Summary
Den automatiserede sporingssystem Flywalk bruges til høj opløsning kvantificering af lugt-styrede adfærd i Drosophila melanogaster.
Abstract
I deres naturlige miljø, insekter såsom eddike flyve Drosophila melanogaster bliver bombarderet med en enorm mængde af kemisk forskellige lugtstoffer. For at komplicere tingene endnu mere, de lugte registreres af insekt nervesystem normalt ikke enkelte forbindelser, men blandinger, hvis sammensætning og koncentrationsgrad varierer. Dette fører til en næsten uendelig mængde af forskellige olfaktoriske stimuli, der skal vurderes af nervesystemet.
For at forstå, hvilke aspekter af en lugt stimulus bestemme dens vurdering af fluen, er det derfor ønskeligt at effektivt at undersøge lugt-styrede adfærd over for mange lugtstoffer og lugt blandinger. Til direkte korrelere adfærd til neuronal aktivitet, bør adfærd kvantificeres i en tilsvarende tidsramme og under identiske stimulus betingelser som i neurofysiologiske eksperimenter. Men mange i øjeblikket anvendes olfaktoriske bioassays i Drosophila neuroetologi er temmelig specialized enten mod effektivitet eller mod opløsning.
Flywalk, en automatiseret lugt levering og tracking system, bygger bro mellem effektivitet og opløsning. Det tillader bestemmelsen af, præcis hvornår en lugt pakke stimuleret en frit vandre flue, og at bestemme de animal's dynamiske adfærdsmæssige reaktion.
Introduction
Det overordnede mål for enhver neuroethological forskning er at fastslå en årsagssammenhæng mellem aktiviteten stater i enkelte neuroner eller neuronale kredsløb og opførsel af en organisme. For at nå dette mål neuronal aktivitet og adfærd bør overvåges under identiske stimulus betingelser, og disse stimulus betingelser bør ideelt set være lig dem nervesystemet under kontrol udviklet sig til at få mening ud af. Især når det kommer til adfærdsmæssige bioassays, har disse krav historisk bevist ganske krævende i Drosophila melanogaster olfaktoriske neuroetologi.
Når frigivet fra kilden, lugt forureningsfaner hurtigt bryde op i tynde filamenter med turbulent diffusion forårsaget af luft bevægelse er den vigtigste faktor for lugt fordeling 1. Som et resultat, et insekt navigere mod en lugt kilde oplever intermitterende stimulering med lugt pakker blandet med variable intervaller på ren luft. Beggegåture og flyvende insekter - herunder Drosophila - er blevet påvist denne intermitterende stimulation ordning til navigation til at udnytte ved bølgende vindretningen på røgfanen møde og overvejende bevæger sidevind i fravær af lugt 2 - 5. Ud fra følgende betragtninger stimulering procedurer i fysiologiske eksperimenter stort set efterligne dem et insekt kan opleve i sit naturlige miljø ved enten leverer enkelte pust af lugte afbrudt af længere perioder ren luft eller dynamiske stimulation sekvenser 6 - 11, mange adfærdsmæssige bioassays, der anvendes i Drosophila neuroetologi såsom fælde assay , open-field arenaer eller T-labyrint stole på lugt-gradienter 12 - 15. Men fordi lugt gradienter per definition er variable i koncentration afhængigt af afstanden fra kilden lugt, en bestemt adfærd kan ikke tilskrives en præcis lugt koncentration ved hjælp af disse paradigmer. Hertil kommer, at hældningen afen lugt gradient kritisk afhænger de fysisk-kemiske egenskaber af lugtstof. En gradient af en meget flygtig forbindelse vil være fladere end det er skabt af en mindre flygtig forbindelse og dermed også sværere at spore for en organisme at forlade sig på at måle koncentrationsforskelle i rummet som det eneste middel til navigation 16-20, hvilket kan føre til en fejlfortolkning af olfaktoriske præferencer særligt i valg-analyser. Denne effekt er også stor skade, når de efterforsker adfærd over lugt blandinger fordi det fører til forskellige blend komponent nøgletal på hvert punkt i rummet, og derfor igen til hinder for en klar sammenhæng mellem fysiologi og adfærd.
Mens eddike fluer tendens til at aggregere på gærende frugt, de er ensomme i deres navigation i retning fødekilder og æglægning websteder. Ikke desto mindre, snarere end at teste individuelle dyr mange adfærdsmæssige paradigmer anvendt i Drosophila neuroetholoGy undersøge lugt-styrede adfærd kohorter af fluer og tiltrækning er scoret som den del af fluer vælger lugten over en kontrol stimulus. Disse kohorte eksperimenter har i høj grad bidraget til forståelsen af flue neuroetologi og mange af de bemærkninger, som bruger dem kunne bekræftes i single-flyve eksperimenter. Imidlertid er det blevet observeret, at fluer kan påvirke hinandens beslutning 21 og i ekstreme tilfælde evalueringen af en lugt kan skifte fra ligegyldighed til unddragelse afhængigt af befolkningstætheden 22. Derudover resultater fra disse typer af eksperimenter giver ofte kun slutpunktet for en sekvens af adfærdsmæssige beslutninger snarere end at observere, hvad fluen gør mens det gør det, som ville være ønskelig, når de forsøger at korrelere adfærd med neuronal aktivitet. Disse temmelig lav opløsning kohorte eksperimenter kontrasteres af høj opløsning enkelt flyve metoder såsom bundne flyvning arenaer og løbebånd, som tilladerfor en direkte observation af adfærdsmæssige reaktioner på tidspunktet for stimulus præsenteres 20,23,24. Ikke desto mindre, kohorte eksperimenter er stadig populære, fordi de er meget effektive og giver robuste resultater, selv ved forholdsvis lav stikprøvestørrelser fordi inter-individuelle og inter-trial variabilitet er delvist gennemsnit ud på grund af observation af befolkninger i længere tid ad gangen. Mens tøjret flyvning og løbebånd sandsynligvis give guldstandarden om stimulus præsentation og tidsmæssige opløsning er de arenaer, der anvendes designet til enlige dyr, og det er derfor tidskrævende at få prøven størrelser nødvendigt for en statistisk analyse. Adskillige andre fremgangsmåder er for nylig blevet udviklet, der tillader en effektiv erhvervelse af høj opløsning adfærdsmæssige data i kombination med en veldefineret stimulus regime. Disse omfatter ukontrollerede 3D-sporing af flere eddike fluer i et vindtunnel i kombination med en nøjagtig 3D-model af lugt plume 5 25 og Flywalk paradigmet 26.
I Flywalk, er 15 individuelle fluer beliggende i små glasrør og løbende overvåges af en overhead kamera under røde lys. Lugte tilsættes til en kontinuerlig luftstrøm på 20 cm / sek og rejser gennem glasrør med en konstant hastighed. Luftstrømmen er befugtet ved at føre det gennem 250 ml flasker med destilleret vand (befugtere) inden de kommer ind lugt delivery system. De flies' positioner registreres i et kvadrat område af interesse (ROI) omfatter det meste af længden af lugt rør (bortset fra de ydre kanter af rørene (ca. 5 mm i hver side), hvor fluerne ikke kan bevæge sig yderligere op- eller vindretningen) omkring tidspunktet for lugt præsentation (figur 1A, B). Fly identiteter holdes konstant ved tracking system throughout eksperimentet på grundlag af Y-positionerne deres (dvs. deres glasrør grænser). Lugt stimulation opnås ved anvendelse af en multi-komponent stimulus anordning, som tillader præsentation af op til 8 enkelt lugte og alle mulige blandinger deraf 26,29 (figur 1B). Forløbet af et eksperiment styres af en computer regulere lugt leveringssystem og opsamling temperatur og luftfugtighed (computer 1, figur 1C). Computeren styrer også en datalogger (start / stop optagelse) på en anden computer, som kontinuerligt spor flyve positioner ved 20 billeder pr sek (computer 2). Flyv positioner, lugt ventil status (dvs. tid-punkt for ventil åbning), lugt-id, temperatur og fugtighed omkring lugt stimuleringscykler er logget på computeren 2. På denne måde oplysninger om lugt og flyve positioner synkroniseres og eksporteres som .csv-filer, som kan bearbejdes yderligere og analyseret under anvendelse specialfremstillede skriftlig analyse rutiner. Fordihele systemet er computerstyret, er det ikke nødvendigt menneskelig intervention i en eksperimentel session.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Konstruktionen og tekniske detaljer i Flywalk er blevet beskrevet andetsteds 26 (i tilfælde af eventuelle problemer med oprettelse af dette sæt op, yderligere oplysninger kan fås fra MK). Her fokuserer vi på detaljerede instruktioner om håndtering af paradigme, der vil bidrage til at opnå pålidelige resultater.
1. Fly Håndtering
- Rear flyver i lav til medium kulturer densitet på fødevarer medium 27 under en 12 timer: 12 timer lys: mørke regime ved 23-25 ° C og 70% relativ fugtighed. Med henblik herpå tillade 20-30 nyopstået voksne fluer at reproducere i en stor hætteglas mad til 1 uge, derefter skille voksne fluer og vente på afkom at dukke op.
- Saml 30-40 nyligt opstået (alder <24 timer) voksne fluer og alder dem i ny et hætteglas indeholdende mad medium 27 i 3-5 dage.
- Fireogtyve timer før starten af den adfærdsmæssige forsøg: Overfør hele 30-40 tidligere indsamlede 3-5 d gamle (se 2.2) flyver til en ny VIal indeholdende et fugtigt skumgummi stik eller en fugtigt filtrerpapir ved anvendelse af en aspirator.
BEMÆRK: Du må ikke bedøve fluer ved hjælp af CO 2.
2. Forberedelse af Flywalk Setup
- Brug 250 ml flasker som befugtere. Fyld befugtere med 100 ml destilleret vand.
- Forbered lugt hætteglas.
- Forbered 500 pi 10 -3 fortyndinger af den rene lugt ethylacetat, ethylbutyrat, isopentyl acetat og 2,3-butandion i opløsningsmidlet mineralolie.
- Vedhæft to kugle kontraventiler pr lugt hætteglas. Bemærk, at kontraventiler tillader ensrettet kun luftstrøm. Derfor tilslutte kontraventiler på en sådan måde, at luft kan komme ind i hætteglasset på den ene side og lade det på den anden side.
- Fjern låget på en 200 pi PCR-reaktionsrør. Tilsæt 100 pi af hver lugt fortynding i et separat reagensglas og placere rørene i separate hætteglas lugt. Også forberede en lugt hætteglas med kun opløsningsmiddel mineral OIl.
- Tæt forsegle lugt hætteglas ved at lukke dem ved hjælp af rustfrit stål stik og gummipakninger.
- Forbind 5 lugt hætteglas (4 indeholder lugt og 1 indeholder mineralolie) til lugt leveringssystem. Sørg for at forbinde dem i den rigtige flowretning. En forkert forbindelse vil ikke kun skade den planlagte forsøg, men det kan også forurene leveringssystem.
- Kontroller for lækager ved at forsegle udløbet af blandekammeret af stimulus enheden. Sørg, at alle luftstrømme før stimulus enheden nu gradvist falde til nul. Hvis ikke, så tjek for utætheder som nu kan identificeres ved den hvislende lyd af luft forlader systemet.
- Overføre forsigtigt 15 individuelle fluer til 15 individuelle glasrør hjælp en aspirator og tæt glasrør på begge sider ved hjælp af de tilsvarende adaptere.
Bemærk: Da systemet skal hermetisk forseglet for vellykkede eksperimenter, at adaptere passer glasrør stramtog bemærk, at glasrør kan knække under dette trin. Vær omhyggelig med at undgå skader ved at bære beskyttelseshandsker og beskyttelsesbriller. - Tilslut rør til Flywalk setup og fra her på, vente mindst 15 minutter, før du starter eksperimentet at tillade fluer at vænne til det nye miljø.
- Efter fastgørelse glasrør: kontrollere udlæsning af de nedstrøms digitale flowmålere på computer 1, hvis de 16 luftstrømme efter glasrørene tilføje op til luftstrømmen ind i systemet. Du kan også læse på computer 1, hvis luftfugtigheden er mellem 60% og 80%.
- Design stimulus protokol styrer rækkefølgen og timingen af lugt stimuli præsenteret for fluerne. For at opnå f.eks de beskrevne data, der er til stede 4 lugt og kontrol (mineralolie) enkeltvis og alle mulige ternære og kvaternære blandinger af lugte samtidigt til 40 gange hver. Indstil pulsvarighed til 500 msek ved en interstimulus interval på 90 sek og randomisere stimulus sekvensen.
- Tænd for liGHT kilde (LED-klynge, λ = 630). Sørg for at give nok lys til effektiv sporing uden at øge temperaturen inde i glasrør.
- Oprette et område af interesse af sporingssystemet ved at trække en ramme hele området, der skal overvåges på en sådan måde, at alle 15 glasrør er inkluderet og ca. 5 mm af kanterne af rørene er udelukket.
- Opsætning 14 parallelle adskillelse linjer mellem de enkelte rør i tracking system ved at ændre deres Y-positioner i den tilsvarende script til at holde enkelte fluer identificeres i hele forsøget. Sørg for at placere dem på en sådan måde, at der altid er én glasrør mellem to sådanne separator linjer, fordi kun én flue vil blive sporet mellem ethvert sæt af to linjer.
- Sørg for at indstille kameraets parametre på en sådan måde, at fluer er pålideligt spores hele glasrør. Hvis fluer er tabt ved kanterne af området af interesse, øge lysstyrken eller gevinst på tracking software. Undgå mekaniske vibrationer af sporingssystemet. Spor bruge kommerciel software i henhold til producentens protokol.
- Start eksperiment ved at starte stimulus protokollen. Optag flies' XY-koordinater ved 20 fps (frames per sekund) og log i kombination med lugt ventil status i tekstfiler.
3. Data Analysis
BEMÆRK: Følgende trin i analysen data automatiseres ved hjælp af specialfremstillede skriftlige rutiner programmeret i R. Da disse trin er afgørende for at opnå meningsfulde resultater analysen vil ikke desto mindre blive præsenteret i en trin-for-trin måde. De rå data for analysen er .csv-filer, der indeholder synkroniserede oplysninger om lugt ventil status, puls nummer i eksperimentet og 15 flyve x-positioner i cm på en fælles tidsakse for en lugt stimulation cyklus. Brugerdefineret kode til dataanalyse kan leveres efter anmodning.
- Åbent .csv-fil, finde tid-punkt for ventilåbning indikeres med en chaNSÆ i kolonnen repræsenterer ventilen status.
- Beregn den lineære funktion af lugt stilling form
f (t) = s * t + i
hvor t er tiden i stimulationscyklus, s er vindhastigheden (her 20 cm / sek) og skæringspunktet I kan beregnes ved hjælp af tid-point lugt trænger ind i rørene ved position 0 (ventilåbning plus forsinkelse). - Finde tid punkt, hvor lugt og flyve X-positionen skærer for hver flyve og indstille denne tid-punkt til 0. Bemærk: På denne måde flyve positioner er afstemt til hver individets møde med lugt.
- Udeluk fluer sidder ved selve kanterne af området af interesse.
- Beregn hastigheden fra X-positioner ved at dividere forskydning langs x-aksen ved tidsintervallet (100 ms), og gentag procedure for hver stimulationscyklus.
- For at opnå hastighed tid-kurser som vist i figur 2E beregne gennemsnitshastigheden Tidsforløbet for hver flue og lugt og fra dem middelværdien tidsforløbet for en given lugt.
- For at opnå netto forskydning som vist i figur 3C beregner netto forskydning inden 4 sek efter lugt puls for hver sporing begivenhed og bagefter den gennemsnitlige netto- forskydning pr flue og lugt.
4. Rengøring Procedure
- Rene glasrør
- Fjern fluer og adaptere fra glasrør og suge glasrør i vaskemiddel.
- Skyl glasrør under rindende destilleret vand og tør dem ved hjælp af trykluft.
- Heat glasrør ved 200 ° C i 8 timer.
- Ren Lugt Delivery System
- Fjern alle lugt hætteglas og slanger fra den centrale blanding kammer.
- Fjern slange adaptere fra blandekammeret.
- Ren blandekammer ved at skylle den med laboratorie rengøringsopløsning og opløsningsmidler (f.eks ethanol, acetone). Udfør disse trin under laboratoriets hætte.
- Tør blandekammer ved hjælp af trykluft og varme det ved 200 ° C i 8 timer.
- Ren Lugt Vials og Spærreventiler
- Fjern stål plug (discard gummipakning), og kontraventiler fra lugt- hætteglas og suge alle komponenter i laboratoriet rengøringsmiddel.
- Soniker komponenter i et ultralydsbad og skyl dem med destilleret vand.
- Rengør alle komponenter undtagen kontraventiler med ethanol og acetone. Udfør disse trin under laboratoriets hætte.
- Tørre komponenter ved hjælp af trykluft og varme dem ved 200 ° C i 8 timer.
- Clean kontraventiler på indersiden ved at skylle dem med ethanol og acetone ved hjælp af en sprøjte (overveje flowretningen). Udfør disse trin under laboratoriet hætte iført laboratorium beskyttelsesbriller. Fordi acetone angriber gummidele, straks tørre kontraventiler ved at skylle dem med trykluft.
- Fjerne resterende lugte ved pulsering luft gennem kontraventiler i flere dage. Brug en inkubator ved 60 ° C og en 1 sek luft på / 1 sek luft off ordning for denne rensetrin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fordi fluer får lov til at distribuere frit inden for deres glasrør mellem lugt bælgfrugter og lugt impuls bevæger sig gennem rør med en konstant hastighed fluer støder lugt på forskellige tidspunkter afhængig af deres X-stillingen på tidspunktet for stimulering. Som følge heraf er de indledninger af vindretningen baner fremkaldt af en 500 msek puls af en attraktiv 10 -3 fortynding af ethylacetat forsinket med ca. 1 sek fluer på vindretningen slutningen af deres glasrør sammenlignet med dem af fluer sidder tættere på den vindretningen ende ved en vindhastighed på 20 cm / s og 20 cm glasrør længde (figur 2A). Korrektion for den tidsmæssige forskel i lugt oplevelse for hver enkelt baseret på dens x-position på tidspunktet for lugt præsentation afslører, at respons forsinkelser i retning af ethylacetat er konsistente på tværs af individer (figur 2B).
Tilsvarende er den gennemsnitlige vindretningen bane uden korrektion for odor rejser forsinkes med ca. 0,5 sek sammenlignet med den gennemsnitlige bane med korrektion (figur 2C, bemærkes, at korrektion for tiden lugt skal indtaste vindretningen ende af glasrør blev udført for begge baner). Hertil kommer, at middelværdi vindretningen forløb for en enkelt impuls lugt viser også en større hældning (dvs. en højere ganghastighed) end den ukorrigerede en (figur 2D). Svarende til observationerne for en enkelt lugt puls, udelade korrektionen for lugt rejse fører til en øget forsinkelse og lavere respons amplitude i en komplet datasæt bestående af to eksperimentelle sessioner (dvs. 30 fluer) med 40 præsentationer af lugt pulser hvert (Figur 2E) .
Gentagen stimulering med 500 msek impulser af attraktive 10 -3 fortyndinger af ethylbutyrat (ETB), isopentyl acetat (IAA), ethylacetat (ETA) og 2,3-butandion (Bedn) fremkalder vindretningen overspænding på odeller støder på sultede kvindelige fluer, mens stimulation med opløsningsmidlet mineralolie (MOL) fremkalder ingen eller kun svage reaktioner. Mekanisk stimulering alene har tidligere vist sig at inducere øget bevægelse i en tilsvarende paradigme 28. Men fordi lugt stimulering i Flywalk paradigme ikke ændrer den samlede luftstrøm og øget bevægelse er for det meste fraværende i kontrolgruppen situationen ved hjælp af MOL, disse vindretningen overspænding afspejle sande lugt svar. Mean responstid-kurser er stereotype på tværs af individer (figur 3A) og lugt-specifik i latenstid, amplitude og varighed (figur 3A, B). Reaktionerne på ethylacetat vise en skarp indtræden, høj amplitude og en kort varighed. I modsætning hertil reaktioner på 2,3-butandion typisk vise en lidt senere indtræden, en lavere amplitude og en længere varighed. Ethylbutyrat og isopentyl acetat fremkalde tilsvarende tidsmæssig dynamik såsom ethylacetat, men responser er lavere i amplitude. Correspondingly, alle 4 lugte fremkalde en højere vindretningen forskydning inden 4 sek efter lugt støde end den opløsningsmidlet og negativ kontrol mineralolie (figur 3C).
Anvendelse af de samme 4 tiltrækningsmidler, blev det tidligere vist, at binære blandinger af lokkemidler er mindst lige så attraktive som de mere attraktive bestanddel i blandingen 29. Her er denne observation udvides ved at teste alle mulige ternære blandinger og den fulde blanding af alle 4 lokkemidler. I lighed med den tidligere observation med binære blandinger, alle disse mere komplekse blandinger er mindst lige så attraktive som den mest attraktive enkelt forbindelse (figur 4A). De mest attraktive blandinger er dem, der indeholder både ethylacetat og 2,3-butandion. Svar på disse 3 blandinger ikke afviger væsentligt fra hinanden og også svaret kinetik er slående lignende (figur 4A, B). I modsætning hertil udelade ethylacetat fra den fulde Blend fører til et fald i den maksimale vindretningen hastighed, mens udeladelse 2,3-butandion forkorter respons (figur 4C). Fordi ethylacetat fremkalder korte høj amplitude respons mens 2,3-butandion fremkalder reaktioner lavere amplitude, men længere varighed (figur 3B, 4D), disse iagttagelser er minder om vores tidligere fund, at svarene time-kurser i retning af blandinger af lokkemidler tendens til følge en optimal responstid-kursus oprettet fra blend konstituerende responstid-kurser 29. I dette datasæt kan konstrueres optimum alle 4 lokkemidler på grundlag af responstid-kurser retning ethylacetat og 2,3-butandion. Ethylbutyrat og / eller isopentyl acetat er nødvendige ud over at nå den maksimale ganghastighed observeret i svar i retning af fuld blanding (figur 4D). Derfor er stigningen i blandingen kompleksitet fra 2 til 3 eller 4 komponenter øger tiltrækningskraft af blandingen eHven videre end hvad man kunne forvente fra den tidligere observation, at svarene i retning blandinger af lokkemidler repræsenterer en optimal af svarene i retning blandingen vælgere. Ikke desto mindre er den generelle konklusion, at konstituerende valens er bevaret i lugt- blandinger stadig gyldig også for disse mere komplekse blandinger 29.
Figur 1. Princip og layout af Flywalk setup. (A) Skematisk tegning af princippet. Gule firkant: lugt stimulus bevæger sig gennem røret og resulterer i vindretningen bevægelse af fluen; sort objekt: kamera til at spore adfærdsmæssige reaktioner. (B) Skematisk af luftstrømmen gennem opsætningen med kul-filtreret luft befugtes og opdelt i 8 kanaler, inden de kommer ind lugt levering systemet 26,30. Blow-up Figur: 1, tre-vejs magnetventil pass ing luftstrømmen enten gennem en tomme hætteglas (C; kompenserende flow) eller gennem et hætteglas indeholdende lugt kilden (o; lugt flow); 2, kuglekontraventiler at begrænse luftstrømmen i den ene retning og for at undgå forurening systemet; blandekammer: specialbygget kasse, der samler luft fra alle magnetventiler og overførsler til at splitte op bord, hvor luften er delt i 15 glasrør fyldt med individuelle fluer og 1 rør er udstyret med temperatur og luftfugtighed sensorer. Bemærk: flow regulatorer og flowmålere efter glasrør garanterer ens flow i alle rør. Blå firkant betegner region af interesse (ROI) i tracking system. (C) Skematisk af informationsstrømmen mellem sporing kamera, sporing computer og lugt delivery system. Klik her for at se en større version af dette tal.
OAD / 53394 / 53394fig2.jpg "/>
Figur 2. Procedure og rationalet bag dataanalyse. (A) Individuelle fluer støde lugt i forskellige positioner og derfor forskellige tidspunkter. Venstre panel: Skematisk af mulige flyve positioner på tidspunktet for lugt ventil skifte. Højre panel: Rå data af x-positioner af 15 fluer omkring præsentationen af en 500 msek puls af en 10 -3 fortynding af ethylacetat. Bemærk vindretningen ture af individuelle fluer på forskellige tidspunkter afhængig af deres x-positionerne. Venstre stiplet linje: tidspunkt for lugt ventil skifte. Lugt støde af individuelle fluer forskydes med et system-iboende forsinkelse for lugt at nå glasrør (d) og vindhastigheden (w). Derfor er lugt støder beregnes individuelt for hver flue baseret på dens x-position. Nederst til højre: linie x-positioner af de 15 fluer (grå), og betyder X-position (fed sort). (B) samme data som i A, men korrigeret for forsinkelse og vindhastighed. BottOM: justeret x-positioner af de 15 fluer (grå), og betyder X-position (fed rød) efter korrektion. (C) Sammenligning af gennemsnitlige vindretningen fremskridt på 15 fluer fremkaldt af en 500 msek puls ethylacetat med og uden korrektion for lugt rejse. Bemærk, at den ukorrigerede (sort) spor korrigeres for forsinkelsen, men ikke for lugt rejse. (D) Mean vindretningen hastighed på 15 fluer fremkaldt af en 500 msek impuls ethylacetat med og uden korrektion for lugt rejser. Stiplede linjer angiver hastigheden beregnet ud fra vindretningen fremskridt værdierne i C, dristige linjer vise vindretningen hastighed efter udjævning ved hjælp af en 1. orden 9-punkts Savitzky-Golay-filter. (E) Ufiltreret betyde vindretningen hastighed med og uden korrektion for lugt rejse i 30 fluer og 40 pulser af ethylacetat hver (dvs. et komplet datasæt). Klik her for at se en større version af dennefigur.
. Figur 3. Eksempel svar for 10 -3 fortyndinger af 4 attraktive lugte (A) Farvekodede gennemsnitlige responstid-kurser af 30 individuelle fluer til 500 msek pulser af 4 lokkemidler og opløsningsmidlet mineralolie (MOL; ETB: ethylbutyrat; IAA: isopentyl acetat; ETA: ethylacetat; Bedn: 2,3-butandion). Hver række repræsenterer den gennemsnitlige respons tidsforløbet for en enkelt flue. Hver flue blev præsenteret med hver lugt i 40 gange, og - fordi fluer får lov til at distribuere frit og kan efterlade området af interesse for tracking system - betyder responstid kurser er beregnet ud fra alle komplette baner Per Fly (n = 7-39 baner Per Fly og lugt). Gul bjælke repræsenterer lugt puls. (B) Svartid-kurser til 4 lokkemidler og opløsningsmidlet mineralolie (n = 30 fluer; middelværdi+/- SEM). (C) Net vindretningen forskydning inden 4 sek efter lugt støder (samme data som i (A) og (B), n = 30 fluer). Fyldte felter angiver statistisk signifikant vindretningen bevægelse i forhold til den negative kontrol mineralolie (p <0,05, Wilcoxon signed rank test). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Svar retning ternære og kvaternære blandinger af tiltrækningsmidler. (A) Netto vindretningen forskydning for 4 lokkemidler og alle ternære og kvaternære blandinger heraf sorteret efter deres median respons. Forskellige bogstaver angiver statistisk signifikante forskelle mellem reaktioner (p <0,05; Kruskal-Wallis rangsumtest og post hoc Wilcoxon signed rank test, n = 30fluer). Sort boks nedenfor viser blandinger indeholdende ethylacetat og 2,3butanedione. (B) Reaktionstid-kurser af blandinger indeholdende ethylacetat og 2,3-butandion (gennemsnit +/- SEM, n = 30 fluer). Bemærk lignende respons-kinetik. (C) Sammenligning af responstid-kurser af blandinger uden ethylacetat eller 2,3-butandion og respons kinetik fremkaldt af den fulde blanding (gennemsnit +/- SEM, n = 30 fluer). Bemærk lavere amplitude uden ETA og kortere respons uden Bedn. (D) Sammenligning af optimal tidsforløbet (stiplet) konstrueret fra ETA (rød) og Bedn (grøn) og den fulde blanding. Nuancer angiver dele af tidsforløbet forklares ved forskellige blanding vælgere. Bemærk, at det er blevet påvist i en tidligere undersøgelse, reaktioner overfor binære blandinger af lokkemidler kan forudsiges ud fra en optimal tidsforløbet skabt på grundlag af bestanddel i blandingen tid-kurser 29. Denne optimale tidspunkt-kursus for ETA og Bedn er vist som enstiplet linje. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selvom Flywalk systemet vises temmelig sofistikeret ved første øjekast, når sat op og køre det er let at bruge og giver meget robuste resultater. At understrege sammenhængen i de resultater, der produceres med bioassay kan det siges, at de repræsentative resultater er vist her blev opnået næsten 2 år efter, at nogle af resultaterne er vist i en tidligere undersøgelse 29 med en modificeret opsætning ved hjælp af en ny tracking software og lyskilde. Ikke desto mindre tiltrækkende svar er - på trods af lidt højere respons amplituder - meget lig dem, der tidligere er offentliggjort vedrørende deres dynamik.
Der er nogle kritiske aspekter, som bør overvejes i særdeleshed for at opnå resultater af høj kvalitet ved hjælp af Flywalk. Er vigtigt, at fugtighed falde til under 60% i løbet af et eksperiment. En typisk eksperimentel session varer cirka 8 timer. Rimelig størrelse kvindelige CS vildtype fluer sultet i 24 timer, før den færdigeeksperimentere nemt overleve i mindst 12 timer i forsøgsopstillingen forudsat luftfugtigheden er høj nok. For at undgå problemer i forbindelse med fugtighed er det tilrådeligt at installere en fugtføler i et tomt glasrør (figur 1B), og at undgå at placere afløbsregulatorer i luftstrømmen sted mellem befugtningsanlæg og glasrør. Det er også helt afgørende for datakvalitet, at systemet er hermetisk forseglet. Luftstrømmene forlader systemet efter glasrørene bør opsummere til luftstrømmen ind i systemet. Mest mislykkede eksperimenter kan tilskrives utætheder i systemet, og stor omhu bør tages før starten af forsøget for at sikre, at systemet er lufttæt. Endelig, som med enhver opsætning anvendes i olfaktoriske forskning, en af de store dagligdags problemer er at undgå forurening. De fleste af de dele, der kommer i kontakt med lugte er lavet af glas, stål, teflon eller PEEK og kan derfor opvarmes til mindst 200 ° C, hvilket er tilstrækkeligt til at fjerne det meste odors undtagen for dem med særligt høje kogepunkter såsom langkædede feromoner. Fordi kontraventiler indeholder gummidele de kan ikke opvarmes så højt, og derfor er den vigtigste kilde til forurening, hvilket er grunden til en særlig rengøring protokol blev udtænkt for dem. Ikke desto mindre, er det tilrådeligt at holde styr på de lugte en bestemt kontraventil er kommet i kontakt med. I tilfælde af tvivl om dens renlighed erstatte det.
Som et kompromis mellem bundne assays og eksperimenter kohorte, Flywalk har selvfølgelig også nogle ulemper i forhold til andre metoder. Paradigmet er meget effektiv, når adfærd over for et væld af forskellige stimuli har skal vurderes og sammenlignes. Især fordi responstiden-kursus over 15 personer til blot én puls af en given lugt stærkt ligner responstid-kurser opnået i et komplet datasæt (dvs. 30 fluer og 40 præsentationer hver, Tal 2D, 2E f.eks hedoniske valens på blot én lugt bør undersøges. Også den tidsmæssige opløsning af visuelle sporingssystemer er ofte lavere end de hurtigste bioassays såsom tøjret flyvning eller løbebånd. De korteste respons forsinkelser rapporteret i Drosophila lugt-styrede adfærd er et godt stykke under 100 msek efter lugt støde i tøjrede paradigmer 20,23, og dermed falder inden for et tidsvindue, som ikke kan løses, når man analyserer dataene ved 10 Hz. Men tiltrækkende reaktioner i Flywalk typisk begynder inden for de første 100-300msek (figur 3B), hvilket er godt i tråd med vindretningen bølge forsinkelser observeret i fritflyvende fluer 5. Det er derfor fortsat skal fastlægges, om denne forskel i respons forsinkelser i tøjrede paradigmer i forhold til vindtunnel og Flywalk skyldes forskelle i den geografiske og / eller tidsmæssig opløsning i visuelle sporing paradigmer eller ved en højere ophidselse tilstand af fluer i tøjret situation.
Sammenfattende Flywalk er en no-valg bioassay, som kombinerer den meget kontrollerede stimulus præsentation af tøjrede analyser med effektiviteten af kohorte eksperimenter regelmæssigt anvendes i Drosophila neuroetologi. Fordi det samme sæt enkeltpersoner kan blive udfordret med et væld af forskellige stimuli, dens særlige styrke ligger i den statistiske effekt, når man sammenligner reaktioner mod forskellige stimuli. Derudover er det udnytter det faktum, at fluer bølge vindretningen ved møde af en attraktiv lugt og på denne måde afkobler lugt evalueringfor lugt kilde lokalisering uden behov for en gradient som retningsbestemt cue. Det bør derfor velegnet til at udnytte optogenetic værktøjskasse tilgængelig i Drosophila.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Daniel Veit til teknisk bistand og Pedro Gouveia på Electricidade Em Po (electricidadeempo.net) for alle tilpasninger tracking software til vores krav. Vi takker også Tom Retzke om støtte under optagelserne processen. Denne undersøgelse blev støttet af Max Planck Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flywalk setup | Custom | details available upon request | |
| stimulus device | Custom | details available upon request | |
| LED cluster | Custom | details available upon request | |
| HD Pro Webcam C920 | Logitech, Lausanne, Switzerland | ||
| 2 Computers | |||
| Flywalk Reloaded v1.0 software | Electricidade Em Pó (electricidadeempo.net) | ||
| Labview 11.0 software | National Instruments, Austin, TX | ||
| Standard fly food | Custom | ||
| Standard fly vials | Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Standard fly vials | Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| aspirator | Custom | ||
| mineral oil | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | ||
| odors | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | ||
| 200 µl PCR reaction tubes | Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germany |
References
- Murlis, J., Elkinton, J. S., Cardé, R. T. Odor plumes and how insects use them. Annu. Rev. Entomol. 37, 505-532 (1992).
- Kennedy, J. S., Marsh, D.
- Budick, S. A., Dickinson, M. H. Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors. J. Exp. Biol. 209 (15), 3001-3017 (2006).
- Buehlmann, C., Graham, P., Hansson, B. S., Knaden, M. Desert ants locate food by combining high sensitivity to food odors with extensive crosswind runs. Curr. Biol. 24 (9), 960-964 (2014).
- Van Breugel, F., Dickinson, M. H. Plume-tracking behavior of flying Drosophila emerges from a set of distinct sensory-motor reflexes. Curr. Biol. 24 (3), 274-286 (2014).
- Schuckel, J., Meisner, S., Torkkeli, P. H., French, A. S. Dynamic properties of Drosophila olfactory electroantennograms. J. Comp. Physiol. A. 194 (5), 483-489 (2008).
- Geffen, M. N., Broome, B. M., Laurent, G., Meister, M. Neural encoding of rapidly fluctuating odors. Neuron. 61 (4), 570-586 (2009).
- Nagel, K. I., Wilson, R. I. Biophysical mechanisms underlying olfactory receptor neuron dynamics. Nat. Neurosci. 14 (2), 208-216 (2011).
- Martelli, C., Carlson, J. R., Emonet, T. Intensity invariant dynamics and odor-specific latencies in olfactory receptor neuron response. J. Neurosci. 33 (15), 6285-6297 (2013).
- Szyszka, P., Gerkin, R. C., Galizia, C. G., Smith, B. H. High-speed odor transduction and pulse tracking by insect olfactory receptor neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (47), 16925-16930 (2014).
- Nagel, K. I., Hong, E. J., Wilson, R. I. Synaptic and circuit mechanisms promoting broadband transmission of olfactory stimulus dynamics. Nat. Neurosci. 18 (1), 56-65 (2014).
- Larsson, M. C., Domingos, A. I., Jones, W. D., Chiappe, M. E., Amrein, H., Vosshall, L. B. Or83b encodes a broadly expressed odorant receptor essential for Drosophila olfaction. Neuron. 43 (5), 703-714 (2004).
- Knaden, M., Strutz, A., Ahsan, J., Sachse, S., Hansson, B. S. Spatial representation of odorant valence in an insect brain. Cell Rep. 1 (4), 392-399 (2012).
- Zaninovich, O. A., Kim, S. M., Root, C. R., Green, D. S., Ko, K. I., Wang, J. W. A single-fly assay for foraging behavior in Drosophila. J. Vis. Exp. (81), e50801 (2013).
- Farhan, A., Gulati, J., Groβe-Wilde, E., Vogel, H., Hansson, B. S., Knaden, M. The CCHamide 1 receptor modulates sensory perception and olfactory behavior in starved Drosophila. Sci. Rep. 3 (2765), 1-6 (2013).
- Flügge, C. Geruchliche Raumorientierung von Drosophila melanogaster. Z. Vgl. Physiol. 20 (4), 462-500 (1934).
- Borst, A., Heisenberg, M.
- Louis, M., Huber, T., Benton, R., Sakmar, T. P., Vosshall, L. B. Bilateral olfactory sensory input enhances chemotaxis behavior. Nat. Neurosci. 11 (2), 187-199 (2008).
- Gomez-Marin, A., Stephens, G. J., Louis, M. Active sampling and decision making in Drosophila chemotaxis. Nat. Commun. 2 (441), 1-10 (2011).
- Gaudry, Q., Hong, E. J., Kain, J., de Bivort, B. L., Wilson, R. I. Asymmetric neurotransmitter release enables rapid odour lateralization in Drosophila. Nature. 493 (7432), 42442-42448 (2013).
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S.
- Ramdya, P., Lichocki, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2014).
- Bhandawat, V., Maimon, G., Dickinson, M. H., Wilson, R. I. Olfactory modulation of flight in Drosophila is sensitive, selective and rapid. J. Exp. Biol. 213 (21), 3625-3635 (2010).
- Duistermars, B. J., Chow, D. M., Frye, M. A. Flies require bilateral sensory input to track odor gradients in flight. Curr. Biol. 19 (15), 1301-1307 (2009).
- Claridge-Chang, A., Roorda, R. D., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
- Steck, K., Veit, D., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction - The Flywalk. Sci. Rep. 2 (361), 1-9 (2012).
- Lewis, E. B. A new standard food medium. Drosoph. Inf. Serv. 34, 117-118 (1960).
- Lebestky, T., Chang, J. S. C., et al. Two different forms of arousal in Drosophila are oppositely regulated by the dopamine D1 receptor ortholog DopR via distinct neural circuits. Neuron. 64, 522-536 (2009).
- Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. Compound valence is conserved in binary odor mixtures in Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 217 (20), 3645-3655 (2014).
- Olsson, S. B., Kuebler, L. S., et al. A novel multicomponent stimulus device for use in olfactory experiments. J. Neurosci. Meth. 195 (1), 1-9 (2011).
