Summary
स्वचालित ट्रैकिंग प्रणाली Flywalk ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में गंध निर्देशित व्यवहार के उच्च संकल्प मात्रा का ठहराव के लिए प्रयोग किया जाता है।
Abstract
उनके प्राकृतिक वातावरण में, इस तरह सिरका के रूप में कीड़े रासायनिक अलग odorants की एक बड़ी राशि के साथ बमबारी कर रहे हैं ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर उड़। आगे भी मामला जटिल, कीट तंत्रिका तंत्र से पता लगाया odors को आमतौर पर जिसका संरचना और एकाग्रता अनुपात भिन्न हो ही यौगिकों लेकिन मिश्रण नहीं कर रहे हैं। यह तंत्रिका तंत्र द्वारा मूल्यांकन किया जाना है, जो विभिन्न घ्राण उत्तेजनाओं की एक लगभग अनंत राशि के लिए होता है।
एक गंध प्रोत्साहन के पहलुओं मक्खी द्वारा अपने मूल्यांकन निर्धारित जो समझते हैं, यह कुशलता से कई odorants और गंध के मिश्रण की ओर गंध निर्देशित व्यवहार की जांच करने के लिए इसलिए वांछनीय है। सीधे neuronal गतिविधि के लिए व्यवहार सहसंबंधी, व्यवहार एक तुलनीय समय सीमा में और neurophysiological प्रयोगों में के रूप में समान प्रोत्साहन की शर्तों के तहत मात्रा निर्धारित किया जाना चाहिए। हालांकि, ड्रोसोफिला neuroethology में कई वर्तमान में इस्तेमाल किया घ्राण bioassays विशेषांक बल्कि रहे हैंदक्षता की दिशा में या समाधान की दिशा में या तो lized।
Flywalk, एक स्वचालित गंध वितरण और ट्रैकिंग प्रणाली, कार्यकुशलता और संकल्प के बीच की खाई को पुल। यह एक गंध पैकेट एक स्वतंत्र रूप से चलने के लिए उड़ान भरने को प्रेरित किया, और animal's गतिशील व्यवहार प्रतिक्रिया निर्धारित करने के लिए वास्तव में जब के निर्धारण की अनुमति देता है।
Introduction
किसी भी neuroethological अनुसंधान के व्यापक लक्ष्य एकल न्यूरॉन्स या neuronal सर्किट की गतिविधि राज्यों और एक जीव के व्यवहार के बीच एक कारण लिंक स्थापित करने के लिए है। इस लक्ष्य को neuronal गतिविधि को प्राप्त करने और व्यवहार समान प्रोत्साहन की शर्तों के तहत निगरानी की जानी चाहिए और इन प्रोत्साहन की स्थिति आदर्श उन लोगों की समझ बनाने के लिए विकसित जांच के दायरे में तंत्रिका तंत्र के लिए समान होना चाहिए। यह व्यवहार bioassays के लिए आता है, खासकर जब इन आवश्यकताओं को ऐतिहासिक ड्रोसोफिला में काफी मांग को साबित किया है घ्राण neuroethology मेलानोगास्टर।
स्रोत से रिहा होने के बाद, गंध plumes तेजी से हवा आंदोलन गंध वितरण 1 का मुख्य निर्धारक किये जाने के कारण अशांत प्रसार के साथ पतली तंतु में टूट गया। नतीजतन, एक गंध स्रोत की ओर से नेविगेट एक कीट स्वच्छ हवा के चर अंतराल के साथ बीच-बीच में गंध संकुल के साथ रुक-रुक कर उत्तेजना का अनुभव करता है। दोनोंचल रहा है और उड़ान कीड़े - ड्रोसोफिला सहित - 5 - odors को 2 के अभाव में पार हवा चलती मुख्य रूप से पंख मुठभेड़ पर आने की दिशा बढ़ती है और द्वारा आवागमन के लिए इस रुक-रुक कर उत्तेजना शासन का दोहन करने के लिए प्रदर्शन किया गया है। इस तरह के जाल परख के रूप में ड्रोसोफिला neuroethology में इस्तेमाल 11, कई व्यवहार bioassays - शारीरिक प्रयोगों में उत्तेजना प्रक्रियाओं जबकि मोटे तौर पर एक कीट स्वच्छ हवा या गतिशील उत्तेजना दृश्यों 6 की विस्तारित अवधि के साथ बीच-बीच odors के लिए या तो उपलब्ध कराने के एकल कश द्वारा अपने प्राकृतिक वातावरण में अनुभव हो सकता है उन नकल 15 -, खुले क्षेत्र एरेनास या टी भूलभुलैया गंध-ढ़ाल 12 पर भरोसा करते हैं। परिभाषा से गंध ढ़ाल गंध के स्रोत से दूरी के आधार पर एकाग्रता में चर रहे हैं क्योंकि हालांकि, एक विशेष व्यवहार इन मानदंड का उपयोग कर एक सटीक गंध एकाग्रता के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। इसके अलावा, के ढलानएक गंध ढाल गंभीर रूप odorant के भौतिक गुणों पर निर्भर करता है। एक गलत व्याख्या करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जो 20, - एक अत्यधिक अस्थिर यौगिक की एक ढाल एक कम अस्थिर यौगिक द्वारा बनाई गई है और इसलिए भी कठिन नेविगेशन 16 का एकमात्र साधन के रूप में अंतरिक्ष में एकाग्रता मतभेदों को मापने पर भरोसा एक जीव के लिए ट्रैक करने के लिए है कि अधिक से उथले होगी विशेष रूप से पसंद assays में घ्राण वरीयताओं की। यह अंतरिक्ष में हर बिंदु पर अलग मिश्रण घटक अनुपात की ओर जाता है और इसलिए फिर से शरीर विज्ञान और व्यवहार के बीच एक स्पष्ट संबंध का निवारण होता है क्योंकि गंध मिश्रण के प्रति व्यवहार की जांच जब इस आशय की भी अत्यधिक हानिकारक है।
सिरका मक्खियों फल fermenting पर कुल के लिए करते हैं, वे भोजन के सूत्रों और oviposition साइटों के प्रति अपनी नेविगेशन में एकान्त हैं। फिर भी, अलग-अलग जानवरों के परीक्षण के बजाय कई व्यवहार मानदंड ड्रोसोफिला neuroetholo में इस्तेमाल कियाGY मक्खियों के साथियों की गंध निर्देशित व्यवहार की जांच करने और आकर्षण एक नियंत्रण प्रोत्साहन खत्म गंध चुनने मक्खियों के अंश के रूप में रन बनाए है। ये पलटन के प्रयोगों मक्खी neuroethology को समझने के लिए बहुत योगदान दिया है और उन्हें प्रयोग द्वारा की गई टिप्पणियों के कई एकल मक्खी प्रयोगों में इस बात की पुष्टि की जा सकती है। हालांकि, यह प्रत्येक other's निर्णय 21 को प्रभावित कर सकते हैं और कई मामलों में एक गंध के मूल्यांकन जनसंख्या घनत्व 22 के आधार पर बचाव के लिए उदासीनता से स्विच कर सकते हैं कि मक्खियों देखा गया है। इसके अतिरिक्त, प्रयोगों के इन प्रकार से परिणाम अक्सर neuronal गतिविधि के साथ व्यवहार सहसंबंधी करने का प्रयास करते वांछनीय होगा जो बल्कि यह है कि यह क्या कर रही है, जबकि मक्खी क्या कर रहा है के अवलोकन से व्यवहार निर्णय, के एक दृश्य की ही समापन बिंदु प्रदान करते हैं। ये नहीं बल्कि कम संकल्प पलटन के प्रयोगों में इस तरह की अनुमति है जो tethered उड़ान एरेनास और treadmills के रूप में उच्च संकल्प एकल मक्खी तरीकों से विषम रहे हैंसमय पर व्यवहार प्रतिक्रियाओं का प्रत्यक्ष अवलोकन के लिए प्रोत्साहन 20,23,24 प्रस्तुत किया है। वे बहुत कुशल हैं और आपस में व्यक्तिगत और अंतर परीक्षण परिवर्तनशीलता आंशिक रूप से समय की विस्तारित अवधि से अधिक आबादी का अवलोकन करने के लिए बाहर औसत रहे हैं क्योंकि मजबूत भी पर तुलनात्मक परिणाम कम नमूना आकार प्रदान करते हैं क्योंकि फिर भी, पलटन प्रयोगों, अभी भी लोकप्रिय हैं। Tethered उड़ान और ट्रेडमिल शायद उत्तेजना प्रस्तुति और अस्थायी समाधान के विषय में सोने के मानक प्रदान करते हैं, का इस्तेमाल किया एरेनास एकल जानवरों के लिए बनाया गया है और इसलिए यह समय लेने वाली नमूना एक सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए आवश्यक आकार प्राप्त करने के लिए कर रहे हैं। कई अन्य तरीकों हाल ही में एक अच्छी तरह से परिभाषित प्रोत्साहन शासन के साथ संयोजन में उच्च संकल्प व्यवहार डेटा के एक कुशल अधिग्रहण की अनुमति है कि विकसित किया गया है। ये गंध पंख 5 का एक सटीक 3 डी मॉडल के साथ संयोजन में एक windtunnel में कई सिरका मक्खियों के पूछना 3 डी-ट्रैकिंग शामिल 25 और Flywalk प्रतिमान 26 से airstreams के साथ आपूर्ति की पसंद कक्षों में कई अलग-अलग मक्खियों की ट्रैकिंग।
Flywalk में, 15 व्यक्ति मक्खियों छोटे ग्लास ट्यूब में स्थित हैं और लगातार लाल बत्ती की शर्तों के तहत भूमि के ऊपर एक कैमरा से नजर रखी। Odors 20 सेमी / सेकंड की एक सतत airstream करने के लिए जोड़ा गया है और एक स्थिर गति से ग्लास ट्यूब के माध्यम से यात्रा कर रहे हैं। airstream गंध वितरण प्रणाली में प्रवेश करने से पहले आसुत जल (humidifiers) युक्त 250 मिलीलीटर की बोतल के माध्यम से गुजर द्वारा humidified है। flies' पदों मक्खियों आगे ऊपर ले जाएँ या नहीं कर सकते हैं जहां ब्याज (आरओआई) के एक वर्गाकार क्षेत्र गंध ट्यूब की लंबाई के सबसे शामिल (लेकिन ट्यूब (प्रत्येक पक्ष पर लगभग 5 मिमी के बाहरी किनारों को छोड़कर) के भीतर दर्ज की गई हैं हवा के साथ) गंध प्रस्तुति (चित्रा 1 ए, बी) के समय के आसपास। उड़ान भरने के पहचान ट्रैकिंग प्रणाली टी द्वारा स्थिर रखा जाता हैउनकी वाई-पदों (यानी उनकी ग्लास ट्यूब सीमा) के आधार पर प्रयोग hroughout। गंध उत्तेजना से 8 एकल odors और 26,29 (चित्रा 1 बी) तत्संबंधी सभी संभव मिश्रण की प्रस्तुति की अनुमति देता है जो एक बहु-घटक प्रोत्साहन डिवाइस का उपयोग कर हासिल की है। एक प्रयोग के पाठ्यक्रम एक कंप्यूटर गंध वितरण प्रणाली को विनियमित करने और तापमान और आर्द्रता जानकारी एकत्रित (कंप्यूटर 1, चित्रा 1 सी) द्वारा नियंत्रित किया जाता है। इस कंप्यूटर भी लगातार सेकंड 20 फ्रेम प्रति (कंप्यूटर 2) पर मक्खी पदों जो पटरियों एक दूसरे कंप्यूटर पर एक datalogger (/ रोक रिकॉर्डिंग शुरू) को नियंत्रित करता है। गंध उत्तेजना चक्र के आसपास, गंध वाल्व स्थिति (वाल्व खोलने की यानी समय बिंदु), गंध आईडी, तापमान और आर्द्रता के पदों के लिए उड़ान भरने गंध पर कंप्यूटर 2. इस तरह की जानकारी पर लॉग इन कर रहे हैं और पदों .csv-फाइल के रूप में सिंक्रनाइज़ और निर्यात कर रहे हैं उड़ जो आगे की कार्रवाई की और कस्टम लिखा विश्लेषण दिनचर्या का उपयोग विश्लेषण किया जा सकता है। क्योंकिपूरे सिस्टम कंप्यूटर नियंत्रित है, कोई मानवीय हस्तक्षेप के एक प्रायोगिक सत्र के दौरान आवश्यक है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Flywalk के निर्माण और तकनीकी जानकारी कहीं और 26 (एमके से प्राप्त किया जा सकता है, इस की स्थापना की और अधिक जानकारी के स्थापित करने की किसी भी समस्या के मामले में) में वर्णित किया गया है। यहाँ हम विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने में मदद मिलेगी कि प्रतिमान की हैंडलिंग के बारे में विस्तृत निर्देश पर ध्यान केंद्रित।
1. फ्लाई हैंडलिंग
- 12 घंटे के प्रकाश: 23-25 डिग्री सेल्सियस और 70% सापेक्ष आर्द्रता पर अंधेरे शासन पीछे एक 12 घंटे के तहत खाद्य मध्यम 27 पर मध्यम घनत्व संस्कृतियों के लिए कम में उड़ जाता है। यह अंत करने के लिए, 20-30 नव उभरा वयस्क है, तो एक सप्ताह के लिए एक बड़ा भोजन शीशी में पुन: पेश वयस्क मक्खियों त्यागने और उभरने के लिए वंश के लिए प्रतीक्षा करने के लिए मक्खियों अनुमति देते हैं।
- 30-40 नव उभरा (उम्र <24 घंटे) वयस्क मक्खियों लीजिए और 3-5 दिनों के लिए भोजन मध्यम 27 से युक्त नया एक शीशी में उन पर उम्र।
- चौबीस घंटा व्यवहार प्रयोग के शुरू होने से पहले: हस्तांतरण सभी 30-40 पहले से एकत्र 3-5 डी पुराने (2.2 देखें) एक नया छठी के लिए मक्खियोंअल एक नम रबर फोम प्लग या एक Aspirator का उपयोग कर एक नम टिशू पेपर से युक्त।
नोट: सीओ 2 का उपयोग मक्खियों चतनाशून्य मत करो।
Flywalk सेटअप की 2. तैयारी
- Humidifiers के रूप में 250 मिलीलीटर की बोतल का प्रयोग करें। आसुत पानी की 100 मिलीलीटर के साथ humidifiers भरें।
- गंध शीशियों तैयार करें।
- शुद्ध odors को एथिल एसीटेट, एथिल butyrate, isopentyl एसीटेट और विलायक खनिज तेल में 2,3-butanedione के 500 μl 10 -3 dilutions तैयार।
- गंध शीशी प्रति दो गेंद जाँच वाल्व संलग्न। वाल्व ऊनि दिशात्मक airflow के लिए ही अनुमति है कि जांच करने पर ध्यान दें। इसलिए, हवा एक तरफ शीशी में प्रवेश और दूसरी तरफ इसे छोड़ सकते हैं कि इस तरह से जाँच वाल्व कनेक्ट।
- एक 200 μl पीसीआर प्रतिक्रिया ट्यूब के ढक्कन निकालें। एक अलग प्रतिक्रिया ट्यूब में हर गंध कमजोर पड़ने के 100 μl पिपेट और अलग गंध शीशियों में ट्यूबों की जगह। इसके अलावा केवल विलायक खनिज ओय युक्त एक गंध शीशी तैयारएल।
- कसकर स्टेनलेस स्टील प्लग और रबर गास्केट का उपयोग कर उन्हें बंद करके गंध शीशियों सील।
- गंध वितरण प्रणाली के लिए (खनिज तेल युक्त 4 युक्त odors और 1) 5 गंध शीशियों कनेक्ट करें। सही प्रवाह की दिशा में उन्हें कनेक्ट करने के लिए सुनिश्चित करें। एक गलत कनेक्शन केवल योजना बनाई प्रयोग समझौता नहीं होगा, लेकिन यह भी वितरण प्रणाली दूषित हो सकता है।
- प्रोत्साहन डिवाइस का मिश्रण कक्ष की दुकान सील द्वारा लीक के लिए जाँच करें। प्रोत्साहन डिवाइस से पहले सभी airflows अब उत्तरोत्तर शून्य करने के लिए ड्रॉप, कि सुनिश्चित करें। यदि नहीं, तो अब सिस्टम को छोड़ते हवा की सिसकी से पहचाना जा सकता है, जो लीक के लिए जाँच करें।
- ध्यान इसी एडेप्टर का उपयोग कर दोनों पक्षों पर एक Aspirator और करीब ग्लास ट्यूब का उपयोग कर 15 व्यक्ति ग्लास ट्यूब के लिए 15 अलग-अलग मक्खियों हस्तांतरण।
नोट: सिस्टम भली भांति बंद करके सफल प्रयोगों के लिए बंद किया जाना चाहिए, क्योंकि एडेप्टर कसकर ग्लास ट्यूब फिट सुनिश्चितऔर ग्लास ट्यूब इस कदम के दौरान तोड़ सकता है कि ध्यान दें। सुरक्षात्मक दस्ताने और काले चश्मे पहन कर चोटों से बचने के लिए ध्यान रखना। - Flywalk सेटअप करने के लिए ग्लास ट्यूब कनेक्ट और, यहाँ पर से, मक्खियों नए वातावरण के लिए अभ्यस्त करने के लिए अनुमति देने के लिए प्रयोग शुरू करने से पहले कम से कम 15 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
- ग्लास ट्यूब संलग्न करने के बाद: ग्लास ट्यूब के बाद 16 airflows सिस्टम में प्रवेश करने से airflow को जोड़ें, तो कंप्यूटर 1 पर नीचे की ओर डिजिटल प्रवाह मीटर के readout की जाँच करें। आर्द्रता 60% और 80% के बीच है इसके अलावा, अगर कंप्यूटर 1 पर जाँच करें।
- मक्खियों के समक्ष प्रस्तुत गंध उत्तेजनाओं का क्रम और समय को नियंत्रित डिजाइन प्रोत्साहन प्रोटोकॉल। 40 बार प्रत्येक के लिए एक साथ वर्णित डेटा, वर्तमान 4 odors और अकेले नियंत्रण (खनिज तेल) और सभी संभव त्रिगुट और odors की quarternary मिश्रण जैसे प्राप्त करने के लिए। 90 सेकंड के एक interstimulus अंतराल पर 500 मिसे के लिए पल्स अवधि निर्धारित करें और प्रोत्साहन अनुक्रम randomize।
- ली पर स्विचght स्रोत (एलईडी क्लस्टर; λ = 630)। ग्लास ट्यूब के अंदर के तापमान में वृद्धि के बिना कुशल नज़र रखने के लिए पर्याप्त रोशनी प्रदान करने के लिए सुनिश्चित करें।
- सभी 15 ग्लास ट्यूब शामिल हैं जो इस तरह से नजर रखी जा करने और ट्यूबों के किनारों की लगभग 5 मिमी बाहर रखा गया है क्षेत्र भर में एक फ्रेम खींचकर ट्रैकिंग प्रणाली के ब्याज की एक क्षेत्र की स्थापना की।
- अलग-अलग रखने के लिए इसी लिपि में उनकी वाई-स्थिति को बदलने के द्वारा ट्रैकिंग प्रणाली में अलग-अलग ट्यूबों के बीच 14 समानांतर जुदाई लाइनों की स्थापना प्रयोग भर से पहचाने जाने मक्खियों। केवल एक मक्खी दो लाइनों में से किसी सेट के बीच नज़र रखी जाएगी, क्योंकि इस तरह के दो विभाजक लाइनों के बीच एक ग्लास ट्यूब है कि वहाँ हमेशा इस तरह से उन्हें स्थिति के लिए सुनिश्चित करें।
- मज़बूती से ग्लास ट्यूब के दौरान पता लगाया जाता है कि मक्खियों को इस तरह से कैमरे के मानकों सेट करने के लिए सुनिश्चित करें। मक्खियों हित के क्षेत्र के किनारों पर खो रहे हैं, ट्रैकिंग एस की चमक या लाभ में वृद्धिoftware। ट्रैकिंग प्रणाली के यांत्रिक कंपन से बचें। निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग ट्रैक।
- प्रोत्साहन प्रोटोकॉल शुरू करने से प्रयोग शुरू करें। रिकार्ड 20 एफपीएस (प्रति सेकंड फ्रेम) में XY-निर्देशांक flies' और पाठ फ़ाइलों में गंध वाल्व स्थिति के साथ संयोजन में लॉग इन करें।
3. डेटा विश्लेषण
नोट: इन चरणों का विश्लेषण फिर भी एक कदम-दर-कदम ढंग से प्रस्तुत किया जाएगा सार्थक परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं क्योंकि डेटा विश्लेषण में निम्नलिखित कदम आर में प्रोग्राम कस्टम लिखा दिनचर्या का उपयोग automatized कर रहे हैं। विश्लेषण के लिए कच्चे डेटा एक गंध उत्तेजना चक्र के लिए एक आम समय धुरी पर सेमी में गंध वाल्व स्थिति, नाड़ी नंबर प्रयोग में और 15 मक्खी एक्स पदों पर सिंक्रनाइज़ जानकारी युक्त .csv-फाइल कर रहे हैं। डेटा विश्लेषण के लिए कस्टम कोड अनुरोध पर उपलब्ध कराई जा सकती है।
- ओपन .csv फ़ाइल, एक चा से signified वाल्व खोलने का समय-बिंदु मिलवाल्व स्थिति का प्रतिनिधित्व करने के कॉलम में nge।
- फार्म की गंध स्थिति के रैखिक समारोह की गणना
एफ (टी) एस * टी = मैं +
टी उत्तेजना चक्र में समय है जहां, एस हवा की गति (यहां 20 सेमी / सेक) और मैं गंध स्थिति 0 (वाल्व खोलने प्लस देरी) पर नलियों में प्रवेश करती है समय बिंदु उपयोग कर की गणना की जा सकती है अवरोधन है। - जो गंध पर समय बिंदु का पता लगाएं और हर उड़ान भरने और 0. नोट करने के लिए इस समय बिंदु सेट के लिए एक्स-स्थिति एक दूसरे को काटना मक्खी: मक्खी पदों पर प्रत्येक individual's करने के लिए गठबंधन कर रहे हैं इस तरह की गंध के साथ मुठभेड़।
- हित के क्षेत्र के बहुत किनारों पर बैठे मक्खियों को बाहर निकालें।
- हर उत्तेजना चक्र के लिए समय अंतराल (100 मिसे) और दोहराने प्रक्रिया द्वारा एक्स अक्ष के साथ विस्थापन को विभाजित करके एक्स पदों से गति की गणना।
- चित्रा 2 ई के रूप में दिखाया हर मक्खी और गंध के लिए और एक दिया गंध के लिए उन लोगों के मतलब समय-पाठ्यक्रम से मतलब गति समय पाठ्यक्रम की गणना की गति समय-पाठ्यक्रम प्राप्त करने के लिए।
- चित्रा 3 सी के रूप में दिखाया शुद्ध विस्थापन प्राप्त करने के लिए हर ट्रैकिंग घटना के लिए गंध नाड़ी और बाद में उड़ना और गंध प्रति मतलब शुद्ध विस्थापन के बाद 4 सेकंड के भीतर शुद्ध विस्थापन की गणना।
4. सफाई प्रक्रिया
- साफ ग्लास ट्यूब
- ग्लास ट्यूब से मक्खियों और एडेप्टर निकालें और डिटर्जेंट में ग्लास ट्यूब लेना।
- चल आसुत जल के तहत ग्लास ट्यूब कुल्ला और दबाव हवा का उपयोग कर उन्हें सूखी।
- 8 घंटे के लिए 200 डिग्री सेल्सियस पर हीट ग्लास ट्यूब।
- स्वच्छ गंध वितरण प्रणाली
- केंद्रीय कक्ष मिश्रण से सभी गंध शीशियों और ट्यूबिंग निकालें।
- मिश्रण कक्ष से ट्यूबिंग एडेप्टर निकालें।
- प्रयोगशाला सफाई समाधान और सॉल्वैंट्स (जैसे इथेनॉल, एसीटोन) के साथ rinsing द्वारा साफ मिश्रण चैम्बर। प्रयोगशाला हुड के तहत इन चरणों को पूरा करें।
- सूखी मिश्रण कक्ष 8 घंटे के लिए 200 डिग्री सेल्सियस पर यह दबाव हवा का उपयोग कर और गर्मी।
- स्वच्छ गंध शीशियों और चेक वाल्व
- स्टील प्लग (त्यागने रबर गैसकेट) निकालें और गंध शीशियों से जाँच वाल्व और प्रयोगशाला सफाई समाधान में सभी घटकों के लिए भिगो दें।
- एक अल्ट्रासाउंड स्नान में Sonicate घटकों और आसुत जल से कुल्ला।
- इथेनॉल और एसीटोन के साथ जाँच वाल्व को छोड़कर सभी घटकों को साफ करें। प्रयोगशाला हुड के तहत इन चरणों को पूरा करें।
- और दबाव हवा का उपयोग कर शुष्क घटकों 8 घंटे के लिए 200 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें गर्मी।
- इथेनॉल और एक सिरिंज का उपयोग एसीटोन के साथ उन्हें निस्तब्धता से अंदर पर स्वच्छ जाँच वाल्व (प्रवाह की दिशा पर विचार)। प्रयोगशाला काले चश्मे पहने प्रयोगशाला हुड के तहत इन चरणों को पूरा करें। एसीटोन दबाव हवा के साथ उन्हें निस्तब्धता द्वारा तुरंत रबर भागों, सूखी जाँच वाल्व हमलों की वजह से।
- कई दिनों के लिए जाँच वाल्व के माध्यम से हवा स्पंदन द्वारा अवशिष्ट odors को दूर। इस सफाई कदम के लिए शासन से दूर / 1 सेकंड हवा पर 60 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन और एक 1 सेकंड हवा का प्रयोग करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
मक्खियों एक स्थिर गति से ग्लास ट्यूब के माध्यम से गंध दालों और गंध नाड़ी से यात्रा के बीच उनके ग्लास ट्यूब के भीतर स्वतंत्र रूप से वितरित करने के लिए अनुमति दी जाती है क्योंकि मक्खियों उत्तेजना के समय उनके एक्स-स्थिति के आधार पर अलग अलग समय पर गंध मुठभेड़। नतीजतन, एथिल एसीटेट की एक आकर्षक 10 -3 कमजोर पड़ने से एक 500 मिसे नाड़ी द्वारा पैदा की हवा आने की दिशा प्रक्षेप पथ के onsets के करीब बैठे मक्खियों के उन लोगों की तुलना में उनके ग्लास ट्यूब की हवा के साथ अंत में मक्खियों के लिए के बारे में 1 सेकंड की देरी कर रहे हैं 20 सेमी / सेकंड और 20 सेमी ग्लास ट्यूब लंबाई (2A चित्रा) के एक हवा की गति पर हवा आने की दिशा अंत। गंध प्रस्तुति के समय में इसकी एक्स-स्थिति के आधार पर हर व्यक्ति के लिए गंध मुठभेड़ में अस्थायी अंतर के लिए संशोधन एथिल एसीटेट के प्रति प्रतिक्रिया में देरी व्यक्तियों (चित्रा 2 बी) के पार संगत कर रहे हैं कि पता चलता है।
ओ के लिए सुधार के बिना तदनुसार, औसत हवा आने की दिशा प्रक्षेपवक्रदोर साथी की सुधार के साथ औसत प्रक्षेपवक्र की तुलना में लगभग 0.5 सेकंड की देरी है (चित्रा -2 सी, गंध दोनों प्रक्षेप पथ के लिए प्रदर्शन किया था ग्लास ट्यूब के आने की दिशा अंत में प्रवेश करने की जरूरत है समय के लिए है कि सुधार पर ध्यान दें)। इसके अलावा, एक भी गंध नाड़ी के लिए सही मतलब हवा आने की दिशा प्रक्षेपवक्र भी अनुशासनहीन एक (चित्रा 2 डी) की तुलना में एक steeper ढाल (यानी एक उच्च गति से चलने) को प्रदर्शित करता है। एक भी गंध नाड़ी के लिए टिप्पणियों के लिए इसी प्रकार, गंध यात्रा के सुधार को छोड़ते हुए गंध दालों के 40 प्रस्तुतियों के साथ दो प्रयोगात्मक सत्र (यानी 30 मक्खियों) से मिलकर एक पूरा डाटासेट में एक वृद्धि की देरी और कम प्रतिक्रिया आयाम की ओर जाता है प्रत्येक (चित्रा 2 ई) ।
एथिल butyrate के आकर्षक 10 -3 dilutions की 500 मिसे दालों (ETB), isopentyl एसीटेट (आई ए ए), एथिल एसीटेट (एटा) और 2,3-butanedione (BEDN) के साथ दोहराया उत्तेजना हवा आने की दिशा आयुध डिपो पर surges elicitsया भूखे मादा मक्खियों में मुठभेड़, विलायक खनिज तेल (एमओएल) के साथ उत्तेजना जबकि कोई या केवल कमजोर प्रतिक्रियाएं उदाहरण भी देते हैं। अकेले यांत्रिक उत्तेजना पहले एक समान प्रतिमान 28 में वृद्धि की आंदोलन को प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है। Flywalk प्रतिमान में गंध उत्तेजना कुल airflow के परिवर्तन नहीं करता और बढ़ आंदोलन एमओएल का उपयोग करते हुए नियंत्रण की स्थिति में ज्यादातर अनुपस्थित है क्योंकि हालांकि, इन हवा आने की दिशा सच गंध प्रतिक्रियाओं को प्रतिबिंबित surges। प्रतिक्रिया समय-पाठ्यक्रमों मतलब व्यक्तियों (चित्रा 3) और गंध से विशिष्ट विलंबता में भर में टकसाली हैं, आयाम और अवधि (चित्रा 3 ए, बी)। एथिल एसीटेट के जवाब को एक तेज शुरुआत, उच्च आयाम और एक छोटी अवधि प्रदर्शित करते हैं। इसके विपरीत, 2,3-butanedione के लिए प्रतिक्रियाओं को आम तौर पर एक से थोड़ा बाद में शुरुआत, एक कम आयाम और एक लंबी अवधि के प्रदर्शित करते हैं। इथाइल butyrate और isopentyl एसीटेट एथिल एसीटेट के रूप में इसी तरह के अस्थायी गतिशीलता को प्रकाश में लाना है, लेकिन प्रतिक्रियाओं आयाम में कम कर रहे हैं। Correspondingly, सभी 4 odors को विलायक और नकारात्मक नियंत्रण खनिज तेल (चित्रा 3 सी) की तुलना में गंध मुठभेड़ के बाद 4 सेकंड के भीतर एक उच्च हवा आने की दिशा विस्थापन को प्रकाश में लाना।
एक ही 4 attractants का उपयोग करना, यह पहले से attractants के द्विआधारी मिश्रण में कम से कम के रूप में आकर्षक और अधिक आकर्षक मिश्रण घटक के रूप में 29 हैं कि दिखाया गया था। इधर, इस अवलोकन के लिए सभी संभव त्रिगुट मिश्रण और सभी 4 attractants का पूरा मिश्रण परीक्षण के द्वारा बढ़ाया है। बाइनरी मिश्रण के साथ पिछले अवलोकन करने के लिए भी इसी तरह, इन अधिक जटिल मिश्रणों के सभी कम से कम के रूप में आकर्षक सबसे आकर्षक एकल यौगिक (चित्रा -4 ए) के रूप में कर रहे हैं। सबसे आकर्षक मिश्रणों एथिल एसीटेट और 2,3-butanedione दोनों से युक्त होते हैं। इन 3 मिश्रणों के लिए प्रतिक्रियाएँ एक दूसरे से काफी अलग नहीं है और यह भी प्रतिक्रिया कैनेटीक्स strikingly समान (आंकड़े -4 ए, बी) कर रहे हैं। इसके विपरीत, पूर्ण blen से एथिल एसीटेट छोड़ते हुए2,3-butanedione छोड़ते हुए प्रतिक्रिया (चित्रा 4C) shortens जबकि डी, अधिकतम हवा आने की दिशा की गति में कमी हो जाती है। एथिल एसीटेट 2,3-butanedione कम आयाम लेकिन लंबी अवधि (आंकड़े 3 बी, 4 डी) की प्रतिक्रियाएं elicits जबकि लघु उच्च आयाम प्रतिक्रियाएं elicits, क्योंकि इन टिप्पणियों attractants के मिश्रणों की ओर प्रतिक्रियाओं समय-पाठ्यक्रमों के लिए जाते हैं, कि हमारे पिछले ढूँढने की याद ताजा कर रहे हैं मिश्रण घटक प्रतिक्रिया समय-पाठ्यक्रम 29 से बनाई गई एक इष्टतम प्रतिक्रिया समय पाठ्यक्रम का पालन करें। इस डाटासेट में सभी 4 attractants का इष्टतम एथिल एसीटेट और 2,3-butanedione की ओर से प्रतिक्रिया समय के पाठ्यक्रम के आधार पर निर्माण किया जा सकता है। इथाइल butyrate और / या isopentyl एसीटेट पूर्ण मिश्रण (चित्रा 4D) की ओर प्रतिक्रियाओं में मनाया अधिकतम चलने की गति तक पहुँचने के अलावा जरूरी हैं। इसलिए, 2 से 3 या 4 घटकों के मिश्रण जटिलता में वृद्धि के मिश्रण ई का आकर्षण बढ़ जाती हैवेंचर आगे पिछले प्रेक्षण से उम्मीद की जा होगा की तुलना में, attractants के मिश्रण की ओर प्रतिक्रियाओं मिश्रण घटक की ओर प्रतिक्रियाओं के एक इष्टतम प्रतिनिधित्व करते हैं कि। फिर भी, घटक संयोजक गंध मिश्रण में संरक्षित है कि सामान्य निष्कर्ष ये अधिक जटिल मिश्रण 29 के लिए भी मान्य रहता है।
चित्रा 1. सिद्धांत और Flywalk सेटअप के लेआउट। (ए) के सिद्धांत का योजनाबद्ध ड्राइंग। पीला वर्ग: गंध उत्तेजना ट्यूब के माध्यम से चलती है और मक्खी की हवा आने की दिशा आंदोलन में जिसके परिणामस्वरूप; काले वस्तु: कैमरे व्यवहार प्रतिक्रियाओं को ट्रैक करने के लिए। लकड़ी का कोयला फ़िल्टर हवा के साथ सेटअप के माध्यम से airflow (बी) योजनाबद्ध गंध वितरण प्रणाली 26,30 प्रवेश करने से पहले, 8 चैनलों में humidified और विभाजन जा रहा है। उड़ा हुआ चित्रा: 1, तीन तरह solenoid वाल्व पास एक खाली शीशी के माध्यम से airflow या तो आईएनजी (ग; प्रतिपूरक प्रवाह) या गंध के स्रोत से युक्त एक शीशी के माध्यम से (ओ, गंध प्रवाह); 2, गेंद जाँच वाल्व एक ही दिशा में हवा के प्रवाह को सीमित करने के लिए और सिस्टम संक्रमण से बचने के लिए; मिश्रण कक्ष: कस्टम निर्मित बॉक्स, सभी solenoid वाल्व और तबादलों से हवा एकत्र करता है कि विभाजित-अप करने के लिए हवा के तापमान और आर्द्रता सेंसर से लैस व्यक्ति मक्खियों और एक ट्यूब के साथ भरी हुई 15 ग्लास ट्यूब के लिए विभाजित है जहां बोर्ड,। नोट: ग्लास ट्यूब के बाद प्रवाह नियामकों और प्रवाह मीटर सभी ट्यूबों में समान प्रवाह की गारंटी। नीले वर्ग ट्रैकिंग प्रणाली का ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र को दर्शाता है। ट्रैकिंग कैमरा, ट्रैकिंग कंप्यूटर, और गंध वितरण प्रणाली के बीच सूचना प्रवाह (सी) योजनाबद्ध। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
oad / 53,394 / 53394fig2.jpg "/>
चित्रा 2 की प्रक्रिया और डेटा विश्लेषण के पीछे तर्क। (ए) व्यक्तिगत, इसलिए, अलग-अलग समय अलग अलग स्थानों पर गंध का सामना और मक्खियों। वाम पैनल: गंध वाल्व स्विचिंग के समय में संभव मक्खी पदों की योजनाबद्ध। राइट पैनल: एथिल एसीटेट की एक 10 -3 कमजोर पड़ने से एक 500 मिसे नाड़ी की प्रस्तुति के लगभग 15 मक्खियों की एक्स-पदों के कच्चे डेटा। नोट हवा आने की दिशा उनके एक्स-पदों के आधार पर अलग-अलग समय पर अलग-अलग मक्खियों के चलता है। वाम धराशायी लाइन: गंध वाल्व स्विचिंग का समय है। गंध ग्लास ट्यूब (घ) और हवा की गति (डब्ल्यू) तक पहुँचने के लिए अलग-अलग मक्खियों की गंध मुठभेड़ एक प्रणाली आंतरिक देरी से स्थानांतरित कर दिया है। इसलिए, गंध मुठभेड़ इसकी एक्स-स्थिति के आधार पर प्रत्येक मक्खी के लिए अलग-अलग गणना की जाती है। नीचे सही: 15 मक्खियों के गठबंधन एक्स पदों (ग्रे) और मतलब एक्स-स्थिति (बोल्ड काला)। (बी) एक के रूप में एक ही डेटा है, लेकिन देरी और हवा की गति के लिए सही। Bottओम: (ग्रे) और सुधार के बाद एक्स-स्थिति (बोल्ड लाल) मतलब 15 मक्खियों के गठबंधन एक्स पदों। साथ और गंध यात्रा के सुधार के बिना एथिल एसीटेट से एक 500 मिसे नाड़ी से हासिल 15 मक्खियों का मतलब हवा आने की दिशा प्रगति (सी) तुलना। अनुशासनहीन (काला) ट्रेस नहीं बल्कि गंध पर्यटकों के लिए, देरी के लिए सही है कि ध्यान दें। साथ और गंध यात्रा के सुधार के बिना एथिल एसीटेट से एक 500 मिसे नाड़ी से हासिल 15 मक्खियों (डी) मतलब हवा आने की दिशा गति। धराशायी लाइनों सी में दिखाया हवा आने की दिशा प्रगति मूल्यों से गणना की गति, बोल्ड लाइनों एक 1 सेंट आदेश 9 सूत्री Savitzky-Golay फिल्टर का उपयोग चौरसाई के बाद आने की दिशा गति प्रदर्शित संकेत मिलता है। (ई) अनफिल्टर्ड साथ 30 मक्खियों और एथिल एसीटेट प्रत्येक (यानी एक पूरा डाटा सेट) का 40 दालों के लिए गंध यात्रा के सुधार के बिना हवा आने की दिशा गति से मतलब है। इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंआंकड़ा।
। ETB, 4 आकर्षक odors के 10 -3 dilutions के लिए चित्रा 3. उदाहरण प्रतिक्रियाएं (ए) 500 मिसे 4 attractants की दाल और विलायक खनिज तेल (एमओएल के लिए 30 अलग-अलग मक्खियों का मतलब प्रतिक्रिया समय-पाठ्यक्रमों रंग कोडित: एथिल butyrate; आई ए ए: isopentyl एसीटेट, एटा: एथिल एसीटेट; BEDN: 2,3-butanedione)। प्रत्येक पंक्ति में एक व्यक्ति मक्खी का मतलब प्रतिक्रिया समय पाठ्यक्रम का प्रतिनिधित्व करता है। प्रत्येक मक्खी 40 बार और के लिए प्रत्येक गंध के साथ प्रस्तुत किया गया था - मक्खियों स्वतंत्र रूप से वितरित करने के लिए अनुमति दी जाती है और ट्रैकिंग प्रणाली के हित के क्षेत्र छोड़ सकते हैं क्योंकि - प्रतिक्रिया समय पाठ्यक्रम (एन = 7-39 प्रक्षेप पथ मक्खी प्रति सभी को पूरा प्रक्षेप पथ से गणना कर रहे हैं इसका मतलब ) मक्खी और गंध के प्रति। पीली पट्टी गंध नाड़ी का प्रतिनिधित्व करता है। (बी) रिस्पांस 4 attractants और विलायक खनिज तेल (एन = 30 मक्खियों के लिए समय-पाठ्यक्रम, मतलब+/- SEM)। (सी) गंध मुठभेड़ के बाद 4 सेकंड के भीतर नेट हवा आने की दिशा विस्थापन (ए (के रूप में एक ही डेटा) और (बी), एन = 30 मक्खियों)। भरे बक्से नकारात्मक नियंत्रण खनिज तेल के मुकाबले सांख्यिकीय महत्वपूर्ण हवा आने की दिशा आंदोलन से संकेत मिलता है (पी <0.05, Wilcoxon रैंक परीक्षण) पर हस्ताक्षर किए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Attractants की त्रिगुट और quarternary मिश्रण की ओर चित्रा 4 प्रतिक्रियायें। (ए) 4 attractants और उनके मंझला प्रतिक्रिया के आधार पर हल क्या है सब त्रिगुट और quarternary मिश्रण के लिए नेट हवा आने की दिशा विस्थापन। पर हस्ताक्षर किए Kruskal वालिस रैंक राशि परीक्षण और पोस्ट अस्थायी Wilcoxon रैंक परीक्षण; एन = 30 विभिन्न पत्र प्रतिक्रियाओं (पी <0.05 के बीच सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेदों का संकेत) मक्खियों। ब्लैक बॉक्स के नीचे एथिल एसीटेट और 2,3butanedione युक्त मिश्रण इंगित करता है। (बी) प्रतिक्रिया एथिल एसीटेट और 2,3-butanedione युक्त मिश्रण के समय पाठ्यक्रम (मतलब +/- SEM, n = 30 मक्खियों)। इसी तरह की प्रतिक्रिया-कैनेटीक्स ध्यान दें। पूर्ण मिश्रण द्वारा पैदा की एथिल एसीटेट या 2,3-butanedione और प्रतिक्रिया कैनेटीक्स बिना मिश्रण की प्रतिक्रिया समय-पाठ्यक्रम (सी) तुलना (+/- मतलब SEM, n = 30 मक्खियों)। एटा के बिना कम आयाम और BEDN बिना कम प्रतिक्रिया पर ध्यान दें। एटा (लाल) और BEDN (हरा) से निर्माण अधिकतम समय-कोर्स (धराशायी) और पूर्ण मिश्रण (डी) तुलना। छायांकन विभिन्न मिश्रण घटकों द्वारा समझाया समय पाठ्यक्रम के कुछ हिस्सों से संकेत मिलता है। पिछले एक अध्ययन में यह attractants के द्विआधारी मिश्रण की ओर प्रतिक्रियाओं मिश्रण घटक समय-पाठ्यक्रमों 29 के आधार पर बनाई गई एक इष्टतम समय पाठ्यक्रम से अनुमान लगाया जा सकता है कि दिखाया गया है कि ध्यान दें। एटा और BEDN के लिए इस इष्टतम समय पाठ्यक्रम एक के रूप में दिखाया गया हैधराशायी लाइन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flywalk सिस्टम पहली नज़र में नहीं बल्कि परिष्कृत प्रतीत होता है, एक बार स्थापित किया है और इसे चलाने के प्रयोग करने में आसान है और बहुत मजबूत परिणाम पैदा करता है। Bioassay के साथ उत्पादन परिणामों की स्थिरता पर जोर देना यह यहाँ दिखाया प्रतिनिधि परिणाम लगभग 2 साल एक नई ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर और प्रकाश स्रोत का उपयोग कर एक संशोधित सेटअप के साथ पिछले एक अध्ययन 29 में दिखाए गए परिणामों में से कुछ के बाद प्राप्त किया गया है कि कहा जा सकता है। फिर भी, आकर्षित प्रतिक्रिया कर रहे हैं - पहले उनकी गतिशीलता के विषय में प्रकाशित उन लोगों के लिए बहुत समान - थोड़ा अधिक प्रतिक्रिया आयाम के बावजूद।
Flywalk का उपयोग कर उच्च गुणवत्ता वाले परिणामों को प्राप्त करने के क्रम में विशेष रूप से विचार किया जाना चाहिए, जो कुछ महत्वपूर्ण पहलू हैं। महत्वपूर्ण बात है, आर्द्रता एक प्रयोग के दौरान 60% से नीचे नहीं छोड़ देना चाहिए। एक ठेठ प्रयोगात्मक सत्र लगभग 8 घंटे के लिए रहता है। यथोचित आकार महिला सीएस प्रकार के जंगली मक्खियों पूर्व से पहले 24 घंटे के लिए भूखेआसानी से प्रयोगात्मक सेटअप प्रदान की नमी में कम से कम 12 घंटे के लिए जीवित रहने के periment काफी अधिक है। यह एक खाली ग्लास ट्यूब (चित्रा 1 बी) में एक आर्द्रता सेंसर स्थापित करने के लिए और humidifiers और ग्लास ट्यूब के बीच कहीं भी airflow में प्रवाह नियामकों रखने से बचने की सलाह दी जाती है आर्द्रता से संबंधित समस्याओं से बचने के लिए। यह भी व्यवस्था भली भांति बंद करके सील कर दिया है कि डेटा की गुणवत्ता के लिए जरूरी है। ग्लास ट्यूब के बाद सिस्टम को छोड़ने airflows सिस्टम में प्रवेश airflow के लिए ऊपर योग करना चाहिए। ज्यादातर असफल प्रयोगों प्रयोग के शुरू सिस्टम वायुरोधी है विश्वास दिलाता हूं कि पहले लिया जाना चाहिए प्रणाली और महान देखभाल के क्षेत्र में लीक करने के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। अंत में, घ्राण अनुसंधान में इस्तेमाल किसी भी स्थापना के साथ के रूप में, प्रमुख रोजमर्रा के मुद्दों में से एक संक्रमण से बचने के लिए है। Odors के साथ संपर्क में आने के कुछ हिस्सों के अधिकांश कांच, स्टील, Teflon या तिरछी के बने होते हैं और इसलिए सबसे ओ दूर करने के लिए पर्याप्त है, जो कम से कम 200 डिग्री सेल्सियस, अप करने के लिए गर्म किया जा सकताइस तरह लंबे समय से जंजीर फेरोमोन के रूप में विशेष रूप से उच्च उबलते अंक के साथ उन लोगों के लिए छोड़कर Dors। चेक वाल्व रबर भागों होते हैं क्योंकि वे के रूप में उच्च गरम किया जाता है और इसलिए एक विशेष सफाई प्रोटोकॉल उनके लिए तैयार किया गया था, यही वजह है प्रदूषण का प्रमुख स्रोत हैं, नहीं किया जा सकता। फिर भी, यह एक विशेष जाँच वाल्व के साथ संपर्क में आ गया odors का ट्रैक रखने के लिए सलाह दी जाती है। इसकी साफ-सफाई के बारे में संदेह की स्थिति में यह जगह।
Tethered assays और पलटन के प्रयोगों के बीच एक समझौते के रूप में, ज़ाहिर है Flywalk भी अन्य तरीकों की तुलना में कुछ नुकसान है। मिसाल विभिन्न उत्तेजनाओं की एक भीड़ की ओर व्यवहार का आकलन किया और तुलना करने के लिए किया गया है, जब बहुत ही कुशल है। उल्लेखनीय है कि 15 व्यक्तियों को एक दिया गंध का सिर्फ एक नाड़ी की प्रतिक्रिया समय पाठ्यक्रम दृढ़ता से एक पूर्ण डेटा सेट में प्राप्त प्रतिक्रिया समय-पाठ्यक्रम जैसा दिखता है, क्योंकि (यानी 30 मक्खियों और 40 प्रस्तुतियों प्रत्येक; आंकड़े 2 डी, 2 ई जैसे जांच की जरूरत है जब अधिक कुशल हैं। इसके अलावा, दृश्य ट्रैकिंग सिस्टम का अस्थायी समाधान ऐसे tethered उड़ान या ट्रेडमिल के रूप में सबसे तेजी से bioassays की तुलना में अक्सर कम है। ड्रोसोफिला गंध निर्देशित व्यवहार में सूचना कम से कम प्रतिक्रिया देरी tethered मानदंड 20,23 में अच्छी तरह से गंध मुठभेड़ के बाद 100 मिसे के नीचे हैं और इस प्रकार 10 हर्ट्ज पर डेटा का विश्लेषण करते समय हल नहीं किया जा सकता है, जो एक समय खिड़की के भीतर गिर जाते हैं। हालांकि, Flywalk में आकर्षित प्रतिक्रियाएं आम तौर पर पहले 100-300 के भीतर शुरूअच्छी तरह से मुक्त उड़ान मक्खियों 5 में मनाया हवा आने की दिशा उछाल देरी के साथ कतार में है, जो मिसे (चित्रा 3 बी),। इसलिए यह tethered मानदंड में प्रतिक्रिया में देरी में इस अंतर पवन सुरंग की तुलना में और Flywalk दृश्य ट्रैकिंग मानदंड में या tethered स्थिति में मक्खियों की एक उच्च कामोत्तेजना राज्य द्वारा स्थानिक और / या अस्थायी समाधान में मतभेद के कारण है कि निर्धारित किया जाना बाकी है।
सारांश में, Flywalk नियमित रूप से ड्रोसोफिला neuroethology में इस्तेमाल पलटन के प्रयोगों की दक्षता के साथ tethered assays के अत्यधिक नियंत्रित उत्तेजना प्रस्तुति को जोड़ती है जो एक नहीं पसंद Bioassay, है। व्यक्तियों का एक ही सेट विभिन्न उत्तेजनाओं की एक भीड़ के साथ चुनौती दी जा सकती है क्योंकि विभिन्न उत्तेजनाओं के प्रति प्रतिक्रियाओं की तुलना करते समय अपने विशेष रूप से बल सांख्यिकीय शक्ति में निहित है। इसके अतिरिक्त, यह एक आकर्षक गंध की मुठभेड़ पर आने की दिशा उछाल मक्खियों तथ्य यह है कि लाभ उठाते हैं और इस तरह से गंध मूल्यांकन uncouplesएक दिशात्मक संकेत के रूप में एक ढाल के लिए आवश्यकता के बिना गंध के स्रोत स्थानीयकरण से। यह इसलिए आदर्श ड्रोसोफिला में उपलब्ध optogenetic उपकरण बॉक्स का फायदा उठाने के लिए अनुकूल होना चाहिए।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।
Acknowledgments
हम अपने मांगों के लिए ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर अनुकूलित करने के लिए Electricidade उन्हें पीओ (electricidadeempo.net) में तकनीकी सहायता के लिए डैनियल वेट और पेड्रो Gouveia धन्यवाद। हम यह भी फिल्माने की प्रक्रिया के दौरान समर्थन के लिए टॉम Retzke धन्यवाद। इस अध्ययन के मैक्स प्लैंक सोसायटी द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flywalk setup | Custom | details available upon request | |
| stimulus device | Custom | details available upon request | |
| LED cluster | Custom | details available upon request | |
| HD Pro Webcam C920 | Logitech, Lausanne, Switzerland | ||
| 2 Computers | |||
| Flywalk Reloaded v1.0 software | Electricidade Em Pó (electricidadeempo.net) | ||
| Labview 11.0 software | National Instruments, Austin, TX | ||
| Standard fly food | Custom | ||
| Standard fly vials | Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Standard fly vials | Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| aspirator | Custom | ||
| mineral oil | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | ||
| odors | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | ||
| 200 µl PCR reaction tubes | Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germany |
References
- Murlis, J., Elkinton, J. S., Cardé, R. T. Odor plumes and how insects use them. Annu. Rev. Entomol. 37, 505-532 (1992).
- Kennedy, J. S., Marsh, D. Pheromone-regulated anemotaxis in flying moths. Science. 184 (4140), 999-1001 (1974).
- Budick, S. A., Dickinson, M. H. Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors. J. Exp. Biol. 209 (15), 3001-3017 (2006).
- Buehlmann, C., Graham, P., Hansson, B. S., Knaden, M. Desert ants locate food by combining high sensitivity to food odors with extensive crosswind runs. Curr. Biol. 24 (9), 960-964 (2014).
- Van Breugel, F., Dickinson, M. H. Plume-tracking behavior of flying Drosophila emerges from a set of distinct sensory-motor reflexes. Curr. Biol. 24 (3), 274-286 (2014).
- Schuckel, J., Meisner, S., Torkkeli, P. H., French, A. S. Dynamic properties of Drosophila olfactory electroantennograms. J. Comp. Physiol. A. 194 (5), 483-489 (2008).
- Geffen, M. N., Broome, B. M., Laurent, G., Meister, M. Neural encoding of rapidly fluctuating odors. Neuron. 61 (4), 570-586 (2009).
- Nagel, K. I., Wilson, R. I. Biophysical mechanisms underlying olfactory receptor neuron dynamics. Nat. Neurosci. 14 (2), 208-216 (2011).
- Martelli, C., Carlson, J. R., Emonet, T. Intensity invariant dynamics and odor-specific latencies in olfactory receptor neuron response. J. Neurosci. 33 (15), 6285-6297 (2013).
- Szyszka, P., Gerkin, R. C., Galizia, C. G., Smith, B. H. High-speed odor transduction and pulse tracking by insect olfactory receptor neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (47), 16925-16930 (2014).
- Nagel, K. I., Hong, E. J., Wilson, R. I. Synaptic and circuit mechanisms promoting broadband transmission of olfactory stimulus dynamics. Nat. Neurosci. 18 (1), 56-65 (2014).
- Larsson, M. C., Domingos, A. I., Jones, W. D., Chiappe, M. E., Amrein, H., Vosshall, L. B. Or83b encodes a broadly expressed odorant receptor essential for Drosophila olfaction. Neuron. 43 (5), 703-714 (2004).
- Knaden, M., Strutz, A., Ahsan, J., Sachse, S., Hansson, B. S. Spatial representation of odorant valence in an insect brain. Cell Rep. 1 (4), 392-399 (2012).
- Zaninovich, O. A., Kim, S. M., Root, C. R., Green, D. S., Ko, K. I., Wang, J. W. A single-fly assay for foraging behavior in Drosophila. J. Vis. Exp. (81), e50801 (2013).
- Farhan, A., Gulati, J., Groβe-Wilde, E., Vogel, H., Hansson, B. S., Knaden, M. The CCHamide 1 receptor modulates sensory perception and olfactory behavior in starved Drosophila. Sci. Rep. 3 (2765), 1-6 (2013).
- Flügge, C. Geruchliche Raumorientierung von Drosophila melanogaster. Z. Vgl. Physiol. 20 (4), 462-500 (1934).
- Borst, A., Heisenberg, M. Osmotropotaxis in Drosophila melanogaster. J. Comp. Physiol. A. 147 (4), 479-484 (1982).
- Louis, M., Huber, T., Benton, R., Sakmar, T. P., Vosshall, L. B. Bilateral olfactory sensory input enhances chemotaxis behavior. Nat. Neurosci. 11 (2), 187-199 (2008).
- Gomez-Marin, A., Stephens, G. J., Louis, M. Active sampling and decision making in Drosophila chemotaxis. Nat. Commun. 2 (441), 1-10 (2011).
- Gaudry, Q., Hong, E. J., Kain, J., de Bivort, B. L., Wilson, R. I. Asymmetric neurotransmitter release enables rapid odour lateralization in Drosophila. Nature. 493 (7432), 42442-42448 (2013).
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71 (3), 708-712 (1974).
- Ramdya, P., Lichocki, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2014).
- Bhandawat, V., Maimon, G., Dickinson, M. H., Wilson, R. I. Olfactory modulation of flight in Drosophila is sensitive, selective and rapid. J. Exp. Biol. 213 (21), 3625-3635 (2010).
- Duistermars, B. J., Chow, D. M., Frye, M. A. Flies require bilateral sensory input to track odor gradients in flight. Curr. Biol. 19 (15), 1301-1307 (2009).
- Claridge-Chang, A., Roorda, R. D., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
- Steck, K., Veit, D., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction - The Flywalk. Sci. Rep. 2 (361), 1-9 (2012).
- Lewis, E. B. A new standard food medium. Drosoph. Inf. Serv. 34, 117-118 (1960).
- Lebestky, T., Chang, J. S. C., et al. Two different forms of arousal in Drosophila are oppositely regulated by the dopamine D1 receptor ortholog DopR via distinct neural circuits. Neuron. 64, 522-536 (2009).
- Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. Compound valence is conserved in binary odor mixtures in Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 217 (20), 3645-3655 (2014).
- Olsson, S. B., Kuebler, L. S., et al. A novel multicomponent stimulus device for use in olfactory experiments. J. Neurosci. Meth. 195 (1), 1-9 (2011).
