bare fysiske skader, men også mulig psykologiske, sosiale eller økonomiske skader, ubehag eller ulempe), nytten av forskningen til samfunnet og muligens til den enkelte, lenge emnet er ventet å delta, kontaktperson for svar på spørsmål eller i tilfelle av en forskningsrelatert skade eller nødsituasjon, utsagn som indikerer at deltakelse er frivillig og at nektelse av å delta vil ikke resultere i noen konsekvenser eller tap av fordeler som et kompromiss i vanlig klinisk arbeid at deltakeren ellers er berettiget til å motta som et resultat av hans / hennes diagnoser, og til slutt en uttalelse om emnet rett til konfidensialitet og retten til å trekke seg frastudien når som helst uten noen konsekvenser. Vevsprøver fra deltakere som trekker seg samtykke i løpet av studien bør ikke banked og må straks oppbrukt. Fraskrivelse av ett eller flere elementer av informert samtykke kan innhentes fra IRB for noen forskningsprosjekter som ikke kan praktisk talt gjøres uten en endring av de nødvendige elementene eller for studier der nødvendige elementene er ikke aktuelt. Stor forsiktighet må tas for å sikre data konfidensialitet. Helseforsikring bærbarhet og Accountability Act (HIPAA) er en føderal lov som hindrer bruk eller utlevering "Protected Health Information" (PHI) uten skriftlig samtykke fra deltakerne. PHI omfatter, men er ikke begrenset til helse informasjon som overføres eller opprettholdt i en hvilken som helst form, og omfatter felter som kan brukes for å identifisere et individ 9.
Gjennom dette arbeidet har vi som mål å skissere protokollen som må følges under tissue bearbeiding - herunder anskaffelse, og lagring, og understreker viktigheten av å følge disse strenge retningslinjer for derved å minimalisere de skjevheter som kan oppstå på grunn av de påkjenninger et vev blir utsatt for ved ekstraksjon. Vi forsøker også å gi en kort oversikt over de nedstrøms analyser eller analyser (figur 1) som kan utføres på slike prøver, slik at leserne kan gjøre en kvalifisert vurdering av hva analysen (e) passer best til deres behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk uttalelse: Denne protokollen er godkjent av University of Texas MD Anderson Cancer Center.
1. Prøve Procurement
- Samle forskning vevsprøver fra overskudd tumor og relatert normalt vev 10-12. Oppbevar prøvene på våt is for å unngå autolyse.
- Send alle vev, medisinsk utstyr og fremmedlegemer fjernes under et kirurgisk inngrep til Avdeling for patologi for nødvendige undersøkelser for å tilrettelegge for en patologisk diagnose.
- Håndtak vev avsatt til forskning i samsvar med gjeldende forskning og vev bank politikk og prosedyrer.
MERK: Biospecimen samling innebærer koordinering av patologer, patologer 'assistenter, histotechnologists og vev anskaffelser spesialister.
2. Pathology Quality Assurance (QA)
- Fullføre og kontrollere pasientjournaler som en tidlig QA tiltak og oppsøke patolog en anmeldelse diagnostisk patient poster (patologi rapporter, vev lysbilder, etc.) og vevsprøver. Dommer vevsprøver på morfologiske egenskaper av interesse som andel av tumor, nekrose, vev-tumor grensesnitt, etc. Dette er i samsvar med biorepository beste praksis 10-12.
- Etter første gjennomgang, gjennomføre periodiske vurderinger av biorepository data og forskningsprøver under hele lengden på oppholdet av biospecimen.
- Link resultater og kommentarer fra histopatologiske og andre undersøkelser til prøvene og gi denne informasjonen til forskerne gjennom en egen biorepository programvaresystem.
MERK: QA prosesser sikre integriteten til både kliniske og tekniske aspektene ved biorepository operasjoner. - Utføre genetiske og molekylære tester for å verifisere og karakterisere prøvene for klinisk bruk.
- Samle inn og analysere data basert på tilbakemeldinger fra forskere som har brukt prøvene for laboratorieforsøk. Sporprøver ved hjelp av strekkode teknologi. Denne elektroniske sporingssystem er også argumentert i biorespository beste praksis 10-12.
3. Prøve / Tissue Processing
- Oppbevar alltid friske vevsprøver på våt is, og prosessen så raskt som mulig, for å begrense endringer indusert ved ekstraksjon av vevsprøve fra sitt naturlige miljø. Prosessen normal tumor-matchet og tumor vevsprøver separat for å unngå krysskontaminering.
MERK: Basert på forskningsprotokoller, kan biospecimen behandling bære samling av prøvene i en eller flere typer medier. - Før begynner prosessen, fremstille en steril petrikulturskål, en skalpell, samt en nål eller tang for vev behandling. Pass på at rørene er utarbeidet, merket og lagt ut for å begrense tiden av utvalgets behandling (figur 2).
- All relevant vev opplysninger som pasientnavn, nummer, behandling, dato forkirurgi, og annen relevant informasjon som kan være aktuelle for studien, bør gjøres lett tilgjengelig i en institusjonell vev database. Begrenset pasientinformasjon bør holdes i laboratoriet i papir eller regneark form.
MERK:. Bare samle biospecimen informasjon som er relevant til innholdet i forskningen nemlig grunnleggende biomedisinsk forskning, klinisk forskning, translasjonsforskning, etc. For sykdomsspesifikke informasjonen, skal biorepository ansatte samle data anses nødvendig av dagens litteratur og styrende organisasjoner til sikre riktig diagnose og meningsfull forskning. Dette inkluderer, men er ikke begrenset til tumor karakterer og kreft iscenesettelsen informasjon. - Planlegg alle ønskede påfølgende forsøkene på forhånd, for å bestemme størrelsen av vevssnitt som kreves for hver type analyse, samt plassering av excisions. Ideelt sett, selv om det er umulig, bør alle analysene være representativ for hele vevet delen for å ta hensyn til vev heterogeneiTy og grense skjevhet av nedstrøms analyser. Legg ut alle nødvendige elementer på forhånd som vist på figur 2.
- Plasser vevsprøve i åpen Petri kultur fatet, flate mot overflaten.
MERK: Tillat kun autorisert biorepository ansatte til å håndtere identifiserte prøver og en anmeldelse identifiserte helseopplysninger. Etterforskerne skal få tilgang til bare de pasient identifikatorer som tillates av de signerte informert samtykke og som reguleres av IRB. Alle prøver må være tilstrekkelig merket og bør inneholde minimum, et unikt vev identifikasjonsnummer og vevstype. Ikke ta noe PHI i etikettene, i samsvar med HIPAA forskrifter. - Inspisere prøven fra alle vinkler, for å få en bedre forståelse av dens struktur og dimensjoner. Pin prøven til bunnen av fatet med nålen, og fortsett å halvere vevet sammen sin største og beste representanten aksen.
- Skjær ut et lite stykke vev og legg den i en steril 1,5 ml microcentrifuge tube inneholder 1 ml av RNA-stabiliserende løsning. Denne prøven kan plasseres på is for resten av prosessen og lagret ved 4 ° C inntil behov.
MERK: Når du arbeider med RNA, hansker skal alltid brukes, og RNase-fritt filter tips bør brukes til å begrense sjansene for nedbrytning og RNA forurensning. - Legg ut en åpen og pre-merket biopsi kassett i lokket av petris dyrkningsskålen. Skjær ut et stykke av vevet ikke tykkere enn 3 til 5 mm og overføre den til kassetten. Plassere kassetten i 10% nøytral bufret formalin (NBF) i minimum 72 timer. Overføre kassett i 70% etanol for langtidslagring før parafin-embedding.
MERK: Merking av kassetter bør utføres med blyant eller med anbefalte markører som bruk av xylen under behandlingen vil ellers slette etiketter. - Skjær ut et stykke vev og legg den i en vev mold. Dekk vev delen i optimal skjæring temperatur (OCT) sammensatte, og fryse den umiddelbartved -20 ° C i cryosectioning. Dette vevet delen kan lagres ved -20 ° C til de er klare for cryosectioning.
- Skjær ut ett eller flere stykker av vev og overføre dem til et 50 ml rør inneholdende MACS-buffer (1 x fosfatbufret saltvann (PBS), 0,5% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM Etylendiamintetraeddiksyre (EDTA)) for etterfølgende flowcytometri analyse . For flowcytometri, kan det være å foretrekke større prøver som celler kan gå tapt under tumor disassosiasjon, cellefiksering og permeabilization når det er nødvendig. Vanligvis kan denne delen tas på slutten, har en gang alle andre stykker blitt behandlet. Left representative tumorprøve kan bli anvendt for strømningscytometri. Eventuelt kan dette rør lagres ved 4 ° CO / N eller brukes til strømningscytometrisk farging umiddelbart etter kutting inn i en cellesuspensjon (se Trinn 4 - Flowcytometriske farging).
- Skjær resten av vev i biter ikke større enn en maksimumsstørrelse på 0,5 mm x 0,5 mm og overføre dem til kryogeniskeampuller for umiddelbar frysing i flytende nitrogen. Disse hurtigfrosset prøver kan brukes for fremtidig analyse og samarbeidende formål.
MERK: Ekstra forsiktighet bør tas når du arbeider med flytende nitrogen som direkte kontakt kan forårsake alvorlig personskade. Øynene bør beskyttes med vernebriller med sidebeskyttelse eller med en ansiktsmaske. Kryogeniske hansker bør også brukes til å beskytte mot flytende nitrogen brannskader forårsaket av sprut og direkte kontakt. Hanskene bør passe på riktig måte, men være løs nok til å fjernes raskt bør flytende nitrogen sprut inn i dem.
4. Flowcytometriske Farging
- Tissue Homogenisering
- Forbered fordøyelse med DMEM medium (40 ml), DNase I (50 U / ml) og Kollagenase I (2 mg / ml). Plassere friske eller O / N-tumor som er lagret i MACS-buffer i lokket på en petriskål, og senk med fordøyelsen medium.
MERK:. Forskjellige metoder eksisterer fordøyelse med hver fordeler (dvs. celleoverflateprotein expression, levedyktighet). Kontroller at du har den riktige metoden for ønsket nedstrøms søknaden. - Pin tumor til bunnen av fatet med en nål, og kuttet fra utsiden for å sentrere med en skalpell, før svulsten har en lime-aktig struktur. Overfør tumor mix til en 50 ml tube, sel og plasser i en plastpose for å unngå lekkasjer. Overføre røret til en inkubator, og roterer ved 225 RPM, 37 ° C, 1 time.
- Filter tumor cellesuspensjon gjennom et 70μm celle sil. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 250 xg, 4 ° C, 5 min. Resuspender cellepelleten i 1 ml FACS-buffer (500 ml PBS, 1 ml 0,5 M EDTA, lager 10 ml FCS eller FBS).
- Cellene telles ved bruk av et hemocytometer og re-suspen ved en konsentrasjon på 1x10 7 celler / ml. Overføring 100 ul per brønn (10 6 celler) i en 96 brønn rundbunnet plate for farging.
- Forbered fordøyelse med DMEM medium (40 ml), DNase I (50 U / ml) og Kollagenase I (2 mg / ml). Plassere friske eller O / N-tumor som er lagret i MACS-buffer i lokket på en petriskål, og senk med fordøyelsen medium.
- Levedyktighet og antistoffarging
- Tilsett 200 ul av levedyktighet fargende oppløsning til hver brønn og bland. Incubate i 30 minutter, ved 4 ° C, i mørket. Spinn ned cellene ved 250 xg, 4 ° C, 5 min, og aspirer supernatant.
- Legg antistoff blandingen ved anbefalte / titrert konsentrasjon (som per produsent) for overflateantigener i 200 ul FACS buffer. Inkuber cellene ved 4 ° C, 30 min i mørket. Spinn ned cellene ved 250 xg, 4 ° C, 5 min, og aspirer supernatant.
- Vask med 200 ul FACS-buffer, spinne ned cellene ved 250 xg, 4 ° C, 5 min, og supernatanten aspireres. Suspender cellene i 200 mL av FACS buffer og fortsett til flowcytometer for innsamling og analyse.
MERK: Hvis du utfører intracellulær flowcytometri farging, utføre fiksering og permeabilization trinn og intracellulær farging mellom trinn 4.2.2 og 4.2.3. Dersom utfører cytokin farging, bør cellene være pre-aktivert foregående flekker som anbefalt, og en inhibitor av intracellulært protein transport og sekresjon såsom monensin bør brukes i løpet av aktiveringen tilsikre oppbevaring av løselige faktorer. Fikserte celler kan lagres kortvarig (en uke) ved 4 ° C i mørke forut for anskaffelse av et flowcytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene som vises nedenfor skildre flowcytometri gating strategi for bred immun fenotyping på en bearbeidet melanom svulst. Dagen for farving, ble vevsprøve spaltet og homogenisert med kollagenase I og DNase I inkubering i 60 min, ved 37 ° C under 225 RPM rotasjon. Etter fordøyelse, ble cellesuspensjonen filtrert gjennom en 70 mikrometer celle sil for å fjerne rusk og cellene ble farget med fluorescens-merket flowcytometri antistoffer for immunceller fenotyping. Vist nedenfor (figur 3) er gating strategi og farging for flere markører på vev lagret O / N ved 4 ° C i MACS buffer. Som vist, eksemplarer bearbeidet som beskrevet og oppbevares O / N i MACS-buffer ved 4 ° C viser svært begrenset dødelighet. Videre viser denne figur at behandlingen vev som beskrevet ovenfor tillater flerfarve bred fenotyping av immuncelleundergrupper i melanom tumorer.
s / ftp_upload / 53189 / 53189fig1.jpg "/>
Figur 1. Analyser som kan utføres fra humane blod og vevsprøver. Oversikt over analyser som kan utføres etter behandling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Elementer som kreves for riktig vev prosessering og lagring. Eksempel på oppsett for vev behandling. Vev kan bli dissekert i petrikulturskålen (A) med nålen og skalpell. Representative stykker av vev bør da bli overført til biopsikassett (B) som deretter overføres til en NBF beholder (C) for tre dagers fiksering ved romtemperatur. Et annet stykke vev bør plasseres i en cryomold (D) og dekket i oktober oppløsning før being fryses ved -20 ° C. Et stort stykke vev skal overføres til et 50 ml rør (E) for flowcytometri farging og kan lagres ved 4 ° C i MACS-buffer O / N. Et lite stykke vev skal overføres til et 1,5 ml rør med RNA-stabiliserende oppløsning (F) og lagret ved 4 ° C inntil RNA-ekstraksjon. Til slutt bør left vev kuttes i biter og overføres til cryotubes (G) for snap-fryse i flytende nitrogen og langtidslagring. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Strømningscytometrisk gating strategi for bred immun fenotyping. Eksempel på bred immun fenotyping gating strategi ved flowcytometri på melanom svulst lagret O / N ved 4 °C. I MACS buffer 13 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Til syvende og sist må metodene for behandling bli diktert av den ønskede hypotesen og forventet tekniske analyser som skal utføres (figur 1). Den følgende delen fungerer som en oversikt for å beskrive mulige analyser som kan utføres på slike vevssnitt. Det er på ingen måte en uttømmende oversikt, men er ment å bidra til å guide utvalgets behandling metoder og valg av nedstrøms analyser ved å beskrive teknikker og notering sine styrker og svakheter.
Flowcytometri flekker kan bli utført på fersk-dissekert vev seksjoner, eller fragmenter lagres O / N i MACS-buffer ved 4 ° C. Flowcytometri letter meget spesifikke fenotyping og analyse av cellepopulasjoner ekstrahert fra vevsprøver, og tillater farging av opp til 17 celleoverflatemarkører og intracellulære proteiner, cytokiner og proteaser i en enkelt celle. Videre er visse fotometere tillate enkel celle forstørrelse, for å bestemme localization av proteiner i cellen i stedet for utelukkende positivitet og intensitet av signaler. Til slutt, masse cytometry åpner for kvantifisering av mer enn 35 proteiner i samme prøve, med den ulempen er at cellene må lysert og kan derfor ikke være lengre kultivert, sortert, eller analysert som helhet 14. Denne teknikken gjør det mulig for analyse av mange markører og proteiner samt detaljert karakterisering ved en enkeltcelle-nivå. Imidlertid flowcytometri krever vev homogenisering og tap av vev-arkitektur og må utføres på friskt vev for å minimere endringer i celle-fenotype. Viktigere, forsinket lagring av vev beregnet for flowcytometri kan påvirke celleinnhold, som enkelte celle undergrupper kan være mer sårbare for iskemi. Fosfoproteiner kan også være dårlig detektert ved strømningscytometri hvis behandlingen kinetikk er suboptimal 15.
Formalinfiksering og parafin-embedding (FFPE) av vevssnitt kan være det beste valget i tilfelleusikkerhet om fremtidige analyser, fordi det gir stor fleksibilitet i de typer av analyser som kan utføres. Tradisjonelt er FFPE- seksjoner seksjonert på en mikrotom til 5 mikrometer seksjoner for immunhistokjemi (IHC) eller immunfluorescens (IF) farging. Imidlertid er FFPE- vev godt bevart, og kan derfor brukes til flere formål. Faktisk, skjæring tykkere seksjoner fra FFPE-blokker gjør det mulig for både DNA og RNA-ekstraksjon med kommersielt tilgjengelige sett, så vel som revers-fase protein array (RPPA) analyse 16-18. Følgelig kan prosess vevsprøver i FFPE tilbyr fordelen med økt fleksibilitet, samt fordelen av å opprettholde vevet struktur for farging, og derfor gir en mer nøyaktig in vivo avbildning av vev-lignende strukturer og cellepopulasjoner. FFPE tillater vevssnitt skal bevares i lengre perioder av gangen. Denne teknikken gjør det, men har noen ulemper. Tynne snitt brukes for FFPE gjøreikke står for vev heterogenitet fra sekvensielle kutt og vevssnitt begynne å oksydere når de utsettes for omgivende luft og derved hemme RNA og DNA-kvalitet. Til slutt, på grunn av tverrbinding, co-farging av flere proteiner ved IHC på FFPE seksjoner krever optimalisering.
Når mikros gjennom IHC eller IF er ønsket, er bruk av en oktober forbindelse foretrekke. OKT-lagrede seksjoner må kuttes med en cryotome før den ble plassert på lysbilder og brukes for IHC og IF. Oktober bevarer antigenevne og minimerer bakgrunn gjør det den optimale teknikken for mikroskopi. Oktober gir også umiddelbar frysing og skjæring i forhold til FFPE som krever flere dager i NBF. Til tross for disse fordelene, er oktober generelt mindre stabile og mindre fleksibelt enn FFPE fordi bare IHC og IF kan utføres fra OKT-vevssnitt.
Med hensyn til RNA analyse, prøvene lagret ved 4 ° C i RNA-stabiliserende løsning herde over tid, noe som gir bedre RNA extraction gjennom kommersielt tilgjengelige utvinning kits og TRIzol, blant andre. RNA utvinningsrett nedstrøms analyser som revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) for å kvantifisere ekspresjon av transkriberte gener, RNA-sekvensanalyse, og bredt spektrum analyse av modulerte gener ved microarray, eller nanoString analyse. Følgelig kan RNA isolert fra vev være svært høy avkastning, ved å gi omfattende informasjon om genekspresjon og trasé berørt av terapier og sykdommer. Viktigere er imidlertid RNA ekspresjon kan variere drastisk basert på vevet struktur og prøvetaking størrelse, bør det ekstra forsiktighet utvises for å unngå forspenning analyser på grunn av samplings sted. Videre natur RNA tyder på at dynamiske endringer i uttrykk nivåer kan forekomme, så ekstra forsiktighet bør også tas for å sikre riktige kinetikk er fulgt for å studere gener og stier i området 19,20; behandling bør begrenses følgende ekstraksjon av RNA-stabiliserende solution å sikre stabilitet. Følgelig er lagring av komplementært DNA (cDNA) for økt stabilitet foretrekkes det å RNA (hvis i samsvar med nedstrøms-analyse) 21. Til slutt, fordi RNA kan ofte bli forsterket i nedstrøms analyser, kan-minutters fraksjoner av kontaminerende celler resultere i store skjevheter i oppnådde resultater.
DNA-analyse kan utføres på tidligere snap-frosne vevsprøver, eller på FFPE vevssnitt. Disse metodene tillate påfølgende hele exome eller hele genomsekvensering, to teknikker som har vist enorme løftet gjennom identifisering av mutasjoner og polymorfismer knyttet til pasientrespons og prognose i flere sykdoms sammenhenger. DNA-ekstraksjon kan videre tillate identifikasjon av T-celle og B-celle-reseptor (TCR og BCR) sekvenser som er til stede i prøvene, for å skaffe seg kunnskap med hensyn til antigener og immunrespons i terapi og sykdom 20,21. Sammenlignet med RNA, DNA er svært stabil gang ekstrahert, menden ikke tar hensyn til transkripsjons- og translasjons-regulering av gener, samt post-translasjonelle modifiseringer og 22 regulering.
Protein kan ekstraheres direkte fra snap-frosne vevssnitt, eller fra FFPE-prøver for å utføre Western blot analyser, co-immunutfelling for å identifisere protein interaksjoner og nettverk, i tillegg til RPPA, et høyt utbytte teknikk tillater relativ kvantifisering av hundre proteiner i en enkelt prøve 23. Imidlertid gir denne teknikk identifiseringen av kjente proteiner bare gjennom kravet om spesifikke antistoffer. Viktigere, ytterligere post-translasjonell modifikasjon analyse, slik som protein fosforylering, krever rask behandling av vev på grunn av ustabilitet 15.
Snap-frysing av prøvene er enkel og krever begrensede ressurser. Den gjør det også langsiktig lagring av prøver når nedstrøms analyser ennå ikke er definert, bortsett fra ived flowcytometri, som må utføres på ferske prøvene. Snap-frosne prøver kan også enkelt deles for samarbeidsformål.
Til slutt, er den datamengde som kan tas ut fra et enkelt stykke av vevet endeløs. Det er ingen universell rett svar på hvilke analyser bør utføres i en gitt studie. Hver etterforskeren må derfor sørge for at han / hun tar hensyn til alle hypoteser, ønskede eksperimenter samt tilgjengelige ressurser før rekruttere pasienter og behandling av vev, da dette kan dramatisk påvirke utformingen av studiene, og svarene som er oppnådd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av de filantropiske bidrag fra John G. og Marie Stella Kenedy Memorial Foundation (Grant # 0727033) og Melanoma Forskning Alliance. Forfatterne ønsker å takke University of Texas MD Anderson Cancer Center Institutional Tissue Bank (ITB) for å koordinere vevsfordeling og innsamling og tilrettelegging translasjonell forskning, samt Dr. Ignacio Wistuba, Dr. Victor Prieto, MD Anderson Cancer Center Department of patologi og Melanoma Moon Shot Program. Til slutt, forfatterne ønsker å erkjenne alle pasienter og familier berørt av melanom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Needles | BD | 305167 | |
| Stainless steel disposable scalpels | Miltex | 4-410 | |
| Tissue culture dish | Corning | 353003 | |
| Biopsy Cassettes | Thermo Fisher | 58931 | |
| RNA-stabilizing solution | Ambion | AM7021 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Phenix | MAX-815 | |
| 50 ml tubes | Corning | 430290 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | StatLab Medical Products | 28600-5 | |
| Formalin Containers | Fisher Scientific | 23-032-059 | |
| Optimal cutting temperature solution (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura Finetek | 4557 | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Collagenase I | Roche | 11088793001 | |
| 70μm cell strainers | BD Bioscience | 352350 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3799 | |
| Live/Dead stain solution | Life Technologies | L34957 |
References
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Cell Biology. Fixing problems with cell lines. Science. 346, 1452-1453 (2014).
- van der Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies. , PLoS Med. 7, e1000245 (2010).
- McCabe, P. M., et al.
- Woolf, S. H. The meaning of translational research and why it matters. JAMA. 299, 211-213 (2008).
- Brockbank, K. G., Taylor, M. J. Tissue Preservation. Advances in Biopreservation. , 157-159 (2006).
- Bulmer, M. The ethics of social research. Researching social life. Gilbert, N. , Sage. London. 45-57 (2001).
- Penslar, R. L. IRB guidebook. , US Government Printing Office. (1993).
- Protection of human subjects. CFR Title 21 Section 50.25. , Food and Drug Administration. Available from: http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/CFRSearch.cfm?FR=50.25 (2011).
- HIPAA privacy rule and public health. Guidance from CDC and the US Department of Health and Human Services. , Centers for Disease Control and Prevention. Available from: http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su5201a1.htm (2003).
- MD Anderson Cancer Center Institutional Tissue Bank Standard Operating Procedures. 3, Institutional Tissue Bank. (2009).
- Collection, Storage, Retrieval and Distribution of Biological Materials for Research. , 3rd ed., International Society for Biological and Environmental Repositories. Available from: http://biorepository.uic.edu/Contact_Us_files/ISBERBestPractices3rdedition.pdf (2011).
- NCI Best Practices for Biospecimen Resources. , 2nd ed., Office of Biorepositories and Biospecimen Research. Available from: http://biospecimens.cancer.gov/bestpractices/2011-NCIbestpractices.pdf (2011).
- Ruffell, B., et al. Leukocyte composition of human breast cancer. Proc. of the Ntnl. Aca. of Sci. 109, 2796-2801 (2012).
- Shapiro, H. M. Practical flow cytometry. , John Wiley & Sons. (2005).
- Baker, A. F., et al. Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling. Clin. Cancer Res. 11, 4338-4340 (2005).
- Jacobs, S. Sample processing considerations for detecting copy number changes in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 1195-1202 (2012).
- Chung, J. -Y., et al. Factors in tissue handling and processing that impact RNA obtained from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J. Histochem. Cytochem. 56, 1033-1042 (2008).
- Guo, H., et al. An efficient procedure for protein extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues for reverse phase protein arrays. Proteome Sci. 10, 1477-5956 (2012).
- Feldman, A. L., et al. Advantages of mRNA amplification for microarray analysis. Biotechniques. 33, 906-914 (2002).
- Francino, O., et al. Advantages of real-time PCR assay for diagnosis and monitoring of canine leishmaniosis. Vet Parasitol. 137, 214-221 (2006).
- Grunberg-Manago, M. Messenger RNA stability and its role in control of gene expression in bacteria and phages. Annu. Rev. Genet. 33, 193-227 (1999).
- Lesnik, E. A., Freier, S. M. Relative thermodynamic stability of DNA, RNA, and DNA:RNA hybrid duplexes: relationship with base composition and structure. Biochemistry. 34, 10807-10815 (1995).
- MacBeath, G.
