Summary
Vi demonstrerer effekten af sclerale tværbinding med riboflavin og UVA på en aksial forlængelse kaninøjne. Axial forlængelse blev induceret i 13 dage gamle New Zealand kaniner (mandlige og kvindelige) ved suturering deres højre øje øjenlåg (tarsorrhaphy).
Abstract
Nærsynede personer, især dem med svær nærsynethed, er i højere end normalt risiko for grå stær, grøn stær, nethindeløsning og chorioretinal abnormiteter. Desuden patologisk nærsynethed er en almindelig irreversibel årsag til synshandicap og blindhed 1-3. Vores undersøgelse viser virkningen af sclerale tværbinding under anvendelse riboflavin og ultraviolet-A stråling på udviklingen af aksial myopi i et kanin-model. Den aksiale længde af øjeæblet blev målt ved A-scan ultralyd i New Zealand hvide kaniner i alderen 13 dage (han og hun). Øjet gennemgik herefter 360 ° konjunktival peritomi med sclerale tværbinding efterfulgt af tarsorrhaphy. Axial forlængelse blev induceret i 13 dage gamle New Zealand kaniner ved suturering deres højre øje øjenlåg (tarsorrhaphy). Øjnene blev opdelt i kvadranter, og hver kvadrant havde to scleral bestrålingszoner, hver med et areal på 0,2 cm og en radius på 4 mm. Tværbinding blev udført ved at droppe 0,1%dextran-frit riboflavin-5-phosphat på bestrålingszoner 20 sek før ultraviolet-A bestråling og hver 20 sek under 200 sek bestrålingstid. UVA-stråling (370 nm) blev påført vinkelret på sclera ved 57 mW / cm (total UVA lysdosis, 57 J / cm). Tarsorrhaphies blev fjernet på dag 55, efterfulgt af målinger gentagne aksiale længde. Denne undersøgelse viser, at scleral tværbinding med riboflavin og ultraviolet-A stråling effektivt forhindrer okklusion-induceret aksial forlængelse i en kaninmodel.
Introduction
Nærsynethed er den mest almindelige af de refraktive lidelser. Forekomsten af nærsynethed i USA og Europa er rapporteret at være omkring 30%, og i de asiatiske lande det påvirker op til 60% af den almindelige befolkning 1,2. Nærsynet progression forekommer hos op til 50% af myopier, som regel med en hastighed på omkring -0,5 dioptrier over en to-års interval 3. De sundhedsmæssige omkostninger som følge af nærsynethed er betydelige, herunder omkostninger til briller, kontaktlinser og refraktiv kirurgi og omkostninger forbundet med de øgede sundhedsmæssige risici for grøn stær, grå stær, nethindeløsning og synshandicap 4-6.
I dyreforsøg af nærsynethed, er synet reduktion induceret af øjenlåg sutur 7-10, placering af en okklusionsindretning i en kort afstand fra øjet og hornhindens tatovering 11. til kunstig myopi at forekomme i disse undersøgelser, okklusionen proces skal imidlertid udføres på meget unge dyr, som ingen syn afsavnsindikatorer eksperimenter CarrIED på voksne fisk har vist sig effektive.
Et af de vigtige elementer i alvorlig nærsynethed er en patologisk ændring af sclera med progressiv udtynding af sclera, sandsynligvis på grund af en forstyrret feedback-mekanisme for emmetropization efter visuel deprivation 12 eller på grund af nogle metabolisk lidelse af sclera, såsom i Ehlers- Danlos syndrom 13. I sidste ende, begge mekanismer fører til strækning og udtynding af sclera, nethinden og årehinden som følge af strukturelle abnormiteter i nærsynet sclera såsom en nedsat kollagen fiber diameter 14,15 og uroligheder i fibrillogenese 16.
Flere undersøgelser har vist, at forringet collagentværbinding er en vigtig faktor i den svækkede fremgangsmåden nærsynet sclera 17-18. Wollensak et al. 19-21 induceret collagentværbinding ved at anvende det fotosansiterende riboflavin og ultraviolet-A (UVA) bestråling (370 nm)og konstateret en betydelig, 157% stigning i stivhed svin og menneskelig sclera in vitro 19 og en stigning 465% i kanin sclera stivhed in vivo (Youngs modul) 20. Tværbinding havde også en langsigtet effekt på kanin sclera in vivo: stivhed steget med 320,4% efter 3 dage, 277,6% efter 4 måneder, og 502% efter 8 måneder (Youngs modul) 22.
Terapeutiske forsøg på at arrestere nærsynet progression er blevet offentliggjort 23-26, men succesen af disse metoder er kontroversiel. Ingen effektive midler til at forhindre progressiv nærsynethed er fundet til dato.
Ætiologien af nærsynethed er stadig kontroversiel, og dens behandling udgør en udfordring. På grundlag af disse resultater, antages det scleral tværbinding kan tjene som et middel til sclera-baseret behandling af nærsynet progression. Formålet med denne undersøgelse er at undersøge sclerale kollagen crosslinking virkning på udviklingen af aksial myopi induceret ved visuel akse okklusion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrene blev behandlet i overensstemmelse med ARVO beslutning om anvendelse af dyr til forskning. Undersøgelsen protokol Den blev godkendt af den institutionelle udvalg for Laboratory Animal Research (godkendelse nr 022-4598-2,. 021.211).
1. Forberedelse til Kirurgi # 1
- Afvej og bedøver en 13 dage gammel New Zealand hvid kanin med en intramuskulær injektion af ketaminhydrochlorid 100 mg / ml (100 mg / kg) og xylazin hydrochlorid 25 mg / ml (12,5 mg / kg). Disse doser anvendes på grund af længden af den kirurgiske procedure. Sikre en passende grad af anæstesi ved manglen på en smerte refleks.
- Anvendelse af en steril vatpind, anvende en lille mængde af ophthalmisk salve til den ikke-opererede øje at forhindre hornhinden tørrer ud. Påfør 0,9% normalt saltvand sættes på den opererede øje hornhinde under operationen for at forhindre hornhinderne tørrer ud.
- Udfør tre længde målinger aksiale i hvert øje efter topikal anæstesi (oxybuprocaine-hydrochlorid 0,4%) under anvendelse af en ultralyd A-scanner og derefter gennemsnittet af målingerne. Påfør proben vinkelret på den centrale hornhinde.
2. Kirurgi # 1 - Pre Cross Sammenkædning Trin
- Brug kirurgiske oftalmologiske pincet og saks under et oftalmisk operativsystem mikroskop, lave en 360 ° konjunktival peritomi med kirurgiske oftalmologiske pincet og saks.
- Brug en vinklet pincet eller en muskel krog identificere de fire ekstraokulære rectus muskler og isolere dem med en 2-0 flettet silke ikke-nålet suturer.
BEMÆRK: silke suturer vil hjælpe med at flytte hele kloden i den ønskede retning. Øjeæblet er opdelt i kvadranter mellem de fire rectus muskler (fire kvadranter).- Marker med en hud markør to zoner i hver kvadrant, en ved den ækvatoriale sclera og en ved den bageste sclera. Disse er de bestrålingszoner.
- Forbered en 3 ml til 5 ml sprøjte indeholdende 0,1% dextran-frit riboflavin-5-Phosphate. Tilslut sprøjten til en 26 G lacrimal kanyle eller 25 G tilspidset hydrodelineator.
- Forbered bestråling, som indbefatter en UV A (370 nm) lyskilde forbundet til en affaset ned skræddersyet fiberoptisk. Efter måling af energi magt og kalibrering (se note nedenfor), indstille enheden til 57 mW / cm².
BEMÆRK: Kalibrering blev udført kommercielt af fabrikanten. Denne fremgangsmåde tilvejebringer en total UVA lysdosis på 57 J / cm. (57 mW / cm2 på 0,2 cm 2 er 11,4 mW / 0,2 cm 2 med 11,4 mW / 0,2 cm 2 for 200 sek er en kumulativ belastning på 2,2 J pr 0,2 cm 2 spot)
3. Kirurgi # 1 - Cross Sammenkædning
- Flyt øjeæblet ved at trække de silkesuturer i den modsatte retning af den valgte kvadrant, der skal behandles (f.eks Træk op og nasal ved behandling af nedre temporale kvadrant). Udfør øjeæblet bevægelse ved hjælp af en 2-0 flettet silke ikke-nål sutur, som jegsolates hver rectus muskel.
- Påfør fotosensibilisator opløsning indeholdende 0,1% dextran-frit riboflavin-5-phosphat på bestrålingszonen 20 sek inden bestråling starter.
- Bestråle bestrålingszonen anvendelse af en affaset ned skræddersyet fiberoptisk for en bestråling periode på 200 sek. Måle arealet af hver zone som 0,2 cm med en radius på 4 mm.
- Påfør fotosensibilisator opløsning indeholdende 0,1% dextran-frit riboflavin-5-phosphat på bestrålingszonen hver 20 sek under 200 sek bestråling periode.
BEMÆRK: Udfør bestråling og opgivelsen af riboflavin samtidig af to kirurger. - Gentag trin 3.1-3.4 for hver af de fire eyeball kvadranter.
4. Kirurgi # 1 - Send Cross Sammenkædning Trin
- Barbere pelsen omkring øjet. Trim låget margener hjælp kirurgiske oftalmologiske saks og derefter forsigtigt sutur de øvre og nedre øjenlåg bruger 4-0 flettet silke elfenben farve - 3/8 cirkel revers skære- 13 mm længde C-3 nål (tarsorrhaphy). Anvende en lille mængde af ophthalmisk salve på låget margin ved afslutningen af proceduren (chloramphenicol 5%).
5. Kirurgi # 1 - Send operative pleje
- Hold dyrene under en varmelampe under opsving. Lad ikke et dyr uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje.
- Placer dyret i en ren bur med ny strøelse, indtil den er fuldt tilbagebetalt. Efter genvinding, vil dyret returneres til dyret rummet. Retur dyret til sin mor, når vågen.
- Under den første 48 timer, undersøger dyrene om den generelle tilstand og tegn på sygdom eller infektioner. Administrer analgesi efter § 1. Administrer analgesi efter behov, hvis der observeres en ændring i kanin adfærd. (Metamizol dråber 50 mg / kg hver 6. time).
6. Kirurgi # 2
- Fifty-fem dage efter surgery # 1, vejes og bedøver kaniner med en intramuskulær injektion af ketaminhydrochlorid 100 mg / ml (100 mg / kg) og xylazin hydrochlorid 25 mg / ml (12,5 mg / kg).
- Brug kirurgiske oftalmologiske saks under et oftalmisk operativsystem mikroskop, fjerne tarsorrhaphy. Udføre tre længdemål aksiale på hvert øje efter topisk anæstesi (oxybuprocainhydrochlorid 0,4%) under anvendelse af en ultralyd A-scanner og derefter gennemsnittet af målingerne. Påfør proben vinkelret på den centrale hornhinde.
- Aflive de kaniner med intraperitoneal phenobarbital-natrium (200 mg / 1,5 kg legemsvægt).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 og 2 grafisk demonstrerer den aksiale længde målinger af to grupper. Gruppe 1 kaniner undergik sclerale tværbinding og tarsorrhaphy på højre øje, mens det venstre øje ikke blev opereret (figur 1). Gruppe 2 kaniner undergik kun peritomi og tarsorrhaphy på højre øje, mens det venstre øje ikke blev opereret (figur 2).
I gruppe 1, som undergik sclerale tværbinding og tarsorrhaphy, den gennemsnitlige aksiale længde i det højre øje målte 10,68 ± 0,74 mm før øjenlåg sutur og 14.29 ± 0,3 mm 55 dage senere, for en gennemsnitlig forskel på 3.61 ± 0.76 mm. Tilsvarende værdier i ikke-opererede / unsutured venstre øje var 10,70 ± 0,79 mm og 15,14 ± 0,32 mm, til en gennemsnitlig forskel på 4,44 ± 0,81 mm (figur 1). Sammenligning af de aksiale længder af sutureresog unsutured øjne i slutningen af okklusion fase viste en mindre nettostigning i de suturerede øjne.
I gruppe 2, der undergik kun peritomi og tarsorrhaphies, betyde aksiale længde i det højre øje målte 10,50 ± 0,67 mm før øjenlåg sutur og 15,69 ± 0,39 mm 55 dage senere, for en gennemsnitlig forskel på 5.19 ± 0,85 mm. Tilsvarende værdier i ikke-opererede / unsutured venstre øje var 10.54 ± 0,71 mm og 14,74 ± 0,38 mm, til en gennemsnitlig forskel på 4,20 ± 0,67 mm (figur 2). Sammenligning af de aksiale længder af suturerede og unsutured øjne i slutningen af okklusion fase viste en større nettostigning i de suturerede øjne.
Sammenligning af den gennemsnitlige ændring i aksiale længde af de rette øjne mellem gruppe 2 (5,19 ± 0,85 mm) og gruppe 1 (3,61 ± 0,76 mm) gav en signifikant lavere værdi ved slutningen af okklusion phase (55 dage) i øjnene der undergik tværbindingen procedure (p <0,001, ikke-parametrisk Mann-Whitney-test). Det Forskellen mellem grupperne i den gennemsnitlige aksiale længde i de venstre øjne (4,20 ± 0,67 mm vs. 4,44 ± 0,81 mm) var ikke statistisk signifikant (p = 0,39, Mann-Whitney ikke-parametrisk test).
Figur 1. Højre øje aksiale målinger før og efter scleral tværbinding og tarsorrhaphy vs. venstre øje aksiale målinger. Det betyder aksiale længde af det højre øje før scleral tværbinding og tarsorrhaphy (RE start) og efter fjernelse af tarsorrhaphy 55 dage senere (RE ende). Den gennemsnitlige aksiale længde af venstre øje ved baseline (LE start) og 55 dage senere (LE ende). Det venstre øje blev ikke opereret og blev efterladt åben. Fejlsøjlerne angiver standardafvigelsen af middelværdien. (Re-trykt med tilladelse medn fra henvisning 27). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Højre øje aksiale målinger før og efter tarsorrhaphy vs. venstre øje aksiale målinger. Det betyder aksiale længde af højre øje før tarsorrhaphy (RE start) og efter fjernelse af tarsorrhaphy 55 dage senere (RE ende). Den gennemsnitlige aksiale længde af venstre øje ved baseline (LE start) og 55 dage senere (LE ende) .Den venstre øje blev ikke opereret og blev efterladt åben. Fejlsøjlerne angiver standardafvigelsen af middelværdien. (Re-trykt med tilladelse fra henvisning 27). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi præsenterer den første in vivo studie af forebyggelse af aksial nærsynethed i en kanin model ved hjælp af cross-linking teknologi med riboflavin og UVA-bestråling. Selv om der kan bruges forskellige forsøgsdyr i denne type undersøgelse, valgte vi kaniner hovedsagelig på grund af størrelsen af øjne og behovet for at udføre tværbinding på sclera overflade.
Vi fandt, at udsætte kanin sclera og suturering de øvre og nedre øjenlåg til at være udfordrende procedurer. Vi anbefaler trimning låget margener og under anvendelse af de suturer, der er nævnt i vores protokol for at sikre, at øjenlågene er fast lukket for den givne periode uden behov for korrektioner.
En vigtig ting at overveje, er behovet for at kalibrere bestråling enheden og fiberoptiske for den nødvendige power energi.
H & E histologiske slides afslørede ingen giftige ændringer i nethinden på øjne, der gennemgik den tværbindende procedure. bør udføres yderligere undersøgelser for at løse potentielle toksicitet riboflavin og UVA-bestråling på nethinden, årehinden og sclera, med fokus på position, mængde energi og eksponeringstid.
Flere begrænsninger af denne undersøgelse warrant overvejelse. Kun præoperativ og postoperativ aksiale længder blev målt. Den aksiale længde af øjeæblet blev målt ved A-scan ultralyd. Vi har ikke vurdere biometriske egenskaber, refraktiv analyse eller biomekaniske egenskaber af senehinden.
Tilsammen tror vi, at effekten af sclerale krydsbinding med riboflavin og UVA på den aksiale forlængelse af kanin øje vil have en positiv indvirkning på nærsynethed forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne er taknemmelige for Ms Dalia Sela og Mr. Emi Sharon for deres professionelle og fremragende tekniske arbejde i laboratoriet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-0 braided silk non-needled sutures | ETHICON | W193 | |
| 4-0 braided silk ivory color | ETHICON | W816 | |
| 0.1% dextran-free riboflavin-5-phosphate 1 mg:1 ml | Concept for Pharmacy Ltd | D2-5025 | |
| UV A (370 nm) light source | O/E LAND Inc | NCSU033B | |
| Beveled down custom made fiber optic | Prizmatix Ltd | ||
| 26 G lacrimal cannula | Beaver-visitec International Ltd. | REF581276 | |
| 25 G tapered hydrodelineator [Blumenthal] | Beaver-visitec International Ltd. | REF585107 | |
| 13 days old rabbits | Harlan | 1NZWR40 | |
| Ultrasonic biometer | Allergan-Humphrey | 820-519 | |
| Skin marker | Devon | 4237101664X |
References
- McBrien, N. A., Gentle, A. Role of the sclera in the development and pathological complications of myopia. Prog. Retin. Eye Res. 22, 307-338 (2003).
- Saw, S. M., Gazzard, G., Au Eong, K. -G., Tan, D. T. H. Myopia: attempts to arrest progression. Br. J. Ophthalmol. 86, 1306-1311 (2002).
- Bullimore, M. A., Jones, L. A., Moeschberger, M. L., Zadnik, K., Payor, R. E. A retrospective study of myopia progression in adult contact lens wearers. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43, 2110-2113 (2002).
- Rose, K., Smith, W. E., Morgan, I., Mitchell, P. The increasing prevalence of myopia: implications for Australia. Clin. Exp. Ophthalmol. 29, 116-120 (2001).
- Saw, S. M., Gazzard, G., Shih-Yen, E. C., Chua, W. H. Myopia and associated pathological complications. Ophthal. Physiol. Opt. 25, 381-391 (2005).
- Tano, Y. Pathologic myopia - where are we now. Am. J. Ophthalmol. 134, 645-660 (2002).
- Greene, P. R., Guyton, D. L. Time course of rhesus lid-suture myopia. Exp. Eye Res. 42, 529-534 (1986).
- McBrien, N. A., Norton, T. T. The development of experimental myopia and ocular component dimensions in monocularly lid-sutured tree shrews (Tupaia belangeri). Vision Res. 32, 843-852 (1992).
- McKanna, J. A., Casagrande, V. A. Reduced lens development in lid-suture myopia. Exp. Eye Res. 26, 715-723 (1978).
- Shapiro, A. Experimental visual deprivation and myopia. Doc. Ophthalmol. Proc. Ser. 28, 193-195 (1981).
- Wiesel, T. N., Raviola, E. Increase in axial length of the macaque monkey eye after corneal opacification. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 18, 1232-1236 (1979).
- Weiss, A. H. Unilateral high myopia: optical components, associated factors and visual outcomes. Br J Ophthalmol. 87, 1025-1031 (2003).
- Mechanic, G. Crosslinking of collagen in a heritable disorder of connective tissue: Ehlers-Danlos syndrome. Biochem. Biophys. Res. Com. 47, 267-272 (1972).
- Curtin, B. J., Iwamoto, T., Renaldo, D. P. Normal and staphylomatous sclera of high myopia. An electron microscopic study. Arch. Ophthalmol. 97, 912-915 (1979).
- Liu, K. R., Chen, M. S., Ko, L. S. Electron microscopic studies of the scleral collagen fibre in excessively high myopia. J. Formosan Med. Assoc. 85, 1032-1038 (1986).
- Funata, M., Tokoro, T. Scleral change in experimentally myopic monkeys. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 228, 174-179 (1990).
- McBrien, N. A., Norton, T. T. Prevention of collagen cross-linking increases form deprivation myopia in tree shrew. Exp. Eye Res. 59, 475-486 (1994).
- Iomdina, E. N., Daragan, V. A., Ilyina, E. E. Certain biomechanical properties and cross linking of the scleral shell of the eye in progressive myopia. Proceedings of XIVth Congress on Biomechanics. Paris: International Society of Biomechanics. , 616-617 (1993).
- Wollensak, G., Spörl, E., Seiler, T. Riboflavin / ultraviolet-A-induced collagen crosslinking for the treatment of keratoconus. Am. J. Ophthalmol. 135, 620-627 (2003).
- Wollensak, G., Spörl, E. Collagencrosslinking of human and porcine sclera. J. Cataract Refract. Surg. 30, 689-695 (2004).
- Wollensak, G., Iomdina, E., Dittert, D. -D., Salamatina, O., Stoltenburg, G. Cross-linking of scleral collagen in the rabbit using riboflavin and UVA. Acta Ophthalmol. Scand. 83, 477-482 (2005).
- Wollensak, G., Iomdina, E. Long-term biomechanical properties of rabbit sclera after collagen crosslinking using riboflavin and ultraviolet (UVA). Acta Ophthalmol. 87, 193-198 (2009).
- Wildsoet, C. F., Norton, T. T.
- Avetisov, E. S., Tarutta, E. P., Iomdina, E. N., Vinetskaya, M. I., Andreyeva, M. I. Nonsurgical and surgical methods of sclera reinforcement in progressive myopia. Acta Ophthalmol. Scand. 75, 618-623 (1997).
- Thompson, F. B. A simplified sclera reinforcement technique. Am. J. Ophthalmol. 86, 782-790 (1978).
- Whitmore, W. G., Curtin, B. J. Scleral reinforcement: two case reports. Ophthalmic Surg. 18, 503-505 (1987).
- Dotan, A., Kremer, I., Livnat, T., Zigler, A., Weinberger, D., Bourla, D. Scleral cross-linking using riboflavin and ultraviolet-A radiation for prevention of progressive myopia in a rabbit model. Exp Eye Res. 127, 190-195 (2014).
