Summary
私たちは、軸方向伸長のウサギの眼にリボフラビンおよびUVAと強膜架橋の効果を実証します。軸方向の伸びは、その右目のまぶた（瞼板縫合）を縫合することによって13日齢のニュージーランドウサギ（オスとメス）で誘導されました。
Abstract
近視の人、重度の近視の特には、白内障、緑内障、網膜剥離および脈絡網膜異常の通常より高い危険にさらされています。また、病的近視は視力障害や失明1-3の一般的な不可逆的な原因です。本研究では、ウサギモデルにおける軸性近視の開発にリボフラビンおよび紫外線照射を使用して強膜の架橋の効果を示します。眼球の軸長は、13日（雄および雌）熟成ニュージーランド白ウサギにおける走査超音波検査で測定しました。目はその後、瞼板縫合に続いて、強膜の架橋と360°の結膜peritomyを施行しました。軸方向の伸びは、その右目のまぶた（瞼板縫合）を縫合することによって13日齢のニュージーランドウサギで誘導されました。眼の象限に分割され、すべての象限は、0.2 cm 2での面積と4mmの半径でそれぞれ2つの強膜照射ゾーンを有していました。架橋は0.1％をドロップすることによって行いましたデキストランフリー紫外線照射前照射ゾーン20秒と200秒の照射時間の間に20秒ごとの上にリボフラビン-5-リン酸。 UVA照射（370 nm）は57 mWの/ cm 2の（合計UVA光の線量、57 J / cm 2で）で強膜に垂直に印加しました。 Tarsorrhaphiesが繰り返さ軸方向の長さの測定に続いて、55日目に除去しました。この研究は、リボフラビンおよび紫外線放射で強膜の架橋が効果的にウサギモデルで閉塞によって誘発される軸方向の伸びを防止することを示しています。
Introduction
近視は、屈折障害の最も一般的なものです。米国および欧州で近視の有病率は約30％であることが報告され、アジア諸国では一般人口1,2の60％にまで影響を及ぼしています。近視の進行は、通常2年間の期間3オーバーの周り-0.5ジオプターの割合で、近視者の50％までに発生します。近視によって課される医療費は、眼鏡、コンタクトレンズ及び屈折矯正手術のための費用や緑内障、白内障、網膜剥離や視覚障害4-6の増加、健康上のリスクに関連する費用を含む、かなりのです。
近視の動物実験では、視力低下は、眼および角膜入れ墨11から短い距離でまぶた縫合7-10、閉塞器の配置によって誘導されます。しかしながら、これらの研究で発生する人工的な近視のために、オクルージョン処理なし視覚剥奪実験カーとして、非常に若い動物で行われなければなりません大人の標本上でIEDは成功を収めてきました。
重度の近視の重要な特徴の一つは、このようなEhlers-のように視覚剥奪12または強膜のいくつかの代謝障害に起因した後正視の乱れフィードバック機構に起因し、おそらく強膜の進行間伐と強膜の病理学的変化、ですダンロス症候群13。最終的には、両方のメカニズムは、そのような線維形成16で減少したコラーゲン繊維径14,15や外乱などの近視、強膜の構造異常にストレッチや強膜、網膜および脈絡膜の薄膜化につながります。
いくつかの研究は、障害のコラーゲン架橋は近視強膜17-18の弱化過程における重要な因子であることを示しています。ウォレンサックら 19-21は、リボフラビンおよび紫外線A（UVA）照射光増感剤を適用することにより、コラーゲンの架橋を誘導した（370 nm）とおよびin vitro 19 でブタと人間の強膜の剛性が大幅に、157パーセントの増加と、in vivoでのウサギの強膜剛性465％の増加（ヤング率）20を指摘しました。 剛性が4ヶ月後、3日後に320.4パーセントによって277.6パーセント増加し、8ヶ月（ヤング率）22の後に502パーセント：架橋はまた、 インビボでのウサギの強膜上の長期的な効果を持っていました。
近視の進行を阻止するための治療の試みが23-26公開されているが、これらの方法の成功は議論の余地があります。進行性近視を防ぐませ効率的な手段は、現在までに見出されていません。
近視の病因は依然として論争のであり、その治療が課題となって。これらの知見に基づいて、強膜の架橋は、近視の進行の強膜に基づく治療のための手段として働くことができると仮定されます。本研究の目的は、強膜コラーゲンを調べることですcrosslinki視線閉塞によって誘発される軸性近視の発展に影響をngの。
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Protocol
動物は、研究における動物の使用に関するARVO決議に従って処理しました。研究プロトコールは、実験動物研究のための制度委員（。; 021211承認なし022-4598-2）によって承認されました。
手術＃1の1.準備
- 計量し、塩酸ケタミン100 mg / mlで（100mg / kg）およびキシラジン塩酸塩25 mg / mlで（12.5ミリグラム/キログラム）の筋肉内注射で13日齢のニュージーランド白ウサギを麻酔。これらの用量は、により外科手術の長さに使用されています。痛みの反射の欠如によって麻酔の適切なレベルを確保。
- 滅菌綿棒を用いて、乾燥から角膜を防止するために、非操作眼に眼軟膏の少量を適用します。通常の生理食塩水を乾燥から角膜を防止するために、運転中に操作し、目の角膜上に落下0.9％を適用します。
- oxybuprocain（局所麻酔の後にそれぞれの眼に3軸方向の長さの測定を行います次に、E塩酸塩0.4％）の超音波Aスキャナを使用して、測定値を平均します。角膜中央に垂直にプローブを適用します。
2.外科＃1 - プレクロスリンクステップ
- 眼科手術用顕微鏡下手術用眼科用ピンセットやハサミを使用して、手術用眼科用ピンセットやハサミで360°結膜peritomyを作ります。
- 角度のついた鉗子や筋肉のフックを使用すると、4外眼直筋を特定し、2-0編組絹非ニードル縫合糸でそれらを分離します。
注：絹縫合糸は、所望の方向に地球を移動するに役立ちます。眼球は、4つの直筋（4象限）間の象限に分割されます。- 皮膚マーカー各象限内の2つのゾーン、赤道強膜で1と後部強膜に1つのマーク。これらは、照射領域です。
- 0.1％を含む5ミリリットル注射器に3ミリリットルを準備デキストランフリーリボフラビン-5- phosphat電子。 26 G涙腺カニューレまたは25 Gテーパーhydrodelineatorに注射器を接続します。
- ダウン面取りカスタムメイドの光ファイバに接続されたUV A（370 nm）の光源と、照射装置を準備します。エネルギー電力およびキャリブレーション（下記注参照）の測定に続いて、57ミリワット/ cm 2のにデバイスを設定します。
注：キャリブレーションは、製造業者によって商業的に実施されました。この方法は、57 J / cm 2での合計UVA光の線量を提供します。 （0.2 cm 2の上に57 mWの/ cm 2で 2.2 J 0.2あたりcm 2のスポットの累積負荷200秒間11.4 mWの/ 0.2 cmの2を使用して11.4 mWの/ 0.2 cm 2とされています）
3.外科＃1 - クロスリンク
- （低い時間象限を治療する場合、例えば、プルアップおよび鼻）で処理されるために選択され象限の反対方向に絹縫合糸を引っ張ることにより、眼球を移動します。私2-0編組絹非針付き縫合糸を使用して、眼球運動を行います各直筋をsolates。
- 照射開始前、照射ゾーン20秒に0.1％のデキストランフリーリボフラビン-5-リン酸を含む光増感液を適用します。
- 200秒の照射時間のためにダウンして面取りカスタムメイドの光ファイバを用いた照射ゾーンを照射します。 4ミリメートルの半径0.2 cm 2のように、各ゾーンの面積を測定します。
- 200秒の照射期間中に20秒ごとに照射ゾーン上に0.1％のデキストランフリーリボフラビン-5-リン酸を含む光増感液を適用します。
注：2外科医によって同時に照射し、リボフラビンの落下を実行します。 - 繰り返しは、4つの眼球の象限のそれぞれについて、3.1から3.4を繰り返します。
4.外科＃1 - ポストクロスリンクステップ
- 目の周りの毛を剃ります。手術用眼科用ハサミを使用して、蓋余白をトリミングした後、静かに、上部および4-0編んだシルクアイボリー色を使用して、下まぶたを縫合 - 3/8円の再詩最先13ミリメートルの長さC-3針（瞼板縫合）。手順（クロラムフェニコール5％）の終了時に眼瞼縁に眼軟膏の少量を適用します。
5.外科＃1 - 術後ケア
- リカバリ中に加熱ランプの下で動物を保管してください。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。
- それは完全に回復するまで、新しい寝具付きの清潔なケージに動物を置きます。回復後、動物は動物室に返されます。ときにだけ目を覚まし、彼の母に動物を返します。
- 最初の48時間の間に、一般的な症状や病気や感染症の兆候について動物を調べます。ウサギの行動の変化が観察されている場合は、必要に応じて、セクション1の管理鎮痛ごとに鎮痛を管理します。 （メタミゾールは、50mgの/キロごとに6時間をドロップ）。
6.手術＃2
- 五十五日の後にurgery＃1は、計量し、塩酸ケタミン100 mg / mlで（100mg / kg）およびキシラジン塩酸塩25 mg / mlで（12.5ミリグラム/キログラム）の筋肉内注射をウサギに麻酔します。
- 眼科手術用顕微鏡下手術用眼科用ハサミを使用して、瞼板縫合を削除します。超音波A-スキャナーを使用して（0.4％オキシブプロカイン塩酸塩）局所麻酔の後、それぞれの目には3つの軸方向の長さの測定を実行した後、測定値を平均します。角膜中央に垂直にプローブを適用します。
- 腹腔内フェノバルビタールナトリウム（200 mgの/ 1.5 kg体重）でウサギを安楽死させます。
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Representative Results
図1及び図 2は、図式2群の軸方向長さの測定を示します。左眼が（ 図1）上で動作されなかったグループ1のウサギは、右眼の上強膜の架橋と瞼板縫合を施行しました。左眼が（ 図2）上で動作されなかったグループ2のウサギは、右眼にのみperitomyと瞼板縫合を施行しました。
強膜架橋と瞼板縫合を受けたグループ1では、右眼の軸方向の長さを意味する3.61±0.76ミリメートルの平均差のために、±0.3ミリメートル55日後にまぶた縫合糸と14.29の前に10.68±0.74ミリメートルを測定しました。 unsutured /無操作左目で対応する値は4.44±0.81ミリメートル（ 図1）の平均差のために、10.70±0.79ミリメートルと15.14±0.32ミリメートルでした。縫合の軸方向の長さの比較そして、閉塞期の終わりunsutured目を縫合目においてより少ない正味の増加を明らかにしました。
のみperitomyとtarsorrhaphies受けたグループ2では、右眼の軸方向の長さを意味は、5.19±0.85ミリメートルの平均差のために、後でまぶた縫合前に10.50±0.67ミリメートルと15.69±0.39ミリメートル55日を測定しました。 unsutured /無操作左目で対応する値は4.20±0.67ミリメートル（ 図2）の平均差のために、10.54±0.71ミリメートルと14.74±0.38ミリメートルでした。閉塞期の終わりに縫合し、unsutured目の軸方向の長さの比較は、縫合目に大きい純増加を明らかにしました。
グループ2（5.19±0.85ミリメートル）とグループ1（3.61±0.76ミリメートル）との間に右眼の軸方向の長さの平均変化の比較は閉塞pの終了時に有意に低い値が得られました長谷架橋手続きた（p <0.001、ノンパラメトリックマンホイットニー検定）を受けた目で（55日）。左眼（4.20±0.67ミリメートル対4.44±0.81ミリメートル）の平均軸方向の長さは群間差は（P = 0.39、マン - ホイットニーノンパラメトリック検定）統計的に有意ではなかったです。
図 1。軸方向の測定左目軸測定対強膜架橋および瞼板縫合前後の右目。強膜の架橋及び瞼板縫合（RE開始）と瞼板縫合を除去した後の55日後（RE側）の前に、右眼の軸方向の長さを意味します。ベースライン時に左目の平均軸方向の長さ（LEが起動）し、55日後（LE端）。左目は操作されていなかったし、開いたままにしました。エラーバーは平均の標準誤差を示します。 （permissioで再印刷n個の参照27）から。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 2。前と左眼軸測定対瞼板縫合した後、右眼軸測定が。軸瞼板縫合（RE開始）の前に右目の長さと55日後に瞼板縫合の除去（RE端）の後を意味します。ベースラインでの左眼の軸方向の長さを意味する【選択左目は上で動作しなかったし、開放された（LEが起動）し、55日後（LE端）。エラーバーは平均の標準誤差を示します。 （参照27からの許可を得て再印刷）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。。
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Discussion
我々は、リボフラビンおよびUVA照射で架橋技術を使用して、ウサギモデルで軸性近視の防止のインビボ試験の最初の提示します。別の実験動物は、研究のこのタイプに使用することができるが、我々は、目の大きさや強膜表面に架橋を行う必要のほとんどによるウサギを選択しました。
私たちは、ウサギの強膜を露出し、手順に挑戦する上下のまぶたを縫合することがわかりました。私たちは、蓋の縁をトリミングし、まぶたがしっかりと修正を必要とせずに一定期間のため閉鎖されていることを確認するために私たちのプロトコルに記載された縫合糸を使用することをお勧めします。
考慮すべき重要な点は、照射装置と、必要な電力エネルギーのための光ファイバを校正する必要があることです。
H＆E組織学的スライドは、架橋手順を施し、目の網膜に毒性変化がないことを明らかにしました。さらなる調査は、位置、エネルギー量および露光時間に焦点を当て、網膜、脈絡膜と強膜上リボフラビンおよびUVA照射の潜在的な毒性に対処するために行われるべきです。
この研究のワラント対価のいくつかの制限。術前および術後の軸方向長さのみを測定しました。眼球の軸方向長さは、スキャン超音波で測定しました。私たちは、バイオメトリック特性、屈折分析または強膜の生体力学的特性を評価しませんでした。
まとめると、我々は、ウサギの眼の軸方向伸長にリボフラビンおよびUVAと強膜架橋の効果は、近視の研究にプラスの影響を与えることになると思います。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Acknowledgments
著者らは、実験室でのプロと優れた技術的な仕事のために氏ダリアセラ氏えみシャロンに感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-0 braided silk non-needled sutures | ETHICON | W193 | |
| 4-0 braided silk ivory color | ETHICON | W816 | |
| 0.1% dextran-free riboflavin-5-phosphate 1 mg:1 ml | Concept for Pharmacy Ltd | D2-5025 | |
| UV A (370 nm) light source | O/E LAND Inc | NCSU033B | |
| Beveled down custom made fiber optic | Prizmatix Ltd | ||
| 26 G lacrimal cannula | Beaver-visitec International Ltd. | REF581276 | |
| 25 G tapered hydrodelineator [Blumenthal] | Beaver-visitec International Ltd. | REF585107 | |
| 13 days old rabbits | Harlan | 1NZWR40 | |
| Ultrasonic biometer | Allergan-Humphrey | 820-519 | |
| Skin marker | Devon | 4237101664X |
References
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