Summary
We tonen het effect van de sclerale verknoping met riboflavine en UVA op een axiale verlenging konijn oog. Axiale verlenging werd geïnduceerd in 13 dagen oude New Zealand konijnen (mannen en vrouwen) door hechten hun rechter oog oogleden (tarsorrhaphy).
Abstract
Kortzichtige mensen, vooral die met een ernstige bijziendheid, hebben een hoger dan normaal risico op cataract, glaucoom, netvliesloslating en chorioretinale afwijkingen. Bovendien, pathologische myopie is een veel voorkomende onomkeerbare oorzaak van slechtziendheid en blindheid 1-3. Onze studie toont het effect van verknoping sclerale gebruik riboflavine en UV-A straling op de ontwikkeling van axiale bijziendheid in een konijnenmodel. De axiale lengte van de oogbol werd gemeten door A-scan ultrasound in Nieuw-Zeelandse witte konijnen van 13 dagen (mannelijk en vrouwelijk). Het oog Vervolgens onderging 360 ° conjunctivale peritomy met sclerale verknoping, gevolgd door tarsorrhaphy. Axiale verlenging werd in 13 dagen oude Nieuw-Zeeland konijnen geïnduceerd door het hechten van hun rechter oog oogleden (tarsorrhaphy). De ogen werden onderverdeeld in kwadranten en elk kwadrant hadden twee sclerale bestraling zones, elk met een oppervlakte van 0,2 cm² en een straal van 4 mm. Verknoping werd uitgevoerd druppelsgewijs 0,1%dextran-vrij riboflavine-5- fosfaat op de bestraling zones 20 seconden voordat UV-A straling en elke 20 sec gedurende de 200 seconden bestralingstijd. UVA-straling (370 nm) werd toegepast loodrecht op de sclera op 57 mW / cm² (totaal UVA lichte dosis, 57 J / cm²). Tarsorrhaphies werden verwijderd op dag 55, gevolgd door herhaalde axiale lengte metingen. Deze studie toont aan dat sclerale verknoping met riboflavine en UV-A straling effectief voorkomt occlusie veroorzaakte axiale verlenging in een konijn model.
Introduction
Bijziendheid is de meest voorkomende van de refractieafwijkingen. De prevalentie van bijziendheid in de USA en Europa is naar verluidt ongeveer 30% en in Aziatische landen treft tot 60% van de bevolking 1,2. Bijziend progressie optreedt in tot 50% van de bijzienden, meestal met een snelheid van ongeveer -0,5 dioptrie over een periode van twee jaar 3. De kosten voor de gezondheidszorg opgelegd door bijziendheid zijn aanzienlijk, met inbegrip van de kosten voor brillen, contactlenzen en refractieve chirurgie en kosten in verband met de verhoogde gezondheidsrisico's van glaucoom, cataract, netvliesloslating en visuele handicap 4-6.
In dierstudies van bijziendheid, wordt het zicht vermindering geïnduceerd door ooglid hechten 7-10, plaatsing van een occlusie op korte afstand van de oog- en hoornvlies 11 tatoeëren. Voor kunstmatige bijziendheid te komen in deze studies het occlusie proces moet worden uitgevoerd op zeer jonge dieren, omdat er geen zicht deprivatie experimenten Carried op volwassen exemplaren zijn succesvol gebleken.
Een van de belangrijke kenmerken van ernstige myopie is een pathologische verandering van de sclera met geleidelijke verdunning van de sclera, waarschijnlijk als gevolg van een verstoorde terugkoppelingsmechanisme van emmetropization na visuele deprivatie 12 of door bepaalde stofwisselingsziekte van de sclera, zoals in Ehlers Danlos 13. Uiteindelijk beide mechanismen leiden tot rekken en dunner worden van de sclera, netvlies en choroidea te wijten aan structurele afwijkingen van de kortzichtige sclera, zoals een verminderde collageen vezeldiameter 14,15 en ongeregeldheden fibrillogenese 16.
Verschillende studies hebben aangetoond dat een verminderde collageen verknoping is een belangrijke factor in het verzwakken werkwijze volgens de bijziende sclera 17-18. Wollensak et al. 19-21 geïnduceerd collageen verknoping door toepassing van de fotosensibilisator riboflavine en ultraviolet A (UVA) straling (370 nm)en merkte een belangrijke, 157% verhoging van de stijfheid van varkens en menselijke sclera in vitro 19 en een stijging van 465% in konijn sclerale rigiditeit in vivo (Young's modulus) 20. Verknoping had ook een langdurig effect op konijn sclera in vivo: stijfheid toe met 320,4% na 3 dagen, 277,6% na 4 maanden en 502% na 8 maanden (Young's modulus) 22.
Therapeutische pogingen om bijziende progressie te arresteren zijn gepubliceerd 23-26 maar het succes van deze methoden is omstreden. Geen efficiënte middelen ter voorkoming van progressieve bijziendheid is gevonden tot nu toe.
Het ontstaan van bijziendheid is nog steeds controversieel, en de behandeling ervan vormt een uitdaging. Op basis van deze bevindingen wordt verondersteld dat sclerale verknoping als middel voor sclera gebaseerde behandeling van bijziendheid progressie kan dienen. Het doel van deze studie is om de sclerale collageen crosslinki onderzoekenng effect op de ontwikkeling van axiale bijziendheid geïnduceerd door occlusie zichtas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dieren werden volgens de ARVO-resolutie over het gebruik van dieren bij onderzoek behandeld. De studie protocol werd goedgekeurd door de institutionele Comité voor Laboratory Animal Research (goedkeuring geen 022-4598-2;. 021211).
1. voorbereiding op een operatie # 1
- Weeg en verdoven een 13 dagen oude Nieuw-Zeelandse witte konijnen met een intramusculaire injectie van ketamine hydrochloride 100 mg / ml (100 mg / kg) en xylazine hydrochloride 25 mg / ml (12,5 mg / kg). Die doses worden gebruikt door de lengte van de chirurgische procedure. Verzeker juiste niveau van de anesthesie door het ontbreken van een pijn reflex.
- Met een steriel wattenstaafje, een kleine hoeveelheid oogzalf de niet-geopereerde oog te voorkomen dat het hoornvlies uitdroogt. Toepassen 0,9% fysiologische zoutoplossing valt op het geopereerde oog hoornvlies tijdens de operatie te voorkomen dat de hoornvliezen uitdroogt.
- Voer drie axiale lengte metingen in elk oog na lokale verdoving (oxybuprocaine hydrochloride 0,4%) met behulp van een echo-A scanner en vervolgens het gemiddelde van de metingen. Breng de sonde loodrecht op de centrale cornea.
2. Chirurgie # 1 - Pre verknoping Step
- Met behulp van chirurgische oogheelkundige pincet en een schaar in het kader van een oogheelkundig operationele microscoop, maak een 360 ° conjunctivale peritomy met chirurgische oogheelkundige pincet en een schaar.
- Behulp van een schuine tang of een spier haak identificeren vier oculaire rectus spieren en isoleer ze met een 2-0 gevlochten zijden hechtdraden zonder naalden.
NB: De zijden hechtingen zal helpen met het verplaatsen van de hele wereld in de gewenste richting. De oogbol is verdeeld in kwadranten tussen de vier rectus spieren (vier kwadranten).- Mark met een huid marker twee zones in elk kwadrant, een aan het equatoriale sclera en een aan het achterste sclera. Dit zijn de bestraling zones.
- Bereid een 3 ml tot 5 ml spuit met 0,1% dextran-vrij riboflavine-5-Fosfaate. Sluit de spuit aan een 26 G traan canule of 25 G taps toelopende hydrodelineator.
- Bereid de bestraling inrichting die een UV-A (370 nm) lichtbron is aangesloten op een afgeschuinde down-custom-made glasvezel omvat. Na de meting van energie macht en kalibratie (zie opmerking hieronder), zet het apparaat in 57 mW / cm².
LET OP: kalibratie werd de handel door de fabrikant uitgevoerd. Deze methode zorgt voor een totale dosis UVA-licht van 57 J / cm². (57 mW / cm2 op 0,2 cm 2 is 11,4 mW / cm 2 0,2 behulp 11,4 mW / 0,2 cm2 gedurende 200 sec een cumulatieve belasting van 2,2 J per 0,2 cm 2 spot)
3. Chirurgie # 1 - Cross Linking
- Verplaats de oogbol door aan de zijden hechtdraden in de tegenovergestelde richting van de gekozen kwadrant te behandelen (bijv Trek en nasale bij het behandelen van onderste temporale kwadrant). Voer de oogbol beweging met behulp van een 2-0 gevlochten zijden niet-genaaide hechtdraad die isolates elke rechte spier.
- Toepassen fotosensibilisatoroplossing bevattende 0,1% dextran-vrij riboflavine-5- fosfaat op de bestralingszone 20 sec voor de bestraling begint.
- Bestralen de bestraling zone met behulp van een schuine naar beneden op maat gemaakt glasvezel voor een bestraling periode van 200 sec. Meet het oppervlak van elke zone als 0,2 cm² met een straal van 4 mm.
- Toepassen fotosensibilisatoroplossing bevattende 0,1% dextran-vrij riboflavine-5- fosfaat op de bestralingszone elke 20 sec gedurende de 200 seconden bestralingsduur.
OPMERKING: Voer de bestraling en het laten vallen van de gelijktijdig riboflavine door twee chirurgen. - Herhaal stap 3,1-3,4 voor elk van de vier kwadranten oogbol.
4. Chirurgie # 1 - Bericht verknoping Step
- Scheer de vacht rond het oog. Snijd de deksel marges met behulp van chirurgische oogheelkundige schaar en vervolgens voorzichtig hechtdraad de bovenste en de onderste oogleden met behulp van 4-0 gevlochten zijden ivoorkleur - 3/8 cirkel revers snij- 13 mm lengte C-3 naald (tarsorrhaphy). Breng een kleine hoeveelheid oogzalf op het ooglid aan het einde van de procedure (chlooramfenicol 5%).
5. Chirurgie # 1 - Post-operatieve zorg
- Houd de dieren onder een warmtelamp tijdens het herstel. Heeft een dier niet onbeheerd achter te laten tot het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven.
- Plaats het dier in een schone kooi met nieuwe bedden totdat deze volledig is hersteld. Na herstel, zal het dier teruggebracht naar de dierkamer. Breng het dier aan zijn moeder alleen wanneer wakker.
- Tijdens de eerste 48 uur, onderzoekt de dieren over de algemene conditie en symptomen van ziekte of infectie. Dien analgesie zoals in Sectie 1. Dien analgesie indien nodig indien een wijziging in het konijn gedrag waargenomen. (Metamizool daalt 50 mg / kg om de 6 uur).
6. Chirurgie # 2
- Fifty-vijf dagen na surgery # 1, wegen en verdoven het konijn met een intramusculaire injectie van ketamine hydrochloride 100 mg / ml (100 mg / kg) en xylazine hydrochloride 25 mg / ml (12,5 mg / kg).
- Met behulp van chirurgische oogheelkundige schaar onder een oogheelkundige operationele microscoop, verwijder de tarsorrhaphy. Voer drie axiale lengte metingen van elk oog na lokale verdoving (oxybuprocaïne hydrochloride 0,4%) met behulp van een echo-A scanner en vervolgens het gemiddelde van de metingen. Breng de sonde loodrecht op de centrale cornea.
- Euthanaseren de konijnen met intraperitoneale fenobarbital natrium (200 mg / 1,5 kg lichaamsgewicht).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuren 1 en 2 tonen grafisch de axiale lengte meten van twee groepen. Groep 1 konijnen onderging sclerale verknoping en tarsorrhaphy rechts oog terwijl het linkeroog werd niet geopereerd (figuur 1). Groep 2 konijnen onderging slechts peritomy en tarsorrhaphy rechts oog terwijl het linkeroog werd niet geopereerd (figuur 2).
In groep 1, die sclerale verknoping en tarsorrhaphy onderging, de gemiddelde axiale lengte in het rechter oog gemeten 10,68 ± 0,74 mm vóór ooglid hechtdraad en 14,29 ± 0,3 mm 55 dagen later, voor een gemiddeld verschil van 3,61 ± 0,76 mm. Corresponderende waarden in de geopereerde / unsutured linkeroog was 10,70 ± 0,79 mm en 15,14 ± 0,32 mm, een gemiddeld verschil van 4,44 ± 0,81 mm (figuur 1). Vergelijking van de axiale lengten van het gehechten unsutured ogen aan het einde van de occlusie fase bleek minder netto toename van de ogen gehecht.
In groep 2, die alleen peritomy en tarsorrhaphies onderging, betekent axiale lengte in het rechter oog gemeten 10,50 ± 0,67 mm vóór ooglid hechtdraad en 15,69 ± 0,39 mm 55 dagen later, voor een gemiddeld verschil van 5,19 ± 0,85 mm. Corresponderende waarden in de geopereerde / unsutured linkeroog was 10,54 ± 0,71 mm en 14,74 ± 0,38 mm, een gemiddeld verschil van 4,20 ± 0,67 mm (figuur 2). Vergelijking van de axiale lengten van het gehechte en unsutured ogen aan het einde van de occlusie fase onthulde een grotere netto toename van de ogen gehecht.
Vergelijking van de gemiddelde verandering in de axiale lengte van het rechteroog tussen groep 2 (5,19 ± 0,85 mm) en groep 1 (3,61 ± 0,76 mm) leverde een significant lagere waarde aan het einde van de occlusie phase (55 dagen) in de ogen die de verknoping procedure (p <0,001, niet-parametrische Mann-Whitney test) ondergingen. Het verschil tussen de groepen in gemiddelde axiale lengte in het linkeroog (4,20 ± 0,67 mm tegenover 4,44 ± 0,81 mm) was niet statistisch significant (p = 0,39, Mann-Whitney niet-parametrische test).
Figuur 1. Rechteroog axiale metingen voor en na sclerale verknoping en tarsorrhaphy vs. linkeroog axiale metingen. Het gemiddelde axiale lengte van het rechteroog voor sclerale verknoping en tarsorrhaphy (RE start) en na verwijdering van de tarsorrhaphy 55 dagen later (RE end). De gemiddelde axiale lengte van het linkeroog bij aanvang (LE start) en 55 dagen later (LE end). Het linkeroog werd niet geopereerd en werd opengelaten. De fout balken geeft standaardafwijking van het gemiddelde. (Re-bedrukt met permission uit referentie 27). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Rechteroog axiale voor- en nameting tarsorrhaphy vs. linkeroog axiale metingen. Het gemiddelde axiale lengte van het rechteroog voor tarsorrhaphy (RE start) en na verwijdering van de tarsorrhaphy 55 dagen later (RE end). De gemiddelde axiale lengte van het linkeroog bij aanvang (LE start) en 55 dagen later (LE end) .De linkeroog werd niet geopereerd en is opengelaten. De fout balken geeft standaardafwijking van het gemiddelde. (Re-bedrukt met toestemming van referentie 27). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We presenteren de eerste in vivo studie van het voorkomen van axiale bijziendheid in een konijnenmodel middels crosslinking technologie riboflavine en UV-bestraling. Hoewel verschillende proefdieren kan worden gebruikt in dit type onderzoek, kozen we konijnen vooral door de grootte van de ogen en de noodzaak om verknoping te voeren op het sclerale oppervlak.
We vonden dat het blootstellen van het konijn sclera en het hechten van de bovenste en onderste oogleden procedures toegepast worden. We raden trimmen van de ooglidranden en gebruiken in ons protocol genoemde hechtingen zodat de oogleden stevig gesloten de bepaalde periode zonder noodzaak van correctie.
Een belangrijk punt van overweging is de noodzaak om de bestralingsinrichting en de vezeloptische voor gewenste machtsenergie kalibreren.
H & E histologische coupes toonde geen giftige veranderingen in het netvlies op ogen die de verknoping procedure ondergingen. Verder onderzoek moet worden uitgevoerd naar de mogelijke toxiciteit van riboflavine en UVA-straling aan te pakken op het netvlies, vaatvlies en sclera, met een focus op positie, hoeveelheid energie en belichtingstijd.
Een aantal beperkingen van deze studie warrant overweging. Alleen pre- en postoperatieve axiale lengtes werden gemeten. De axiale lengte van de oogbol werd gemeten door A-scan echografie. We hadden geen biometrische eigenschappen, refractie-analyse of biomechanische eigenschappen van de sclera te evalueren.
Bij elkaar genomen, denken we dat het effect van sclerale verknoping met riboflavine en UVA op de axiale verlenging van het konijn het oog van een positief effect op bijziendheid onderzoek zal hebben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs zijn dankbaar aan mevrouw Dalia Sela en de heer Emi Sharon voor hun professionele en uitstekende technische werkzaamheden in het laboratorium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-0 braided silk non-needled sutures | ETHICON | W193 | |
| 4-0 braided silk ivory color | ETHICON | W816 | |
| 0.1% dextran-free riboflavin-5-phosphate 1 mg:1 ml | Concept for Pharmacy Ltd | D2-5025 | |
| UV A (370 nm) light source | O/E LAND Inc | NCSU033B | |
| Beveled down custom made fiber optic | Prizmatix Ltd | ||
| 26 G lacrimal cannula | Beaver-visitec International Ltd. | REF581276 | |
| 25 G tapered hydrodelineator [Blumenthal] | Beaver-visitec International Ltd. | REF585107 | |
| 13 days old rabbits | Harlan | 1NZWR40 | |
| Ultrasonic biometer | Allergan-Humphrey | 820-519 | |
| Skin marker | Devon | 4237101664X |
References
- McBrien, N. A., Gentle, A. Role of the sclera in the development and pathological complications of myopia. Prog. Retin. Eye Res. 22, 307-338 (2003).
- Saw, S. M., Gazzard, G., Au Eong, K. -G., Tan, D. T. H. Myopia: attempts to arrest progression. Br. J. Ophthalmol. 86, 1306-1311 (2002).
- Bullimore, M. A., Jones, L. A., Moeschberger, M. L., Zadnik, K., Payor, R. E. A retrospective study of myopia progression in adult contact lens wearers. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43, 2110-2113 (2002).
- Rose, K., Smith, W. E., Morgan, I., Mitchell, P. The increasing prevalence of myopia: implications for Australia. Clin. Exp. Ophthalmol. 29, 116-120 (2001).
- Saw, S. M., Gazzard, G., Shih-Yen, E. C., Chua, W. H. Myopia and associated pathological complications. Ophthal. Physiol. Opt. 25, 381-391 (2005).
- Tano, Y. Pathologic myopia - where are we now. Am. J. Ophthalmol. 134, 645-660 (2002).
- Greene, P. R., Guyton, D. L. Time course of rhesus lid-suture myopia. Exp. Eye Res. 42, 529-534 (1986).
- McBrien, N. A., Norton, T. T. The development of experimental myopia and ocular component dimensions in monocularly lid-sutured tree shrews (Tupaia belangeri). Vision Res. 32, 843-852 (1992).
- McKanna, J. A., Casagrande, V. A. Reduced lens development in lid-suture myopia. Exp. Eye Res. 26, 715-723 (1978).
- Shapiro, A. Experimental visual deprivation and myopia. Doc. Ophthalmol. Proc. Ser. 28, 193-195 (1981).
- Wiesel, T. N., Raviola, E. Increase in axial length of the macaque monkey eye after corneal opacification. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 18, 1232-1236 (1979).
- Weiss, A. H. Unilateral high myopia: optical components, associated factors and visual outcomes. Br J Ophthalmol. 87, 1025-1031 (2003).
- Mechanic, G. Crosslinking of collagen in a heritable disorder of connective tissue: Ehlers-Danlos syndrome. Biochem. Biophys. Res. Com. 47, 267-272 (1972).
- Curtin, B. J., Iwamoto, T., Renaldo, D. P. Normal and staphylomatous sclera of high myopia. An electron microscopic study. Arch. Ophthalmol. 97, 912-915 (1979).
- Liu, K. R., Chen, M. S., Ko, L. S. Electron microscopic studies of the scleral collagen fibre in excessively high myopia. J. Formosan Med. Assoc. 85, 1032-1038 (1986).
- Funata, M., Tokoro, T. Scleral change in experimentally myopic monkeys. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 228, 174-179 (1990).
- McBrien, N. A., Norton, T. T. Prevention of collagen cross-linking increases form deprivation myopia in tree shrew. Exp. Eye Res. 59, 475-486 (1994).
- Iomdina, E. N., Daragan, V. A., Ilyina, E. E. Certain biomechanical properties and cross linking of the scleral shell of the eye in progressive myopia. Proceedings of XIVth Congress on Biomechanics. Paris: International Society of Biomechanics. , 616-617 (1993).
- Wollensak, G., Spörl, E., Seiler, T. Riboflavin / ultraviolet-A-induced collagen crosslinking for the treatment of keratoconus. Am. J. Ophthalmol. 135, 620-627 (2003).
- Wollensak, G., Spörl, E. Collagencrosslinking of human and porcine sclera. J. Cataract Refract. Surg. 30, 689-695 (2004).
- Wollensak, G., Iomdina, E., Dittert, D. -D., Salamatina, O., Stoltenburg, G. Cross-linking of scleral collagen in the rabbit using riboflavin and UVA. Acta Ophthalmol. Scand. 83, 477-482 (2005).
- Wollensak, G., Iomdina, E. Long-term biomechanical properties of rabbit sclera after collagen crosslinking using riboflavin and ultraviolet (UVA). Acta Ophthalmol. 87, 193-198 (2009).
- Wildsoet, C. F., Norton, T. T.
- Avetisov, E. S., Tarutta, E. P., Iomdina, E. N., Vinetskaya, M. I., Andreyeva, M. I. Nonsurgical and surgical methods of sclera reinforcement in progressive myopia. Acta Ophthalmol. Scand. 75, 618-623 (1997).
- Thompson, F. B. A simplified sclera reinforcement technique. Am. J. Ophthalmol. 86, 782-790 (1978).
- Whitmore, W. G., Curtin, B. J. Scleral reinforcement: two case reports. Ophthalmic Surg. 18, 503-505 (1987).
- Dotan, A., Kremer, I., Livnat, T., Zigler, A., Weinberger, D., Bourla, D. Scleral cross-linking using riboflavin and ultraviolet-A radiation for prevention of progressive myopia in a rabbit model. Exp Eye Res. 127, 190-195 (2014).
