Introduction
Медицинские исследования значительную пользу от изучения обеих клеточных линиях человека и животных моделях. Клеточные линии позволяют лучше регулировать компонентов в системе, а также использование клеток из соответствующим организмом. Работа с человеческими клетками, в то время как более представительным, представляет радикально упрощены снимок механизмов, которые могут быть ответственны за здоровье и болезни, потому что клеточные линии, возможно, не повторять воздействие других клеток, стромальных компонентов и органов, которые могут повлиять на ответы 1. С другой стороны, модели на животных, хотя и не совсем точно воспроизвести заболевание человека и генетическую гетерогенность, предлагают дальнейшее понимание, позволяя для ввода целых систем животных в большинстве моделей 2,3.
Недостатки в сторону, оба метода имеют свои преимущества и дополняют друг друга. Тем не менее, основная цель остается, чтобы изучить человеческие клетки и органы, в полном объеме тела, многопартийной системы органов. Соответственно, трансляционные исследования имеет Takан больших успехов в облегчая изучение органов и тканей человека, извлеченных из пациентов, для того, чтобы лучше понять механизмы основного заболевания. Поступательное исследование предлагает преимущество изучения результат лечения заболеваний и во всем теле и в соответствующих клетках, тем самым обеспечивая лучшее из обоих миров между клеток и животных работы 4.
Поступательное исследование также не без изъянов. Собранные образцы от пациентов человека, при удалении от хозяина, сразу же подвергается ишемии и других внешних факторов, из которых они будут иначе охраняемых. Это может привести к молекулярно-генетических изменений, вызванных стрессом, и вызвать смещение в последующих исследований. Таким образом, много усилий было вложено в добыче и переработке тканей с помощью строгих методов лучше сохранить орган и целостность клеток для последующих исследований 5. Важно отметить, что будущие приложения должны быть рассмотрены внимательно при выборе методов уплотнительныее обработки проб человека, а некоторые методы могут быть вредны для клеточных компонентов и сигнальных путей, щадя других.
Для любого исследований с участием человека тканей, регуляторные вопросы должны быть решены. После докладов Tuskegee и Белмонт, был растущее признание того факта, что биомедицинские исследования было связано с неотъемлемые риски часто приводит к неизбежным этических дилемм 6. Необходимость национальных стандартов была признана и федеральное правительство создало институциональные наблюдательные советы (IRBS) в качестве средства для отстаивания принципов Belmont Report (уважение к личности, благодеяния, справедливость).
IRB любое учреждение является комитет врачей, исследователей и членов сообщества, которые отвечают за обеспечение защиты участников исследования. Он требует, чтобы добровольное согласие быть получены от всех участников биомедицинских исследований, и что это согласие документально в информированного согласия FO гт. Информированный процесс согласия призван обеспечить адекватную информацию для участника, так что обоснованное решение может быть от того, чтобы не поступать в исследовании, или продолжать участие. В связи с этим, документ о согласии должны иметь хорошую читаемость и должны быть написаны на языке, который может быть легко понимаемой (6-го по 8-й этап обучения чтение) для целевой популяции. Возможность принуждения или ненадлежащего влияния должны быть сведены к минимуму, и предметом должно быть дано достаточно времени, чтобы рассмотреть вопрос об участии. Участник также должен иметь возможность осуществлять свое право отозвать согласие на любом этапе в ходе исследования без штрафа. Добровольное информированное согласие является обязательным предварительным условием для участия субъекта в исследовании, и это также юридическую силу 7.
В соответствии с правилами по защите прав субъектов 21 CFR 50.25 (/45cfr46.html">http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8), участники исследования должны быть проинформированы о целях исследования, процедуры, участвующих в исследовании, альтернативы участия, все прогнозируемые риски и неудобства (в том числе не только физической травмы, но и возможного психологического, социального или экономического ущерба, дискомфорт или неудобство), пособия исследования для общества и, возможно, к личности, продолжительность предметом, как ожидается, участие, контактное лицо для ответов на вопросы или в случае травмы исследований, связанных с или чрезвычайной ситуации, заявление о том, что участие является добровольным и что отказ от участия не приведет к каких-либо последствий или любой потери преимуществ, таких как компромисс в очередной медицинской помощи что участник в противном случае право на получение в результате его / ее диагнозов, и, наконец, заявление о праве субъекта на конфиденциальность и право на выход изисследование в любое время без каких-либо последствий. Образцы ткани из участников, которые аннулируют согласие в ходе исследования не следует рассчитывали и должны быть немедленно исчерпаны. Отказ от одного или более элементов информированного согласия, могут быть получены из IRB для некоторых научно-исследовательских проектов, которые не могут быть практически сделано без изменения до требуемых элементов или для исследований, где требуется элементы не применимы. Большое внимание должно быть принято, чтобы обеспечить конфиденциальность данных. Страховая Мобильность Здоровье и Акт об ответственности (HIPAA) является федеральный закон, который предотвращает использование или раскрытие "конфиденциальную медицинскую информацию" (PHI) без письменного согласия участников. PHI включает, но не ограничивается медицинской информации, передаваемой или сохраняемой в любой форме или средней и включает в себя поля, которые могут быть использованы для идентификации отдельного 9.
Благодаря этой работе, мы стремимся, чтобы наметить протокол, который следует соблюдать в процессе Tissuэлектронной обработки - в том числе закупки, хранение и подчеркивают важность следующие строгие правила таким образом, чтобы свести к минимуму отклонения, которые могут возникнуть в результате из-за стрессов ткани подверженного при экстракции. Мы также стремимся предоставить краткий обзор последующих анализов или анализов (рисунок 1), которые могут быть выполнены на таких образцов, так что читатели могут сделать квалифицированный суждение о каком анализе (ов) наилучшим образом отвечает их потребностям.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление по этике: Этот протокол утвержден в университете Техаса MD Anderson Cancer Center.
1. Образец закупок
- Сбор образцов тканей из исследования прибавочной опухоли и связанной с нормальной ткани 10-12. Храните образцы на льду, чтобы избежать автолиза.
- Отправить все ткани, медицинские приборы и инородных тел, снятые во время хирургической процедуры в отделении патологии для экспертизы, необходимой для того, чтобы облегчить патологическое диагноз.
- Ручка ткани, выделенной для исследований в соответствии с действующим исследований и ткани банковской политики и процедур.
ПРИМЕЧАНИЕ: Biospecimen коллекция включает в себя координацию патологоанатомов, патологоанатомы "помощники, histotechnologists и специалистов по закупкам тканей.
2. Патология качества (QA)
- Заполните и проверить записи пациентов в качестве меры раннего QA и обратитесь патологоанатома рассмотреть диагностическую годовыхtient записи (отчеты патология, тканевые горки, и т.д.) и образцы тканей. Образцы тканей судить по морфологическим характеристикам интерес, таких как процент опухоли, некроз, интерфейс ткани опухоли, и т.д. Это находится в соответствии с передовой практикой biorepository 10-12.
- После первоначального рассмотрения, проводить периодические обзоры данных biorepository и образцов научно-исследовательских течение всего срока пребывания в biospecimen в.
- Результаты Link и аннотации из гистологических и других исследований в образцах и обеспечить эти данные для исследователей благодаря собственной системе biorepository программного обеспечения.
ПРИМЕЧАНИЕ: процессы QA обеспечения целостности обеих клинических и технических аспектов biorepository операций. - Выполните генетические и молекулярные тесты для проверки и характеризуют образцы для клинического использования.
- Сбор и анализ данных на основе обратной связи от исследователей, которые были с использованием образцов для лабораторных экспериментов. ТрекОбразцы, использующие технологию штрих-кода. Эта электронная система слежения также выступал в biorespository лучших практик 10-12.
3. Образец / ткани Обработка
- Всегда хранить образцы свежей ткани на льду и процесс как можно быстрее, чтобы ограничить изменения, вызванные извлечения образца ткани от своей естественной среде. Процесс нормального опухоли соответствием и образцы опухолевой ткани отдельно, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
Примечание: по протоколам исследований, обработка biospecimen может включать сбор образцов в одном или нескольких видах носителей. - Перед началом процесса, подготовить стерильную чашку культуральной чашки скальпель, а также иглы или пинцета для обработки тканей. Убедитесь, что трубы были подготовлены, снабжены и выложил для того, чтобы ограничить время обработки образца (рис 2).
- Вся информация, ткани, такие как имя пациента, номер, лечения, датахирургия, и другой соответствующей информации, которая может потребоваться для изучения, должны быть сделаны легко доступными в базе данных институциональной ткани. Общество с ограниченной информации о пациенте должны быть проведены в лаборатории в виде бумаги или таблицы.
ПРИМЕЧАНИЕ:. Только собирать biospecimen информацию, относящуюся к природе исследовательской а именно, основной биомедицинских исследований, клинических исследований, трансляционные исследования, и т.д. Для получения информации по конкретной болезни, то biorepository персонал должен собрать данные будут сочтены необходимыми в современной литературе и регулирующие организации обеспечить правильный диагноз и значимое исследование. Это включает, но не ограничивается сортов опухоли и рак постановка информации. - План все необходимые последующих экспериментов заранее, чтобы принять решение о размере участков тканей, необходимых для каждого типа анализа, а также в качестве места купюр. В идеале, хотя невозможно, все анализы должны быть репрезентативными разделе всей ткани для того, чтобы учесть ткани heterogeneiти и ограничения смещения вниз по течению анализов. Выложите все необходимые элементы в заранее, как показано на рисунке 2.
- Поместите образец ткани на открытом Петри блюдо культуры, плоские к поверхности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разрешить разрешается только biorepository персонал для обработки выявленных образцов и рассмотреть выявленные данные о состоянии здоровья. Следователи должны иметь доступ только к тем идентификаторы пациентов, как разрешенные подписанных информированных согласий и, как регулируется IRB. Все образцы должны быть надлежащим образом маркированы и должны включать в себя как минимум, уникальный идентификационный номер и ткани ткани типа. Не включайте PHI в этикетках, в соответствии с правилами HIPAA. - Осмотрите образец со всех сторон, чтобы получить лучшее понимание его структуры и размеров. Прикрепите образец на дно сосуда с иглой, и приступить к пополам ткани вдоль его большой и лучший представитель оси.
- Вырежьте кусочек ткани и поместите его в стерильный 1,5 мл MICRocentrifuge пробирку, содержащую 1 мл РНК-стабилизирующий раствор. Этот образец может быть помещен на льду в течение оставшейся части процесса и хранили при 4 ° С до использования.
Примечание: При работе с РНК, перчатки должны всегда носить и РНКазы советы фильтр должен быть использован, чтобы ограничить возможности деградации и загрязнения РНК. - Вынимают открытой и предварительно меченных кассету биопсии в крышке культуральной чашке Петри. Вырежьте кусочек ткани не толще, чем 3 до 5 мм и перенести его на кассете. Поместите кассету в 10% формалин в нейтральном буфере (НСБ) в течение как минимум 72 часов. Перенести кассету в 70% этаноле в течение долгосрочного хранения до парафина-вложении.
ПРИМЕЧАНИЕ: Маркировка кассет следует проводить карандашом или с рекомендуемыми маркеров, как использование ксилола во время обработки в противном случае стереть надписи. - Вырежьте кусочек ткани и поместите его в ткани формы. Покрыть ткань в оптимальной температуры резки (ОКТ) соединения, и сразу же заморозитьпри -20 ° С в течение cryosectioning. В этом разделе ткань не может храниться при температуре -20 ° С до готовности для cryosectioning.
- Вырезать один или несколько кусков ткани и передавать их на 50 мл пробирку, содержащую MACS буфера (1x забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), 0,5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА)) для последующего анализа потока цитометрии , Для проточной цитометрии, крупные образцы могут быть предпочтительнее, так как клетки, могут быть потеряны при диссоциации опухоли, фиксации клеток и проницаемости при необходимости. Вообще, в этом разделе, могут быть приняты в конце концов, один раз все другие части были обработаны. Остатки репрезентативный образец опухоли могут быть использованы для проточной цитометрии. При желании, эта трубка может храниться при температуре 4 ° CO / N или использоваться для окрашивания проточной цитометрии немедленно после переваривания в клеточной суспензии (см Шаг 4 - проточной цитометрии окрашивания).
- Вырезать оставшуюся ткань на куски размером не более максимального размера 0,5 мм х 0,5 мм и передавать их до криогенныхфлаконы для немедленного замораживания в жидком азоте. Эти быстро замораживали образцы могут быть использованы для будущих анализов и совместных целей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Особую осторожность следует соблюдать осторожность при работе с жидким азотом, как прямой контакт может привести к серьезным травмам. Глаза должны быть защищены предохранительными очками с боковыми щитками или с защитной маски. Криогенные перчатки должны также носить для защиты от ожогов жидкого азота, вызванных брызг и прямых контактов. Перчатки должны соответствовать должным образом, но достаточно свободно, чтобы быть удалены быстро должны всплеск жидкого азота в них.
4. Цитометрический Окрашивание
- Ткань Гомогенизация
- Подготовка пищеварения среду DMEM с (40 мл), ДНКазы I (50 ед / мл) и коллагеназы I (2 мг / мл). Поместите свежий или O / N-сохраненную опухоль в MACS буфера в крышке чашки Петри, и погрузить с пищеварением среды.
ПРИМЕЧАНИЕ:. Существуют различные методы пищеварения, каждый с преимуществами (т.е., белок клеточной поверхности эксPression, жизнеспособность). Убедитесь, что вы есть правильный метод для нужной вашего нижнего применения. - Контакт опухоли на дно сосуда с иглой, и сократить извне к центру со скальпелем, пока опухоль не имеет пастообразную консистенцию. Перевести сочетание опухоли к 50 мл трубки, уплотнения и места в полиэтиленовый пакет, чтобы избежать утечек. Передача трубки инкубаторе, и вращаются на 225 оборотов в минуту, 37 ° С, 1 ч.
- Фильтр подвески опухолевых клеток через 70 мкм ячейки фильтра. Центрифуга клеточной суспензии при 250 мкг, 4 ° С, 5 мин. Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл FACS буфера (500 мл PBS, 1 мл 0,5 М ЭДТА фондовой, 10 мл FCS или FBS).
- Граф клеток с помощью гемоцитометра и повторно приостанавливать в концентрации 1х10 7 клеток / мл. Передача 100 мкл на лунку (10 клеток) 6 в 96-луночных круглодонных пластины для окрашивания.
- Подготовка пищеварения среду DMEM с (40 мл), ДНКазы I (50 ед / мл) и коллагеназы I (2 мг / мл). Поместите свежий или O / N-сохраненную опухоль в MACS буфера в крышке чашки Петри, и погрузить с пищеварением среды.
- Жизнеспособность и антител Окрашивание
- Добавить 200 мкл жизнеспособность пятен раствора в каждую лунку и перемешать. INCUБАТЭ в течение 30 минут, при 4 ° С, в темноте. Спин вниз клетки при 250 мкг, 4 ° С, 5 мин, и супернатант аспирации.
- Добавить смесь антител при рекомендованной / титруемой концентрации (как на производителя) для поверхностных антигенов в 200 мкл FACS буфера. Инкубируйте клетки при 4 ° С, 30 мин, в темноте. Спин вниз клетки при 250 мкг, 4 ° С, 5 мин, и супернатант аспирации.
- Промыть 200 мкл FACS буфера, спин вниз клеток на 250 мкг, 4 ° С, 5 мин, и супернатант аспирации. Ресуспендируют клеток в 200 мкл FACS буфера и приступить к проточного цитометра для сбора и анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении окрашивания внутриклеточных проточной цитометрии, выполните фиксацию и шаги пермеабилизирующего и внутриклеточного окрашивания между шагами 4.2.2 и 4.2.3. При выполнении окрашивания цитокинов, клетки должны быть предварительно активирован предыдущий окрашивание, как рекомендовано, и ингибитор белка внутриклеточного транспорта и секреции, таких как монензина следует использовать во время активации вобеспечить сохранение растворимых факторов. Фиксированные клетки могут храниться краткосрочные (одна неделя) при 4 ° С в темноте до приобретения на проточном цитометре.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Отображаемые ниже результаты показывают стратегию цитометрии стробирования потока для широкого иммунной фенотипа на обрабатываемой опухоли меланомы. В день окрашивания, образец ткани расщепляли и гомогенизируют с коллагеназы I и ДНКазы I инкубации в течение 60 мин, при 37 ° С в 225 оборотов в минуту вращения. После расщепления, клеточную суспензию фильтровали через сито 70 мкм клетки для устранения мусора и клетки окрашивали флуоресцентно-меченного проточной цитометрии антител для иммунной фенотипа клеток. Ниже (рис 3) стратегия стробирования и окрашивание для нескольких маркеров на ткани хранится O / N при 4 ° С в буфере MACS. Как показано, образцы, обрабатывали, как описано и хранили O / N в MACS-буфере при 4 ° С показывают очень ограниченное смертности. Кроме того, эта цифра показывает, что обработка ткани, как описано выше, позволяет многоцветные широкое фенотипирование подмножеств иммунных клеток в опухоли меланомы.
S / ftp_upload / 53189 / 53189fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Анализ, который может быть выполнен как из крови и образцах ткани человека. Обзор анализов, которые могут быть выполнены следующую обработку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Элементы, необходимые для надлежащего обработки и хранения. Пример установки для обработки ткани ткани. Ткань может быть расчленена в культуральной чашке Петри (A) с иглой и скальпелем. Типичные кусочки ткани должны быть переданы в биопсии кассеты (B), которые затем должны быть переданы в НСБ контейнере (С) в течение трех дней при комнатной температуре фиксации. Другая часть ткани должны быть помещены в cryomold (D) и покрыты раствором ОКТ, прежде чем бEing замораживали при -20 ° С. Большой кусок ткани должны быть переданы в 50 мл пробирку (E) для проточной цитометрии окрашивания и может храниться при температуре 4 ° С в буфере MACS O / N. Небольшой кусочек ткани должны быть переданы в 1,5 мл пробирку с РНК-стабилизирующий раствор (F) и хранили при 4 ° С до экстракции РНК. Наконец, остатки ткани должны быть разрезаны на куски и переданы криопробирок (G) для оснастки замораживание в жидком азоте и долговременного хранения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. проточной цитометрии стратегия стробирования для широкого иммунной фенотипа. Пример широкой иммунной стратегии Фенотипирование стробирования с помощью проточной цитометрии на опухоль меланомы, хранящейся O / N при 4 °;. С в буфере MACS 13 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В конечном счете, методы обработки должны быть продиктован желаемого гипотезы и ожидалось технические анализы должны быть выполнены (рисунок 1). В следующем разделе служит обзором описания возможных анализов, которые могут быть выполнены на таких срезах тканей. Это не в коем случае не исчерпывающий обзор, но предназначен, чтобы помочь методы обработки образца и выбор вниз по течению анализов, описывая методы и указанием их сильные и слабые стороны.
Проточная цитометрия окрашивания могут быть выполнены на свежих срезах тканей расчлененный или фрагменты хранятся O / N в MACS-буфере при 4 ° С. Проточная цитометрия облегчает высокой специфической фенотипирования и анализ клеточных популяций, выделенных из образцов ткани, и позволяет окрашивание маркеров до 17 клеток поверхностных и внутриклеточных белков, цитокинов и протеаз в одной ячейке. Кроме того, некоторые цитометры позволяют увеличение одной клетки, чтобы определить, localizatион белков внутри клетки, а не только положительность и интенсивность сигналов. Наконец, масса цитометрии позволяет для количественной оценки более 35 белков в том же образце, с недостатком в том, что клетки должны быть лизируют и поэтому не могут быть дополнительно культивировали, сортируют, или анализировали в целом 14. Этот метод позволяет анализ многих маркеров и белков, а также подробную характеристику на уровне одной клетки. Тем не менее, проточной цитометрии требуется тканей гомогенизацию и утрата архитектуры ткани и должны быть выполнены на свежей ткани, чтобы минимизировать изменения в клеточного фенотипа. Важно отметить, что задержка хранение ткани, предназначенной для проточной цитометрии может повлиять содержание клеток, так как некоторые сотовые подмножества могут быть более уязвимы к ишемии. Фосфопротеинам также могут быть плохо обнаружить с помощью проточной цитометрии, если обработка кинетика неоптимальным 15.
Формалином и парафином фиксации-вложение (FFPE) срезов ткани может быть лучшим выбором в случаенеопределенность в отношении будущего анализов, потому что она позволяет высокую гибкость в типах анализов, которые могут быть выполнены. Традиционно, разделы FFPE подразделяются на микротоме в 5 мкм разделов для иммуногистохимии (IHC) или иммунофлюоресценции (ИФ) окрашивания. Тем не менее, FFPE ткани хорошо сохраняется, и, следовательно, могут быть использованы для различных целей. На самом деле, более толстые секции резки из FFPE блоков позволяет ДНК и РНК с извлечение коммерчески доступных наборов, а также массив с обращенной фазой белка (анализ) RPPA 16-18. Соответственно, образцы обработки ткани в FFPE может предложить преимущества дополнительной гибкости, а также то преимущество, что поддержание структуры тканей для иммунологического окрашивания и, следовательно, обеспечивает более точное в естественных -подобных изображением тканевых структур и клеточных популяций. FFPE позволяет срезы ткани должны быть сохранены в течение длительного периода времени. Эта методика, тем не менее, имеют некоторые недостатки. Тонкие срезы, используемые для FFPE сделатьне учитывает неоднородность ткани с последовательными разрезов и сечений тканей начинают окисляться при воздействии окружающего воздуха, тем самым ухудшая РНК и ДНК качество. Наконец, из-за сшивки, со-окрашивание нескольких белков IHC на FFPE секций требует оптимизации.
При микроскопии с помощью IHC или если требуется, использование соединения ОКТ является предпочтительным. ОСТ-сохраненные участки должны быть сокращены с замораживающий микротом перед помещением на слайды и используются для IHC и если. Октябрь сохраняет антигенную и сводит к минимуму фон делает его оптимальным методом для микроскопии. Восьмеричные также позволяет немедленному замораживанию и резки по сравнению с FFPE, который требует несколько дней в НСБ. Несмотря на эти преимущества, ОКТ как правило, менее стабильным и менее гибким, чем FFPE потому что только IHC и ПЧ может быть выполнена из ОСТ-срезов.
Что касается анализа РНК, образцы хранили при 4 ° С в РНК-стабилизирующий раствор затвердевает в течение долгого времени, что позволяет лучше РНК еxtraction через коммерчески доступных наборов добычи и TRIzol, среди других. Разрешения на добычу РНК ниже анализ таких, как обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (RT-PCR) для количественного выражения расшифрованных генов, анализа РНК секвенирования, и широкий спектр анализа модулированных генов по микрочипов, или анализа nanoString. Соответственно, для выделения РНК из тканей может быть чрезвычайно высокой доходности, предоставляя обширную информацию о генной экспрессии и путей, пострадавших от лечения и заболеваний. Важно, однако, выражение РНК может варьироваться резко основанный на структуре ткани и размера выборки, так дополнительная забота должна быть приняты, чтобы избежать смещения анализа из-за места отбора проб. Кроме того, природа РНК предполагает, что динамические изменения в уровне экспрессии может иметь место, так особую осторожность следует принимать для обеспечения надлежащего кинетики следуют изучать гены и путей интерес 19,20; Обработка должна быть ограничена после экстракции РНК из стабилизирующих сспособность по обеспечить стабильность. Соответственно, хранение комплементарной ДНК (кДНК) повышенной стабильности предпочтительно РНК (если в соответствии с выходным анализа) 21. Наконец, поскольку РНК может часто быть усилен в последующих анализах, минутные фракции загрязняющих клеток может привести к большим отклонениям в полученных результатов.
Анализ ДНК может быть осуществлено на образцах ранее оснастку замороженной ткани, или на тех участках FFPE ткани. Эти методы позволяют последующее весь ExoME или весь секвенирование генома два метода, которые показали огромные перспективы посредством выявления мутаций и полиморфизмов, связанных с реакцией пациента и прогноза в различных контекстах болезни. Выделение ДНК может дополнительно позволяет идентифицировать Т-клеток и В-клеточного рецептора (TCR и BCR) последовательностей, присутствующих в образцах, с тем чтобы получить знания, относящуюся к антигенам и иммунного ответа в терапии заболеваний и 20,21. По сравнению с РНК, ДНК, обладает высокой стабильностью После извлечения, однакоэто учитывать транскрипции и трансляции регуляции генов, а также пост-трансляционных модификаций и регулирования 22.
Белок может быть экстрагирован непосредственно из оснастки замороженных срезах ткани, или из образцов FFPE для выполнения Вестерн-блот анализа, совместно иммунопреципитации для идентификации белковых взаимодействий и сетей, а также RPPA, метод высокопродуктивный, позволяющую относительное количественное сотен Белки в одном образце 23. Тем не менее, этот метод позволяет идентифицировать известными белками только через его требованию специфических антител. Важно отметить, что в дальнейшем посттрансляционная анализ модификации, такие как фосфорилирование белков, требует быстрой обработки ткани в связи с нестабильностью 15.
Привязать замораживание образцов является простым и требует ограниченные ресурсы. Это также позволяет длительное хранение образцов при вниз по течению анализов еще не определен, за исключениемСлучай проточной цитометрии, который должен быть выполнен на свежих образцах. Snap-замороженные образцы могут быть также легко делиться на совместных целей.
В конечном счете, количество данных, которые могут быть извлечены из одного куска ткани бесконечен. Там нет универсального правильный ответ на который анализы должны быть выполнены в любой момент исследования. Таким образом, каждый исследователь должен гарантировать, что он / она учитывает все гипотезы, эксперименты желаемых, а также имеющиеся ресурсы, прежде чем набор пациентов и обработки ткани, как это может существенно повлиять на дизайн исследования и ответы, которые получены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана благотворительных взносов Джона Г. и Мэри Stella Кенеди Мемориального фонда (грант # 0727033) и научно-исследовательского альянса меланомы. Авторы хотели бы поблагодарить Университет Техаса MD Anderson Cancer Center Институциональная банк тканей (ITB) для координации распределения в тканях и сбор и содействия трансляционные исследования, а также д-р Игнасио Wistuba, д-р Виктор Прието, в MD Anderson Cancer Center Департамента Патология и удара Программа Меланома Луна. Наконец, авторы выражают признательность всем пациентам и их семьям, пострадавшим от меланомы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Needles | BD | 305167 | |
| Stainless steel disposable scalpels | Miltex | 4-410 | |
| Tissue culture dish | Corning | 353003 | |
| Biopsy Cassettes | Thermo Fisher | 58931 | |
| RNA-stabilizing solution | Ambion | AM7021 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Phenix | MAX-815 | |
| 50 ml tubes | Corning | 430290 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | StatLab Medical Products | 28600-5 | |
| Formalin Containers | Fisher Scientific | 23-032-059 | |
| Optimal cutting temperature solution (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura Finetek | 4557 | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Collagenase I | Roche | 11088793001 | |
| 70μm cell strainers | BD Bioscience | 352350 | |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3799 | |
| Live/Dead stain solution | Life Technologies | L34957 |
References
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Cell Biology. Fixing problems with cell lines. Science. 346, 1452-1453 (2014).
- van der Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies. , PLoS Med. 7, e1000245 (2010).
- McCabe, P. M., et al.
- Woolf, S. H. The meaning of translational research and why it matters. JAMA. 299, 211-213 (2008).
- Brockbank, K. G., Taylor, M. J. Tissue Preservation. Advances in Biopreservation. , 157-159 (2006).
- Bulmer, M. The ethics of social research. Researching social life. Gilbert, N. , Sage. London. 45-57 (2001).
- Penslar, R. L. IRB guidebook. , US Government Printing Office. (1993).
- Protection of human subjects. CFR Title 21 Section 50.25. , Food and Drug Administration. Available from: http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/CFRSearch.cfm?FR=50.25 (2011).
- HIPAA privacy rule and public health. Guidance from CDC and the US Department of Health and Human Services. , Centers for Disease Control and Prevention. Available from: http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su5201a1.htm (2003).
- MD Anderson Cancer Center Institutional Tissue Bank Standard Operating Procedures. 3, Institutional Tissue Bank. (2009).
- Collection, Storage, Retrieval and Distribution of Biological Materials for Research. , 3rd ed., International Society for Biological and Environmental Repositories. Available from: http://biorepository.uic.edu/Contact_Us_files/ISBERBestPractices3rdedition.pdf (2011).
- NCI Best Practices for Biospecimen Resources. , 2nd ed., Office of Biorepositories and Biospecimen Research. Available from: http://biospecimens.cancer.gov/bestpractices/2011-NCIbestpractices.pdf (2011).
- Ruffell, B., et al. Leukocyte composition of human breast cancer. Proc. of the Ntnl. Aca. of Sci. 109, 2796-2801 (2012).
- Shapiro, H. M. Practical flow cytometry. , John Wiley & Sons. (2005).
- Baker, A. F., et al. Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling. Clin. Cancer Res. 11, 4338-4340 (2005).
- Jacobs, S. Sample processing considerations for detecting copy number changes in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 1195-1202 (2012).
- Chung, J. -Y., et al. Factors in tissue handling and processing that impact RNA obtained from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J. Histochem. Cytochem. 56, 1033-1042 (2008).
- Guo, H., et al. An efficient procedure for protein extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues for reverse phase protein arrays. Proteome Sci. 10, 1477-5956 (2012).
- Feldman, A. L., et al. Advantages of mRNA amplification for microarray analysis. Biotechniques. 33, 906-914 (2002).
- Francino, O., et al. Advantages of real-time PCR assay for diagnosis and monitoring of canine leishmaniosis. Vet Parasitol. 137, 214-221 (2006).
- Grunberg-Manago, M. Messenger RNA stability and its role in control of gene expression in bacteria and phages. Annu. Rev. Genet. 33, 193-227 (1999).
- Lesnik, E. A., Freier, S. M. Relative thermodynamic stability of DNA, RNA, and DNA:RNA hybrid duplexes: relationship with base composition and structure. Biochemistry. 34, 10807-10815 (1995).
- MacBeath, G.
