Summary
Automatisert system for sporing Flywalk brukes for høyoppløselig kvantifisering av lukt styrt atferd i bananflue.
Abstract
I sitt naturlige miljø, insekter som eddik fly Drosophila melanogaster blir bombardert med en enorm mengde kjemisk forskjellige odoranter. For å komplisere saken ytterligere, lukt oppdaget av insekt nervesystemet vanligvis ikke enkeltkomponentene, men blandinger hvis sammensetning og konsentrasjonsforhold varierer. Dette fører til en nesten uendelig antall forskjellige olfactory stimuli som må vurderes av nervesystemet.
For å forstå hvilke aspekter av en lukt stimulans bestemme sin evaluering av fly, er det derfor ønskelig å effektivt undersøke lukt styrt atferd overfor mange dufter og lukt blandinger. Å direkte relatere atferd til neuronal aktivitet, bør oppførsel kvantifiseres i en sammenlignbar tidsramme og under identiske stimulanse betingelser som i nevrofysiologiske eksperimenter. Men mange i dag brukes olfactory bioanalyser i Drosophila neuroethology er ganske spesiellized enten mot effektivitet eller mot oppløsning.
Flywalk, en automatisert lukt levering og sporingssystem, bygger bro mellom effektivitet og oppløsning. Det gjør det mulig å bestemme nøyaktig når en lukt pakke stimulert et fritt vandre fly, og å bestemme de dynamiske animal's adferdsreaksjon.
Introduction
Det overordnede målet for enhver neuroethological forskning er å etablere en årsakssammenheng mellom aktivitets delstatene enkeltnerveceller eller nevrale kretser og oppførselen til en organisme. For å oppnå dette målet neuronal aktivitet og atferd bør overvåkes under identiske stimulanse forhold og disse stimulerings forholdene bør ideelt sett være lik de nervesystemet under gransking utviklet seg til å få orden på. Særlig når det gjelder atferds bioassay, har disse kravene historisk vist seg ganske krevende i Drosophila melanogaster lukte neuroethology.
Når frigjort fra kilden, lukt fjær hurtig brytes opp i tynne filamenter med turbulent diffusjon på grunn av luftbevegelse er den viktigste determinant av lukt fordeling 1. Som et resultat av et insekt navigere mot en lukt kilde opplever periodisk stimulering med lukt pakker ispedd varierende intervaller på ren luft. Bådeturgåing og flygende insekter - inkludert Drosophila - har vist seg å utnytte dette intermitterende stimulering regime for navigasjon ved fosser motvind på skyen møte og overveiende flytte cross-vind i fravær av lukt 2 - 5. Mens stimulerings prosedyrer i fysiologiske eksperimenter i stor grad etterligne de et insekt kan oppleve i sitt naturlige miljø ved å tilby enkle drag av lukt ispedd lengre ren luft eller dynamiske stimulerings sekvenser 6 - 11, mange atferds bioanalyser brukes i Drosophila neuroethology som felle assay , arenaer åpen felt eller T-labyrint stole på lukt-gradienter 12 - 15. Men fordi lukt gradienter per definisjon er variabel i konsentrasjon, avhengig av avstanden fra kilden lukt, en spesiell oppførsel kan ikke tilbakeføres til en presis lukt-konsentrasjon ved hjelp av disse paradigmer. I tillegg er skråningen aven lukt gradient kritisk avhengig av fysiokjemiske egenskaper av odoranten. En stigning på en svært flyktig forbindelse vil være grunnere enn det som er opprettet av en mindre flyktige sammensatte og derfor også vanskeligere å spore for en organisme å stole på å måle konsentrasjonsforskjeller i rommet som det eneste middel til navigasjon 16-20, noe som kan føre til en feiltolkning av luktpreferanser spesielt i valg analyser. Denne effekten er også svært skadelig når etterforsker oppførsel mot lukt blandinger fordi det fører til forskjellige blanding komponentforhold på hvert punkt i rommet og derfor igjen utelukker en klar sammenheng mellom fysiologi og atferd.
Mens eddik fluer tendens til å aggregere på fermen frukt, de er ensomme i sin navigering mot matkilder og egglegging nettsteder. Likevel, i stedet for testing enkeltdyr mange atferds paradigmer brukes i Drosophila neuroethology undersøke lukt guidet oppførsel av årskull av fluer og tiltrekning er scoret som brøkdel av fluer som velger lukt over en kontroll stimulans. Disse cohort eksperimenter har bidratt sterkt til forståelsen av fly neuroethology og mange av de observasjonene som ble gjort ved hjelp av dem kunne bekreftes i enkeltflue eksperimenter. Imidlertid har det vært observert at fluer kan påvirke hverandres beslutning 21 og i ekstreme tilfeller evalueringen av en lukt kan bytte fra likegyldighet til unngåelse avhengig av befolkningstetthet 22. I tillegg resultater fra slike eksperimenter gir ofte bare endepunktet av en sekvens av atferds beslutninger heller enn å observere hva flua gjør mens den gjør det, som ville være ønskelig når du forsøker å relatere atferd med neuronal aktivitet. Disse ganske lav oppløsning kohortstudier eksperimenter kontrasteres med høy oppløsning single-flue metoder som tethered fly arenaer og tredemøller som tillaterfor en direkte observasjon av atferdsmessige responser på det tidspunkt stimulus presentert 20,23,24. Likevel kohort eksperimenter er fortsatt populære, fordi de er svært effektive og gi robuste resultater selv ved sammenlign lav utvalgsstørrelser fordi inter-individuelle og inter-rettssaken variasjon er delvis gjennomsnitt ut på grunn av observasjon av populasjoner over lengre tidsperioder. Mens tethered fly og tredemølle trolig gi gullstandarden om stimulus presentasjon og tidsmessig oppløsning, er arenaene som brukes designet for enkelt dyr, og det er derfor tidkrevende å få prøvestørrelser nødvendig for en statistisk analyse. Flere andre tilnærminger har nylig blitt utviklet som gjør at en effektiv oppkjøp av høyoppløste atferdsdata i kombinasjon med et veldefinert stimulus regime. Disse inkluderer unsupervised 3D-sporing av flere eddik fluer i en vindtunnel i kombinasjon med en nøyaktig 3D-modell av lukt plume 5 25 og Flywalk paradigmet 26.
I Flywalk, er 15 individuelle fluer som ligger i små glassrør og kontinuerlig overvåket av en overhead kamera med røde lys. Lukt tilsettes til en kontinuerlig luftstrøm på 20 cm / sek og reise gjennom glassrørene ved en konstant hastighet. Luftstrømmen er fuktet ved å føre det gjennom 250 ml flasker som inneholder destillert vann (luftfuktere) før vi går lukt leveringssystem. De flies' posisjoner blir registrert innenfor et kvadratisk område av interesse (ROI) som omfatter det meste av lengden av lukt rørene (men eksklusive de ytre kanter av rørene (ca 5 mm på hver side) der fluene ikke kan bevege seg videre opp- eller medvind) i tiden rundt lukt presentasjon (figur 1A, B). Flyr identiteter holdes konstant ved hjelp av sporingssystemet throughout forsøket på grunnlag av sine Y-posisjoner (dvs. deres glass tube grenser). Lukt stimulering oppnås ved hjelp av en flerkomponent stimulus anordning som tillater presentasjonen av opp til 8 enkelt lukt og alle mulige blandinger derav 26,29 (figur 1B). I løpet av et eksperiment blir styrt av en datamaskin som regulerer luktavgivelsessystem og oppsamling av temperatur og fuktighet informasjon (data 1, figur 1C). Denne datamaskinen styrer også en datalogger (start / stopp opptak) på en annen datamaskin som kontinuerlig sporer flue stillinger på 20 bilder per sekund (datamaskin 2). Fly stillinger, lukt ventil status (dvs. tids poenget med ventilåpning), lukt ID, temperatur og luftfuktighet rundt lukt stimuleringssykluser er logget på datamaskinen 2. På denne måten informasjon om lukt og fly posisjoner er synkronisert og eksporteres som CSV-filer som kan bli videre bearbeidet og analysert ved bruk av tilpassede skrevne analyserutiner. Fordihele systemet er datastyrt, er det ikke nødvendig med menneskelig inngripen under en eksperimentell økt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Konstruksjons- og tekniske detaljer for Flywalk har blitt beskrevet andre steder 26 (i tilfelle noen problemer med å etablere dette satt opp, ytterligere informasjon kan fås fra MK). Her fokuserer vi på detaljerte instruksjoner om håndtering av paradigmet som vil bidra til å få pålitelige resultater.
1. Fly Håndtering
- Bakre flyr i lav til middels tetthet kulturer på mat medium 27 i henhold til en 12 timer: 12 timers lys: mørke-regimet ved 23-25 ° C og 70% relativ fuktighet. For å oppnå dette, la 20-30 nylig dukket voksen flyr å reprodusere i en stor mat hetteglass for en uke, og deretter kaste voksne fluer og vente på avkom å dukke opp.
- Samle 30-40 nylig oppståtte (alder <24 timer) voksne fluer og alder dem på i ny hetteglass inneholder mat medium 27 for 3-5 dager.
- Tjuefire timer før starten av atferds eksperiment: Overfør all 30-40 tidligere innsamlet 3-5 d gamle (se 2.2) flyr til en ny vial inneholder en fuktig skumgummi plugg eller en fuktig tørkepapir ved hjelp av en vifte.
MERK: Ikke bedøver fluer ved hjelp av CO 2.
2. Utarbeidelse av Flywalk Setup
- Bruk 250 ml flasker som luftfuktere. Fyll luftfuktere med 100 ml destillert vann.
- Forbered lukt ampuller.
- Forbered 500 ul 10 -3 fortynninger av rene lukt etylacetat, etyl- butyrat, isopentyl-acetat og 2,3-butandion i løsningsmidlet mineralolje.
- Fest to kuleventiler pr lukt hetteglass. Merk at innsjekking ventiler gjør for ensrettet luftstrøm. Derfor kobler ventiler slik at luft kan komme inn i hetteglasset på den ene siden og la den på den andre siden.
- Fjerne lokket på en 200 pl PCR-reaksjonsrøret. Pipette 100 mL av hver lukt fortynning i et eget reaksjonsrøret og plassere rørene i egne lukt ampuller. Også forberede en lukt hetteglass som bare inneholder løsemiddel mineral oil.
- Tett forsegle lukt ampuller ved å lukke dem ved hjelp av rustfritt stål plugger og gummipakninger.
- Koble de 5 lukthetteglass (4 inneholder lukt og en som inneholder mineralolje) til lukt leveringssystem. Sørg for å koble dem i riktig strømningsretningen. En feil forbindelse vil ikke bare svekke planlagte eksperiment, men det kan også forurense leveringssystemet.
- Sjekk for lekkasjer ved å forsegle utløpet av blandekammeret av stimulus-enheten. Sørg for at alle luftmengder før stimulus-enheten nå gradvis falle til null. Hvis ikke, sjekk for lekkasjer som nå kan identifiseres av den hvesende lyden av luft som forlater systemet.
- Nøye overføre 15 individuelle fluer til 15 individuelle glassrør ved hjelp av en vifte og nære glassrør på begge sider ved hjelp av de tilsvarende adaptere.
Merk: Fordi systemet må være hermetisk lukket for vellykkede eksperimenter, at adaptere passer glassrør tettog merk at glassrør kan brekke i dette trinnet. Pass på å unngå skader ved iført hansker og vernebriller. - Koble glassrørene til Flywalk oppsett og, herfra videre, vent i minst 15 minutter før du starter eksperimentet for å tillate fluer å tilvenne seg det nye miljøet.
- Etter å feste glassrør: sjekk avlesning av nedstrøms digitale strømningsmålere på datamaskinen en hvis de 16 luftmengder etter glassrørene legge opp til luftstrømmen inn i systemet. Sjekk også på datamaskinen 1, hvis luftfuktigheten er mellom 60% og 80%.
- Design stimulans protokollen kontrollere sekvensen og timing av lukt stimuli presenteres for fluene. For å oppnå for eksempel de beskrevne data, presentere 4 lukt og kontrollen (mineralolje) enkeltvis og alle mulige ternære og kvaternære blandinger av lukt samtidig i 40 ganger hver. Satt pulsvarigheten til 500 msek på en interstimulus intervall på 90 sek og random stimulans sekvens.
- Slå på likjempe kilde (LED-klynge, λ = 630). Sørg for å gi nok lys for effektiv sporing uten å øke temperaturen inne glassrørene.
- Å sette opp et område av interesse av sporingssystemet ved å dra en ramme over hele området som skal overvåkes på en slik måte at alle 15 glassrør er inkludert og omtrent 5 mm fra kantene av rørene er utelukket.
- Sett opp 14 parallelle skillelinjene mellom individuelle rør i sporingssystemet ved å endre sine Y-posisjonene i tilsvarende script for å holde enkelte fluer identifiserbar gjennom hele forsøket. Pass på å plassere dem på en slik måte at det er alltid en glassrør mellom to slike skillelinjer, fordi bare ett fly vil bli sporet mellom et sett med to linjer.
- Sørg for å sette kameraets parametere slik at fluene er pålitelig spores gjennom glassrørene. Hvis fluer er tapt på kantene av regionen av interesse, øke lysstyrken eller gevinst av sporings software. Unngå mekaniske vibrasjoner av sporingssystemet. Spor bruker kommersiell programvare i henhold til produsentens protokoll.
- Start eksperiment ved å starte stimulus-protokollen. Post flies' XY-koordinater ved 20 fps (bilder per sekund) og logg i kombinasjon med lukt ventil status i tekstfiler.
3. Data Analysis
MERK: Følgende trinn i dataanalyse er automatisert ved hjelp av skredderskriftlige rutiner som er programmert i R. Fordi disse trinnene er avgjørende for å få meningsfulle resultater analysen vil likevel bli presentert i en steg-for-steg måte. Rådata for analyse er CSV-filer som inneholder synkronisert informasjon om lukt ventil status, puls nummer i forsøket og 15 fly x-posisjoner i cm på en felles tidsakse for en lukt stimulering syklus. Definert kode for dataanalyse kan tilbys på forespørsel.
- Åpne CSV-fil, finne tid punktet av ventilåpningen varsles med en change i kolonnen representerer ventilens status.
- Beregn lineær funksjon av lukt posisjon på skjemaet
f (t) = s * t + i
hvor t er tiden i stimulering syklus, er s vindhastighet (her 20 cm / sek), og skjærings jeg kan beregnes ved hjelp av tidspunkts lukt trenger inn i rørene ved posisjon 0 (ventilåpning pluss forsinkelse). - Finne tid punktet der lukt og fly x-posisjon krysser for hvert fly og sette denne gang-punktet til 0. Merk: Denne måten flue stillinger er justert til hver individets møte med lukt.
- Ekskluder fluer som sitter på de aller kantene av regionen av interesse.
- Beregn hastighet fra X-posisjoner ved å dividere forskyvningen langs x-aksen ved tidsintervallet (100 millisekunder), og gjenta fremgangsmåten for hver stimulering syklus.
- For å oppnå hastighetstids kurs som vist i Figur 2E beregne midlere hastighet tidsforløpet for hver flue og lukt, og fra de mellom tidsforløpet for en gitt lukt.
- For å oppnå forskyvning net som vist i figur 3C beregne netto forskyvning innen 4 sekunder etter lukt puls for hver sporing arrangement og deretter den midlere netto fortrengning pr flue og lukt.
4. Rengjøring Prosedyre
- Clean Glass Tubes
- Fjern fluer og adaptere fra glassrør og suge glassrør i vaskemiddel.
- Skyll glassrør under rennende destillert vann og tørk dem ved hjelp av trykkluft.
- Varme glassrør ved 200 ° C i 8 timer.
- Clean Lukt Delivery System
- Fjern alle lukt ampuller og slanger fra sentralblandekammeret.
- Fjern slangeadaptere fra blandekammeret.
- Ren blandekammeret ved å skylle den med laboratorievaskeoppløsning og løsningsmidler (for eksempel etanol, aceton). Utfør disse trinnene under laboratoriet panseret.
- Tørrblandekammer ved hjelp av trykkluft og varme den ved 200 ° C i 8 timer.
- Clean Lukt Glassflasker og tilbakeslagsventiler
- Fjern stålplugg (forkast gummipakning) og sjekke ventiler fra lukt ampuller og suge alle komponenter i laboratoriet rengjøringsmiddel.
- Sonicate komponenter i en ultralyd bad og skyll dem med destillert vann.
- Rengjør alle komponenter unntatt ventiler med etanol og aceton. Utfør disse trinnene under laboratoriet panseret.
- Tørre komponenter ved hjelp av trykksatt luft og oppvarme dem ved 200 ° C i 8 timer.
- Rene ventiler på innsiden ved å skylle dem med etanol og aceton med en sprøyte (vurdere strømningsretning). Utfør disse trinnene under laboratoriet panseret iført laboratoriebriller. Fordi aceton angriper gummideler, umiddelbart tørre ventiler ved å skylle dem med trykkluft.
- Fjern rester av lukt av pulserende luft gjennom ventiler i flere dager. Bruke en inkubator ved 60 ° C og en 1 sekund luft på / 1 sek luften av regime for dette rensetrinnet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fordi fluer får lov til å fordele seg fritt innenfor sitt glassrør mellom lukt pulser og lukt pulsen beveger seg gjennom glassrørene ved en konstant hastighet fluer støter lukt til forskjellige tider avhengig av deres x-posisjon på tidspunktet for stimulering. Som et resultat, er de sykdomsangrep av oppvinds baner fremkalt av en 500 ms puls av et attraktivt 10 -3 fortynning av etylacetat forsinket med omtrent 1 sek for fluer på vindretningen slutten av sitt glassrør forhold til de av fluer sitter nærmere motvindsenden ved en vindhastighet på 20 cm / sek, og 20 cm glassrør med lengde (figur 2A). Korrigering for den tidsmessige forskjell i lukt møte for hver enkelt basert på sin x-posisjon på tidspunktet for lukt presentasjon avslører at forsinkelser respons overfor etylacetat er konsistente over individer (figur 2B).
Tilsvarende gjennomsnittlig motvind banen uten korreksjon for odor reiser er forsinket med ca 0,5 sek i forhold til gjennomsnittet banen med korreksjon (figur 2C, merk at korreksjon for tiden lukt trenger å gå inn i motvind slutten av glassrørene ble utført for begge baner). I tillegg er den korrigerte midlere motvind banen for en enkeltpuls lukt viser også en brattere skråning (dvs. en høyere ganghastighet) enn den ukorrigerte en (figur 2D). I likhet med de observasjoner for en enkelt lukt puls, under utelatelse av korreksjon for lukt reise fører til en øket forsinkelse og lavere respons amplitude i et fullstendig datasett som består av to eksperimentelle sesjoner (dvs. 30 fluer) med 40 presentasjoner av lukt pulser hver (figur 2E) .
Gjentatte stimulering med 500 msek pulser av attraktive 10 -3 fortynninger av etylbutyrat (ETB), isopentyl acetat (IAA), etylacetat (ETA) og 2,3-butandion (bedn) utløser motvind overspenning på odeller møter i sultet hunnfluer, mens stimulering med løsningsmidlet mineralolje (MOL) fremkaller ingen eller bare svake responser. Mekanisk stimulering alene har tidligere blitt vist å indusere økt bevegelse i en tilsvarende 28 paradigme. Men fordi lukt stimulering i Flywalk paradigmet ikke endrer total luftstrøm og økt bevegelse er stort sett fraværende i kontrollsituasjonen ved hjelp av MOL, disse motvind overspenning reflektere sanne lukt svar. Gjennomsnittlig svartid-kurs er stereotyp over enkeltpersoner (figur 3A) og lukt spesifikk i ventetid, amplitude og varighet (figur 3A, B). Tiltak mot etylacetat vise et skarpt angrep, høy amplitude og kort varighet. I kontrast responser til 2,3-butandion vanligvis vise en litt senere utbruddet, en lavere amplitude og lengre varighet. Etyl-butyrat og isopentyl-acetat fremkalle tilsvarende tidsmessige dynamikk som etylacetat, men responser er lavere i amplitude. Correspondingly, alle 4 lukt utløse en høyere opp mot vinden forskyvning i løpet av 4 sekunder etter lukt støter enn det oppløsningsmiddel og negative kontroll mineralolje (figur 3C).
Ved hjelp av de samme 4 attractants, ble det tidligere vist at binære blandinger av lokke er minst like attraktiv som den mer attraktiv blanding bestanddel 29. Her er denne observasjonen utvidet ved å teste alle mulige trefoldig blandinger og full blanding av alle 4 lokke. I likhet med den forrige observasjon med binære blandinger, alle disse mer komplekse blandinger er minst like attraktiv som den mest attraktive eneste forbindelsen (Figur 4A). Den mest attraktive blandinger er de som inneholder både etylacetat og 2,3-butandion. Svar på disse 3 blander skiller seg ikke vesentlig fra hverandre og også responskinetikk er slående lik (4A, B). I motsetning til dette, å utelate etylacetat fra den fulle Blend fører til en reduksjon i den maksimale hastighet opp mot vinden, mens utelatelse av 2,3-butandion forkorter responsen (figur 4C). Fordi etylacetat utløser korte high-amplitude responser mens 2,3-butandion utløser reaksjoner fra lavere amplitude men lengre varighet (Tall 3B, 4D), disse observasjonene er minner om vår tidligere funn, som respons tids kurs mot blandinger av attractants tendens til å følge en optimal responstid-retters opprettet fra blanding bestanddel responstid-kurs 29. I dette datasettet optimal for alle 4 tiltrekningsmidler kan konstrueres på basis av responstid-kurs mot ethylacetat og 2,3-butandion. Etyl-butyrat og / eller isopentyl-acetat er nødvendig i tillegg å oppnå maksimal ganghastighet observert i respons overfor den fullstendige blanding (figur 4D). Følgelig er økningen i blandingen kompleksitet fra 2 til 3 eller 4 komponenter øker attraktiviteten av blandingen even lenger enn hva som forventes fra forrige observasjon, at tiltakene mot blandinger av lokke representerer en optimal av svarene mot blandings bestanddeler. Likevel, den generelle konklusjonen at bestanddel valens er konservert i luktblandinger er gyldig også for disse mer komplekse blandinger 29.
Figur 1. Prinsipp og utformingen av Flywalk setup. (A) Skjematisk tegning av prinsippet. Gule firkanten: lukt stimulans beveger seg gjennom røret og resulterer i motvind bevegelse av flua; svart objekt: kamera til å spore atferdsmessige reaksjoner. (B) Skjematisk av luftstrømmen gjennom oppsettet med trekull-filtrert luft blir fuktet og delt inn i 8 kanaler, før vi går i lukt leveringssystem 26,30. Blow-up Figur: 1, tre-veis magnetventil pass ing luftstrømmen enten gjennom en tom ampulle (c; kompenserende flow) eller gjennom et hetteglass med lukt kilde (o; lukt flow); 2, kuleventiler for å begrense luftstrømmen i en retning og for å unngå forurensning system; blandekammeret: spesialbygde boksen, som samler luft fra alle magnetventiler og overføringer til å splitte opp bord, hvor luften er delt i 15 glassrør lastet med enkelte fluer og en tube utstyrt med temperatur- og fuktighetssensorer. Merk: flow regulators og strømningsmålere etter glassrør garantere identisk flyt i alle rør. Blå firkant betegner region av interesse (ROI) av sporingssystemet. (C) Skjematisk av informasjonsflyten mellom sporing kamera, sporing datamaskin, og lukt leveringssystemet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
oad / 53394 / 53394fig2.jpg "/>
Figur 2. Fremgangsmåte for og begrunnelsen bak dataanalyse. (A) Individuell fluer møte lukt i forskjellige posisjoner, og derfor forskjellige tider. Venstre panel: Skjematisk av mulige flue stillinger ved tidspunktet for lukt ventil veksling. Høyre panel: Rådata fra x-posisjonene til 15 flyr rundt presentasjon av en 500 ms puls av et 10 -3 fortynning av etylacetat. Note motvind går av individuelle fluer på ulike tidspunkter, avhengig av deres x-stillinger. Venstre stiplet linje: tidspunktet lukt ventil veksling. Lukt møte individuelle fluer blir forskjøvet med en system-iboende forsinkelse for lukt å nå glassrørene (d) og vindhastigheten (w). Derfor er lukt møte beregnes individuelt for hver flue basert på sin x-posisjon. Nederst til høyre: justert x-posisjonene til 15 fluer (grå) og mener x-posisjon (fet svart). (B) Samme data som i A, men korrigert for forsinkelse og vindhastighet. BottOM: justert x-posisjonene av 15 fluer (grå) og betyr X-posisjon (fet rød) etter korreksjon. (C) sammenligning av middelverdien motvind fremdrift av 15 fluer fremkalt av en 500 ms puls etylacetat med og uten korreksjon for lukt reise. Merk at ukorrigert (svart) spor er korrigert for forsinkelsen, men ikke for lukt reise. (D) Mean upwind hastighet på 15 fluer fremkalt av en 500 ms puls etylacetat med og uten korreksjon for lukt reise. Stiplede linjene indikerer hastigheten beregnes ut fra oppvinds fremgang verdiene i C, dristige linjer vise motvind fart etter glatting med en 1 st for 9-punkts Savitzky-Golay filter. (E) Ufiltrert mener motvind hastighet med og uten korreksjon for lukt reise for 30 fluer og 40 pulser av etylacetat hver (dvs. et komplett datasett). Klikk her for å se en større versjon av dennefigur.
. Figur 3. Eksempel svarene for 10 -3 fortynninger av 4 attraktive lukt (A) Fargekodede gjennomsnittlig responstid-kurs av 30 individuelle fluer til 500 msek pulser av 4 lokke og løsemiddel mineralolje (MOL, ETB: etylbutyrat; IAA: isopentyl acetate, ETA: etylacetat; bedn: 2,3-butandion). Hver rad representerer den gjennomsnittlige reaksjonstid-løpet av en enkelt fly. Hvert fly ble presentert med hver lukt for 40 ganger og - fordi fluer får lov til å distribuere fritt og kan forlate regionen av interesse av sporingssystemet - mener responstid kurs er beregnet fra alle komplette baner per fly (n = 7-39 baner per fly og lukt). Gul stolpe representerer lukt puls. (B) Response time-kurs til 4 lokke og løsemiddel mineralolje (n = 30 fluer; middel+/- SEM). (C) Netto upwind forskyvning innen 4 sekunder etter lukt støter (samme data som i (A) og (B), n = 30 fluer). Fylt bokser indikerer statistisk signifikant motvind bevegelse i forhold til den negative kontrollen mineralolje (p <0,05; Wilcoxon signert rank test). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Responses mot trefoldig og kvar blandinger av lokke. (A) Netto motvind forskyvning for 4 lokke og alle trefoldig og kvar blandinger av disse, sortert etter median respons. Ulike bokstaver indikerer statistisk signifikante forskjeller mellom responser (p <0,05; Kruskal-Wallis rang sum test og post hoc Wilcoxon signert rank test; n = 30fluer). Svart boks nedenfor angir blandinger som inneholder etylacetat og 2,3butanedione. (B) Response time-kurs av blandinger som inneholder etylacetat og 2,3-butandion (gjennomsnitt +/- sem; n = 30 fluer). Oppmerksom lignende respons-kinetikk. (C) Sammenligning av responstid-kurs av blandinger uten etylacetat eller 2,3-butandion og responskinetikk fremkalt av hele blandingen (gjennomsnitt +/- SEM, n = 30 fluer). Oppmerksom lavere amplitude uten ETA og kortere responstid uten bedn. (D) Sammenligning av optimal tidsforløpet (stiplet) konstruert av ETA (rød) og bedn (grønn), og den fullstendige blanding. Avskygninger indikere deler av tidsforløpet forklares med ulike blandings bestanddeler. Legg merke til at i en tidligere undersøkelse har det vist seg at responsene overfor binære blandinger av tiltrekningsmidler kan forutsies fra en optimal tidsforløpet opprettet på grunnlag av blandingen bestanddeler tids kurs 29. Dette optimale tidspunktet-kurs for ETA og bedn er vist som enstiplede linjen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om Flywalk systemet synes heller sofistikert ved første øyekast, en gang satt i gang det er lett å bruke og gir svært robuste resultater. For å understreke konsistensen av resultatene produsert med bioassay kan det sies at de representative resultatene vist her ble oppnådd nesten to år etter at noen av resultatene vist i en tidligere studie 29 med en modifisert oppsett ved hjelp av en ny sporing og lyskilde. Likevel er tiltrekkende svar er - til tross for noe høyere respons amplituder - svært like de tidligere utgitt om deres dynamikk.
Det er noen viktige aspekter som bør vurderes spesielt for å oppnå resultater av høy kvalitet ved hjelp Flywalk. Viktigere, fuktighet bør ikke falle under 60% i løpet av et eksperiment. En typisk eksperimentell økt varer i ca 8 timer. Rimelig størrelse kvinnelige CS vill type fluer sultet i 24 timer før exForsøket lett overleve i minst 12 timer i den eksperimentelle oppsettet gitt luftfuktigheten er høy nok. For å unngå problemer knyttet til fuktighet er det lurt å installere en fuktgiver i et tomt glass tube (figur 1B), og for å unngå å plassere flow regulators i luftstrømmen alt mellom luftfuktere og glassrør. Det er også helt avgjørende for datakvalitet at systemet er hermetisk forseglet. Luftmengdene som forlater systemet etter glassrørene skal oppsummere for luftstrømmen inn i systemet. De fleste mislykkede forsøk kan tilskrives lekkasjer i systemet og stor forsiktighet bør tas før starten av forsøket for å sikre at systemet er lufttett. Til slutt, som med noen oppsett brukes i olfaktorisk forskning, er en av de store daglige problemer å unngå forurensning. De fleste av de deler som kommer i berøring med lukt er laget av glass, stål, teflon eller PEEK og kan derfor varmes opp til minst 200 ° C, som er tilstrekkelig til å fjerne mesteparten odors unntatt for de med særlig høye kokepunkter som langkjedete feromoner. Fordi ventiler inneholde gummideler de kan ikke varmes opp så høyt og derfor er den viktigste kilden til forurensning, og det er derfor en spesiell rengjøring protokollen ble utviklet for dem. Likevel er det lurt å holde styr på de lukter en bestemt ventil har kommet i kontakt med. Ved tvil om sin renslighet erstatte det.
Som et kompromiss mellom forankrede analyser og kohort eksperimenter har Flywalk selvsagt også noen ulemper sammenlignet med andre metoder. Paradigmet er svært effektiv når atferd mot en rekke forskjellige stimuli har å bli vurdert og sammenlignet. Spesielt fordi responstiden-kurs på 15 individer til bare en puls av en gitt lukt minner sterkt responstid-kurs oppnådd i et komplett datasett (dvs. 30 fluer og 40 presentasjoner hver, Tall 2D, 2E f.eks hedonic valens bare en lukt må undersøkes. Også tidsoppløsningen av visuelle sporingssystemer er ofte lavere enn for de raskeste bioanalyser som tethered fly eller tredemølle. De korteste respons forsinkelser rapportert i Drosophila lukt guidet oppførsel er godt under 100 msek etter lukt møte i tethered paradigmer 20,23 og dermed faller innenfor et tidsvindu som ikke kan løses ved å analysere data ved 10 Hz. Men tiltrekkende responser i Flywalk begynner vanligvis i løpet av første 100-300msek (figur 3B), som er godt i tråd med oppvinds overspennings forsinkelser observert i frittflygende fluer 5. Det gjenstår derfor å bli bestemt om denne forskjellen i respons forsinkelser i tethered paradigmer i forhold til vindtunnel og Flywalk er forårsaket av forskjeller i romlig og / eller tidsoppløsningen i visuell sporing paradigmer eller ved en høyere arousal tilstand av fluer i tethered situasjon.
Oppsummert er Flywalk en nei-valg bioassay, som kombinerer svært kontrollert stimulus presentasjon av forankrede analyser med effektiviteten av kohortstudier eksperimenter regelmessig brukt i Drosophila neuroethology. Fordi det samme settet av enkeltpersoner kan bli utfordret med en rekke forskjellige stimuli, ligger dens særlig styrke i den statistiske kraften når man sammenligner svarene til ulike stimuli. I tillegg utnytter det faktum at fluer surge motvind på møtet av en attraktiv lukt og på denne måten kobler seg lukt evalueringlukt fra kildelokalisering uten behov for en gradient som en retningsbestemt signal. Det bør derfor ideelt egnet til å utnytte optogenetic verktøykasse tilgjengelig i Drosophila.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Daniel Veit for teknisk assistanse og Pedro Gouveia på Electricidade Em Po (electricidadeempo.net) for å tilpasse sporing programvare for våre krav. Vi takker også Tom Retzke for støtte under filmingen prosessen. Denne studien ble støttet av Max Planck Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flywalk setup | Custom | details available upon request | |
| stimulus device | Custom | details available upon request | |
| LED cluster | Custom | details available upon request | |
| HD Pro Webcam C920 | Logitech, Lausanne, Switzerland | ||
| 2 Computers | |||
| Flywalk Reloaded v1.0 software | Electricidade Em Pó (electricidadeempo.net) | ||
| Labview 11.0 software | National Instruments, Austin, TX | ||
| Standard fly food | Custom | ||
| Standard fly vials | Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Standard fly vials | Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| aspirator | Custom | ||
| mineral oil | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | ||
| odors | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | ||
| 200 µl PCR reaction tubes | Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germany |
References
- Murlis, J., Elkinton, J. S., Cardé, R. T. Odor plumes and how insects use them. Annu. Rev. Entomol. 37, 505-532 (1992).
- Kennedy, J. S., Marsh, D.
- Budick, S. A., Dickinson, M. H. Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors. J. Exp. Biol. 209 (15), 3001-3017 (2006).
- Buehlmann, C., Graham, P., Hansson, B. S., Knaden, M. Desert ants locate food by combining high sensitivity to food odors with extensive crosswind runs. Curr. Biol. 24 (9), 960-964 (2014).
- Van Breugel, F., Dickinson, M. H. Plume-tracking behavior of flying Drosophila emerges from a set of distinct sensory-motor reflexes. Curr. Biol. 24 (3), 274-286 (2014).
- Schuckel, J., Meisner, S., Torkkeli, P. H., French, A. S. Dynamic properties of Drosophila olfactory electroantennograms. J. Comp. Physiol. A. 194 (5), 483-489 (2008).
- Geffen, M. N., Broome, B. M., Laurent, G., Meister, M. Neural encoding of rapidly fluctuating odors. Neuron. 61 (4), 570-586 (2009).
- Nagel, K. I., Wilson, R. I. Biophysical mechanisms underlying olfactory receptor neuron dynamics. Nat. Neurosci. 14 (2), 208-216 (2011).
- Martelli, C., Carlson, J. R., Emonet, T. Intensity invariant dynamics and odor-specific latencies in olfactory receptor neuron response. J. Neurosci. 33 (15), 6285-6297 (2013).
- Szyszka, P., Gerkin, R. C., Galizia, C. G., Smith, B. H. High-speed odor transduction and pulse tracking by insect olfactory receptor neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (47), 16925-16930 (2014).
- Nagel, K. I., Hong, E. J., Wilson, R. I. Synaptic and circuit mechanisms promoting broadband transmission of olfactory stimulus dynamics. Nat. Neurosci. 18 (1), 56-65 (2014).
- Larsson, M. C., Domingos, A. I., Jones, W. D., Chiappe, M. E., Amrein, H., Vosshall, L. B. Or83b encodes a broadly expressed odorant receptor essential for Drosophila olfaction. Neuron. 43 (5), 703-714 (2004).
- Knaden, M., Strutz, A., Ahsan, J., Sachse, S., Hansson, B. S. Spatial representation of odorant valence in an insect brain. Cell Rep. 1 (4), 392-399 (2012).
- Zaninovich, O. A., Kim, S. M., Root, C. R., Green, D. S., Ko, K. I., Wang, J. W. A single-fly assay for foraging behavior in Drosophila. J. Vis. Exp. (81), e50801 (2013).
- Farhan, A., Gulati, J., Groβe-Wilde, E., Vogel, H., Hansson, B. S., Knaden, M. The CCHamide 1 receptor modulates sensory perception and olfactory behavior in starved Drosophila. Sci. Rep. 3 (2765), 1-6 (2013).
- Flügge, C. Geruchliche Raumorientierung von Drosophila melanogaster. Z. Vgl. Physiol. 20 (4), 462-500 (1934).
- Borst, A., Heisenberg, M.
- Louis, M., Huber, T., Benton, R., Sakmar, T. P., Vosshall, L. B. Bilateral olfactory sensory input enhances chemotaxis behavior. Nat. Neurosci. 11 (2), 187-199 (2008).
- Gomez-Marin, A., Stephens, G. J., Louis, M. Active sampling and decision making in Drosophila chemotaxis. Nat. Commun. 2 (441), 1-10 (2011).
- Gaudry, Q., Hong, E. J., Kain, J., de Bivort, B. L., Wilson, R. I. Asymmetric neurotransmitter release enables rapid odour lateralization in Drosophila. Nature. 493 (7432), 42442-42448 (2013).
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S.
- Ramdya, P., Lichocki, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2014).
- Bhandawat, V., Maimon, G., Dickinson, M. H., Wilson, R. I. Olfactory modulation of flight in Drosophila is sensitive, selective and rapid. J. Exp. Biol. 213 (21), 3625-3635 (2010).
- Duistermars, B. J., Chow, D. M., Frye, M. A. Flies require bilateral sensory input to track odor gradients in flight. Curr. Biol. 19 (15), 1301-1307 (2009).
- Claridge-Chang, A., Roorda, R. D., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
- Steck, K., Veit, D., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction - The Flywalk. Sci. Rep. 2 (361), 1-9 (2012).
- Lewis, E. B. A new standard food medium. Drosoph. Inf. Serv. 34, 117-118 (1960).
- Lebestky, T., Chang, J. S. C., et al. Two different forms of arousal in Drosophila are oppositely regulated by the dopamine D1 receptor ortholog DopR via distinct neural circuits. Neuron. 64, 522-536 (2009).
- Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. Compound valence is conserved in binary odor mixtures in Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 217 (20), 3645-3655 (2014).
- Olsson, S. B., Kuebler, L. S., et al. A novel multicomponent stimulus device for use in olfactory experiments. J. Neurosci. Meth. 195 (1), 1-9 (2011).
