Introduction
الضغط الحاملة الأنسجة مثل الغضاريف المفصلية أو الأقراص الفقرية تتكون من مناطق الأنسجة غير المتجانسة التي تعتبر بالغة الأهمية لكلا ظيفة النشاط الحيوي ومناسبة والميكانيكية تنبيغ في الأنسجة. ليس فقط هو تنظيم الخلوية وظيفة متميزة في مختلف المناطق، ولكن تباينت مصفوفات خارج الخلية (ECM) أيضا في تكوين وتنظيم. على سبيل المثال، والغضروف المفصلي يتكون من ثلاث مناطق رئيسية مع اختلاف شكل الخلية، وظيفة الميكانيكية، وECM. الاختلافات في المبادرة ECM لالتفاضلية المسؤوليات الحاملة. وتشارك الطبقة السطحية في المقام الأول ردا الشد لتحميل، في حين أن المناطق الوسطى وعميقة مسؤولة أساسا للاستجابة لضغط 1. وبالمثل، في القرص الفقري، وحاصرت النواة اللبية هلامية من التليف رقائقي بالطوق والخلايا داخل هذه المناطق متميزة اثنين من تجربة أنواع مختلفة من المحفزات الطبيعية الحيوية2. في هذا النوع من الأنسجة والخلايا ومصفوفات خارج الخلية داخل طبقات الأنسجة تتفاعل مع بعضها البعض كما يخضع الأنسجة وتستجيب لقوى ميكانيكية.
تبقى خلاصة من هذه الهياكل الأنسجة غير المتجانسة تحديا في هندسة الأنسجة والطب التجديدي، وفهمنا من الأهمية البيولوجية محدودة. هناك حاجة لزراعة منصات لتحليل الأنسجة الطبقية وكذلك شارك في ثقافات مجموعات مختلفة من الخلايا في بناء واحد. في هندسة الأنسجة الغضروف المفصلي، تم تشييد بنيات-سقالة أقل الطبقات عن طريق تسخير قدرة غضروفية مناطقية لإيداع ECM متنوعة لتقليد طبقات مختلفة من هذا النسيج 3،4. ومع ذلك، توفر بنيات هيدروجيل الطبقات فرصة لتحقيق تفاعل الأنواع المختلفة للسكان الخلية التي تفتقر إلى القدرة على تكوين الأنسجة قوية بشكل مستقل. على سبيل المثال، والبوب مختلفةulations الخلايا الجذعية الوسيطة يمكن أن يشترك في تربيتها داخل بنيات الطبقات. وقد استخدمت هذه السقالات الطبقات مع كل غضروفية والتفريق الخلايا الجذعية الوسيطة لتحسين هندسة الأنسجة 5. لا يمكن إلا أن يكون شارك في تربيتها السكان مختلفة من الخلايا في طبقات هيدروجيل مماثلة، ولكن يمكن أيضا نوع وحيد الخلية يمكن تربيتها داخل الطبقات التي تم التلاعب بها لديك متفاوتة الصلابة أو المحتوى الكيميائي لانتزاع استجابات مختلفة من الخلايا 6،7.
وقد استخدمت العديد من الهلاميات المائية بيولوجية مختلفة لطبقة السكان الخلية لهندسة الأنسجة الغضروف مثل تلك التي تستخدم البولي ايثيلين جلايكول أو بولي فينيل الكحول قواعد 7-9. ومع ذلك، الهلاميات المائية الجينات هي واحدة من أبسط المواد الحيوية من خلالها إنشاء السقالات الطبقات لدراسة السكان الخلية غير متجانسة في الثقافة المشتركة. في حين شكلت أيضا الهلاميات المائية الاغاروز بسهولة، الهلاميات المائية الجينات لها فائدة إضافية تتمثل في السماح السهل هوolation من الخلايا من بناء 3-D لتحليل الخلايا الفردية كما وصفت سابقا 10. في دراسات سابقة، وقد تم تشكيل الهلاميات المائية الجينات ثنائية الطبقات في صفائح رقيقة ومن هذه الأوراق، وشرائح أقسام (على سبيل المثال، باستخدام لكمة خزعة) لتطبيقات معينة مثل لتحليل المحتوى الكيميائي أو خصائص القص بينية 11،12. وقد وصفت طريقة أخرى لتشكيل صفائح الجينات رقيقة مع إمكانية التقسيم إلى طبقات متعددة، ولكن لا يزال يتطلب تغيير في هيدروجيل لاستخدامها في اختبار الميكانيكية 13.
هنا، فإننا نقدم وسيلة لخلق بتكاثر أقراص هيدروجيل الجينات ثنائية الطبقات لاستخدامها في زراعة-المشارك مجموعات مختلفة من الخلايا. هذه المنصة القرص الجينات تمتلك العديد من المزايا. في المقام الأول، وشكل استنساخه وحجم صغير يؤدى لالتحفيز الميكانيكي للخلايا جزءا لا يتجزأ من دون الحاجة إلى خزعة بوNCH أو غيرها من التغيير المادي للهيدروجيل للعديد من التطبيقات. بالإضافة إلى ذلك، لا تزال بقاء الخلية عالية أثناء عملية التصفيف، وبعد تشكيل هلام فصل واضح من السكان الخلية اثنين داخل هلام غير مرئية مع أي منطقة متداخلة الأولية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد لتشكيل الجيني أقراص
- إعداد 4٪ (ث / ت) حل الجينات في الفوسفات مخزنة المالحة 1X Dulbecco ودون كلوريد الكالسيوم وأضاف أو كلوريد المغنيسيوم وقعت في 37 ° C حمام الماء. تركيزات الحل الجينات يمكن أن تختلف، ولكن 1-4٪ (ث / ت) ينصح حلول الجينات.
- مزيج الحل الجينات في نسبة 1: 1 مع قاعدة الوسائط زراعة الخلايا الحارة (على سبيل المثال، Dulbecco لتعديل النسر متوسطة.) لنوع من الخلايا المطلوبة. تركيز الجينات هو الآن نصف تركيز الأصلي، أي، 2٪ (ث / ت). تعقيم الجينات / حل الوسائط باستخدام معقم 0.2 ميكرومتر مرشحات حقنة النايلون.
- يعد حمام من معقمة 102 ملم ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم في الماء المعقم مع حل ما يكفي لغمر قوالب (~ 200-300 مل).
- جمع العقيمة "قالب تشكيل هلام" (6 مم × 3 مم طويل القامة آبار اسطوانية 3 في × 3 في لوحة الألومنيوم، انظر
- قطع ورقة سميكة فلتر (مرشح ورقة نشافة) وغشاء الخلية microsieve (10 ميكرون حجم المسام) لأحجام أعلى وأسفل الصفائح الطرفية ووضعها في الحمام كلوريد الكالسيوم حتى المشبعة، حوالي 1 دقيقة. إذا رغبت في ذلك، وتعقيم ورقة الترشيح سميكة والغشاء microsieve عبر الأوتوكلاف أو الأشعة فوق البنفسجية ضوء لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام.
- انشاء نصف (النصف السفلي) من العفن بناء.
- وضع العناصر التالية فوق بعضها البعض في الترتيب التالي وتنعيم باستخدام ملعقة العقيمة: endplate كبيرة (3 × 3 في في)، ورق الترشيح سميكة، ثم الغشاء microsieve.
- عكس واضغط على العفن على كومة من المناشف الورقية لضمان فقدان محلول كلوريد الكالسيوم الزائد.
- وضع "هلام تشكيل العفن" مع آبار اسطوانية على أعلى جالذراع غشاء microsieve وبلطف ربط القالب معا على الجانبين باستخدام مقاطع الموثق على الجانبين الأيسر والأيمن. تأكد من ترك مساحة كافية لendplate أعلى (1.5 بوصة × 3 في) لتغطية الآبار في وقت لاحق تماما.
- انشاء النصف الثاني (النصف العلوي) من العفن بناء.
- وضع العناصر التالية فوق بعضها البعض في الترتيب التالي وتنعيم: endplate صغيرة، ورق الترشيح سميكة، وغشاء microsieve.
- عكس والضغط على هذا النصف من العفن على كومة من المناشف الورقية لضمان فقدان محلول كلوريد الكالسيوم الزائد. لا أربط هذا الشوط من العفن باستخدام مقاطع الموثق في هذا الوقت.
ملاحظة: عند استخدام هذا الأسلوبلجعل الطبقات مع أنواع مختلفة من الخلايا، للتأكد من أنواع الخلايا ثقافة اثنين بشكل متواز لطبقات. الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة) المصنفة في مناطق ذات كثافة خلية من 1 × 10 6 خلية / مل سوف تستخدم كمثال لبروتوكول التالي. عدد الخلايا وعدد القرص يمكن زيادتها لتجارب حسب الحاجة.
- أسبوع إلى أسبوعين قبل التضمين، الخلايا الجذعية الوسيطة البذور في مناطق ذات كثافة خلية من 3000 - 5000 خلية / سم 2 في 10 مل من وسائط النمو القاعدية (Dulbecco لتعديل النسر متوسطة، و 10٪ مصل بقري جنيني، 2٪ L-الجلوتامين، 1 ٪ غير الاساسيين الأحماض الأمينية، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين) في T-75 قوارير.
- إزالة وسائل الاعلام وقضي كل 2-3 أيام واستبدالها مع 10 مل من وسائط النمو القاعدية حتى الخلايا هي 80-90٪ متموجة.
- حصاد الخلايا، وإزالة وسائل الاعلام المستهلك، وماصة 3 مل من الفوسفات مخزنة المالحة 1X Dulbecco ودون كلوريد الكالسيوم المضافة أو كلوريد المغنيسيوم لشطف الخلايا. إزالة هذا الحل، ماصة 3 مل من 0.25٪ في محاولةpsin-EDTA على نمو الخلايا في T-75 قوارير، واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد خلايا رفعت من على سطح الأرض ملتصقة، إضافة 6-9 مل من وسائط النمو القاعدية.
- اللجان الدائمة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، نضح طاف، وإعادة تعليق في 1-5 مل من وسائط النمو القاعدية. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات باستخدام تعليمات الجهاز.
- إزالة 1 × 10 6 خلايا من إجمالي إعادة تعليق الخلية، وأجهزة الطرد المركزي التي تستخدم نفس الظروف، ونضح طاف.
2. تشكيل خلية المصنفة الجيني أقراص
- إعادة تعليق بيليه خلية مع 1 مل من محلول الجينات / وسائل الإعلام العقيمة لتحقيق كثافة الخلية من 1 × 10 6 خلية / مل. سوف الخليط الخلية الجينات يكون غائما متجانس في المظهر عندما خلايا ممزوجة بشكل مناسب.
- ماصة 130 ميكرولتر من خليط الخلية الجينات إلى ستة 6 مم × 3 مم الآبار طويل القامة في النصف السفلي من العفنبناء قطرة قطرة، حتى لا تخلق أي فقاعات. وينبغي أن يكون الغضروف المفصلي محدب طفيف مرئية فوق حافة كل بئر.
- تنعيم بعناية النصف العلوي من العفن بناء باستخدام ملعقة معقمة وتحويل أكثر من ذلك، حتى أن غشاء الخلية microsieve على رأس الآبار. مكان القالب بناء على أعلى من الآبار، مع التأكد من تغطية الآبار التي تحتوي على خلية وخليط الجينات تماما.
- رفع القالب بناء تحميلها، وأثناء الضغط لأسفل بشدة على المركز، الموثق كليب الجانبين المتبقية (العلوي والسفلي) لربط شطري العلوية والسفلية من القالب بناء. الحلول الخلية الجينات يجب أن تقع بشكل آمن في الآبار في هذا الوقت.
- تزج بناء العفن تثبيتها في الحمام كلوريد الكالسيوم 102 ملم، والتأكد من أن بناء كامل مغمورة. احتضان في الخلية هود الثقافة في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة.
- في نهاية ال 90 دقيقة، وإزالة بناء قالب من كلوريد الكالسيوم 102 مليحمام ومكان على كومة من المناشف الورقية في الخلية هود الثقافة. إزالة جميع مقاطع الموثق أربعة وفصل نصفي القالب بناء. الهلاميات المائية التي تشكلت في الآبار لا ينبغي أن يكون أي فقاعات، وينبغي ملء الآبار تماما.
- باستخدام ملعقة، وتتبع بعناية حافة الآبار التي تحتوي على الهلاميات المائية لتخفيف بعناية ووتد من الهلاميات المائية. بعد إزالة الهلاميات المائية من العفن بناء، وإسقاط الهلاميات المائية مباشرة إلى حمام من الفوسفات مخزنة المالحة 1X Dulbecco ومع كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم. تغطية المواد الهلامية تماما ليغسل محلول كلوريد الكالسيوم الزائد عن 1-5 دقائق.
- نقل الهلاميات المائية إلى حل القاعدية وسائط النمو في طبق المطلوب (على سبيل المثال، 6 لوحات أيضا) التي تغطي تماما الهلاميات المائية. احتضان لمدة لا تقل عن 1 ساعة في الحاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 قبل المتابعة إلى الخطوة طبقات.
ملاحظة: الهلاميات المائية التي تحتوي على خلايا يمكن أن تبقى فيهو المطلوب حاضنة الثقافة الخلية إلى أجل غير مسمى في هذا الوقت حتى طبقات من المواد الهلامية مع السكان خلية أخرى، شريطة أن يتم الانتهاء من التغييرات وسائل الاعلام كل 2-3 أيام.
3. طبقات من الجينات أقراص
- خلال النصف ساعة الأخيرة من حضانة 1 ساعة، جمع وإعداد قوالب معقمة وحل لوالصلب والمواد الهلامية.
- إعداد "العفن قطع" بواسطة الربط قالب التي لديها آبار نصف ذروة "هلام تشكيل العفن" (6 مم × 1.5 مم الآبار طويل القامة في 3 في × 3 في لوحة الألومنيوم) إلى endplate (3 في العاشر 3 في لوحة الألومنيوم) باستخدام مقاطع الموثق على الجانبين الأيسر والأيمن.
- إعداد "القالب الصلب" بواسطة الربط قالب الذي هو 3 مم أكبر في القطر من "تشكيل العفن هلام" (مم 9 × 3 مم الآبار طويل القامة في 3 في × 3 في لوحة الألومنيوم) إلى endplate (3 في العاشر 3 في لوحة الألومنيوم) باستخدام مقاطع الموثق على الجانبين الأيسر والأيمن.
- يعد حل100 ملي سترات الصوديوم / 30 ملي EDTA (الصوديوم سترات ثنائي الهيدرات، ethylenediaminetetraacetic حمض رباعي ملح ثنائي الهيدرات) في الماء المعقم.
- إزالة المواد الهلامية من السكان الخلية المطلوبة (في هذا المثال، اثنين من الأقراص مع hMSCs) من وسائل الإعلام في الطبق، وتضع في الآبار "قطع قالب". كل هلام ينبغي أن تناسب بشكل مريح في الآبار مع نصف من هلام جاحظ فوق القالب.
- باستخدام مشرط، شريحة الجل على طول سطح القالب (وهذا سوف يقلل هيدروجيل في نصف). الوجه النصف العلوي من هلام ووضعه في العفن جيدا مفتوحة. يجب النصف من هلام أيضا تناسب بشكل مريح في القالب بشكل جيد، ولكن الآن كل من المواد الهلامية نصف ينبغي أن يكون ارتفاع القالب مع السطح الداخلي قطع مرئية. كرر مع هلام الثاني.
ملاحظة: تحذير: سوف فقط قطع الأسطح الداخلية تشكل أقراص الطبقات. وذلك باستخدام الأسطح الخارجية يؤدي إلى فصل نصفين. ويشتبه في أن نسيج من الغشاء microsieve نقلها على سطح هلام منعالصورة نجاح عملية الصلب. - ضع قطعة من جفاف الغشاء الخلوي microsieve على الجزء العلوي من الآبار، والتأكد من أن غشاء microsieve على اتصال مع كل من نصفي هلام إلى أن صلب وتغطيتها تماما. ضع ورق الترشيح سميكة على رأس الغشاء microsieve، مع التأكد من تغطية المواد الهلامية تماما.
- ماصة حل من 100 ملي سترات الصوديوم / 30 ملي EDTA (ثنائي الهيدرات سيترات الصوديوم، Ethylenediaminetetraacetic حمض رباعي ملح ثنائي الهيدرات) على ورقة الترشيح سميكة حتى يتشبع بها. ما يقرب من 750 ميكرولتر كافية لأربعة آبار.
- احتضان المواد الهلامية لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم، وإزالة غشاء الخلية microsieve وورق الترشيح سميكة والتخلص منها. إزالة لقطات الموثق وفتح القالب.
- لكل جيل صلب، ونقل احد سيترات الصوديوم / المعالجة EDTA نصف هيدروجيل إلى استعداد "القالب الصلب" مع سطح قطع متجهة لأعلى. وسيكون هذا نصف CONST صلبruct.
- باستخدام ملعقة، ورفع ووضع سيترات الصوديوم الثاني / المعالجة EDTA نصف هلام (قد تحتوي على نوع من الخلايا المختلفة) على هلام بالفعل في "القالب الصلب"، التقليب هذا الشوط الثاني جل بحيث سطح الخفض هو في الاتصال مع سطح قطع من هلام بالفعل في "القالب الصلب".
- اضغط بلطف إلى أسفل على المواد الهلامية اثنين باستخدام ملعقة لإزالة أي فقاعات بين لالهلام اثنين. أيضا، إعادة المواد الهلامية حسب الحاجة للتأكد من أن أنها مباشرة على رأس واحد آخر.
- رفع بلطف "القالب الصلب" ويغرق في حمام كلوريد الكالسيوم 102 ملي لمدة 30 دقيقة. لا تغطي الآبار مع endplate.
- بعد حضانة 30min في، إزالة "القالب الصلب" ووضعه على مناشف ورقية. إزالة لقطات الموثق وفصل القالب من endplate.
- باستخدام ملعقة، وجمع المواد الهلامية صلب ووضعها في الفوسفات مخزنة المالحة و1X Dulbecco ومع كلوريد الكالسيوم ومحمام كلوريد agnesium لغسل المواد الهلامية. وفي وقت لاحق، ونقل الهلاميات المائية صلب وسائل الإعلام ثقافة الخلية في طبق المطلوب (على سبيل المثال، لوحة 6 جيدا) للثقافة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1 يصور تشكيل وطبقات من الهلاميات المائية الجينات. أكملت المواد الهلامية ثنائية الطبقات يحمل الفصل الأول كاملة من السكان الخلية كما هو مبين في الشكل 2. بقاء الخلية من الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان) جزءا لا يتجزأ من داخل هذه الهلاميات المائية ويبقى الطبقات عالية وقابلة للمقارنة إلى الهلاميات المائية السائبة كما هو مبين في الشكل (3). وجرى تقييم الجدوى بعد الصلب، تقطيع المواد الهلامية عموديا للوصول إلى المركز ومن ثم تلطيخ الخلايا الحية في المواد الهلامية صلب مع خلية تعقب الحية، CMFDA (الخضراء) والخلايا الميتة (الحمراء) مع إيثيديوم homodimer-1 باستخدام إرشادات الشركة المصنعة. اتخذت مبائر مداخن Z من سطح قطع باستخدام مجهر مضان ما يقرب من 100 ميكرون في هلام. وقد تم تقدير هذه الصور في صورة 2D واحد. وكانت الخلايا الحية والميتة ثم كميا باستخدام ميزة محلل الجسيمات في برنامج ImageJ.
JPG "/>
الشكل 1: رسم تخطيطي للالطبقات هيدروجيل تشكيل A. صورة من القالب مكدسة لإضافة 2٪ الجينات + خليط الخلية مع تصوير ترتيب التراص للأسفل وأعلى نصفين العفن. B. تخطيطي يصور الداخلي لطبقات من هلام. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تم فصل تمثيلي من بالسكان خلية في الطبقات هيدروجيل نموذج خط الخلية خلايا 293FT كلوة إما ملطخة الحية خلية تعقب CMFDA (الأخضر) أو CMTPX (الحمراء). كانت جزءا لا يتجزأ من كل من هذه المجموعات خلية في 2٪ (ث / ت) أقراص الجينات، وبعد ذلك تم الطبقات نصفين من هذه الأقراص معا. وقطعت قطعة من الجانب CMTPX التعرف عليه أثناء التصوير. شريط مقياس = 100 & #181، م الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): تم صبغ عالية بقاء الخلية داخل الطبقات هيدروجيل بعد التصفيف اكتمال العملية الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان جزءا لا يتجزأ بكميات كبيرة وثنائية الطبقات الهلاميات المائية مع الخلية الحية (الأخضر) تعقب CMFDA والخلايا الميتة (الحمراء) وملطخة إيثيديوم homodimer-1 . وظلت قابلية عالية لكلا الفريقين هيدروجيل بعد عملية التصفيف. مقياس شريط = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
شملت رقم. حضنت اختلافا كبيرا اتجاهات الطبقات هيدروجيل دوري ضغط الاستجابة لدوري ضغط الهلاميات المائية في حاضنة الثقافة خلية لمدة سبعة أيام وتعرض بعد ذلك إلى 0-10٪ ضغط دوري غير محصورة لمدة أربع ساعات في 1 هرتز: ه 4. تم عزل الضغوط الذروة (± SEM) لكل دورة والاتجاهات على مدى فترة التحميل تحليلها. الاتجاهات تحت ضغط دوري غير محصورة 0-10٪ سلالة لالطبقات (ن = 9) والجزء الأكبر (ن = 8) المواد الهلامية تختلف اختلافا كبيرا (ع = 0.03). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، نحن تصف بروتوكول لتشكيل الطبقات أقراص هيدروجيل الجينات لدراسة شارك في ثقافات السكان الخلية متعددة، مثل تلك الموجودة في الأنسجة الطبقات من الناحية الفسيولوجية، على سبيل المثال، والغضروف. هياكل الطبقات، مثل منصة الثقافة وصفها، ويمكن استخدامها لدراسة التفاعل بين اثنين من السكان خلية متميزة تعرض على البيئة ثقافة واحدة أو في الحمل.
الجينات هي السكاريد خطية انيوني التي تم العثور عليها ليكون حيويا واستخدمت بنجاح لعلم الأحياء الغضروف وهندسة الأنسجة البحوث 12،14. تتشكل الهلاميات المائية الجينات باستخدام الكاتيونات ثنائي التكافؤ ليشابك، على سبيل المثال، أيونات الكالسيوم. هذه crosslinks يمكن التراجع عن طريق إزالة الكاتيونات باستخدام خالب، مثل سترات الصوديوم أو EDTA، واستخدمت هذه العملية سابقا لعزل غضروفية التي تم تربيتها في المواد الهلامية 3،4،12. وبالمثل، فإن المبدأ نفسهكما تم تطبيقها بنجاح على التمسك أوراق الجينات في طبقات ثنائية أو حتى مجموعات من الخرز الجينات معا 11،12،15. منصة الموصوفة هنا تعتمد على هذه العملية نفسها، ولكنها تستخدم لتشكيل الهلاميات المائية الطبقات الصغيرة على شكل قرص. هذه عملية من خطوتين التي لأول مرة، يتم تشكيل أقراص الجينات باستخدام قوالب غارقة في حمام الغنية بالكالسيوم. ثم شرائح هذه في نصف وتعامل مع حل مخلبية الكالسيوم لاطلاق سراح محليا أيونات الكالسيوم من الجينات crosslinked. عن طريق وضع هذه الأسطح المعالجة معا وإعادة غمر-الأقراص في حل الغنية بالكالسيوم، وإصلاح crosslinks، مما يبني ثنائية الطبقات. هذه المواد الهلامية الطبقات الصغيرة للقضاء على الحاجة لكمات خزعة لتوليد نماذج سهلة ثقافة متوافقة مع فحوصات وتجارب مثل الاختبارات الميكانيكية، كما هو مبين في الشكل (4)، وبالتالي التقليل من النفايات من الخلايا الثمينة في كثير من الأحيان وكذلك المواد تلفيق.
كما يظهر فيالشكل (3)، وأسفرت هذه العملية من تشكيل وطبقات من الهلاميات المائية في قابلية عالية على نحو مماثل مثل التحكم أو الهلاميات المائية السائبة تشير إلى أن هذا الإجراء ليس فرض ضرائب مفرطة للسكان الخلية على الرغم من طول وغياب تجديد المواد المغذية. عدم وجود منطقة متداخلة الأولية في هلام يسمح الفصل المادي خلال الأولية شارك في الثقافة والقدرة على ملاحظة التغييرات على تلك الواجهة مع مرور الوقت. وقد أظهرت الدراسات أن أكثر فترات طويلة ثقافة هذه الواجهة قد تفقد تعريف بسبب الخلوي عبر التسلل وخارج الخلية ترسب مصفوفة 11. بينما لا يحتوي القرص الطبقات الأولي أي جزيئات الالتصاق، كما أودعت المصفوفة خارج الخلية، وهناك أيضا إمكانية لتحقيق اندماج السكان الخلية واجهة المتغيرة بين الطبقات.
هذه الأقراص ثنائية الطبقات يمكن استخدامها بسهولة لتحفيز ضغط ديناميكي. كنا قادرين على تأكيد أن تسا الهلاميات المائية البريد الصمود ضغط ديناميكي دون فصل نصفين. ومع ذلك، وخلال هذه العملية، تم العثور على ذروة الحمل التي أظهرتها الهلاميات المائية الطبقات خلال ضغط دوري لمدة أربع ساعات لتكون مختلفة كثيرا عن غير الطبقات، بكميات كبيرة، والهلاميات المائية. هذه النتيجة تشير إلى المعقد، ونقل سلالة غير الخطية بين الطبقات وتكشف عن الحاجة إلى هلام سيطرة الطبقات جسديا، على سبيل المثال، هيدروجيل ثنائية الطبقات مع نفس السكان خلية / حالة في كل طبقة، والتفاصيل الهامة لاحظ عند التخطيط لل التصميم التجريبي للدراسات التي تنطوي على تحميل الميكانيكية. ويمكن تحقيق فهم أفضل للاختلافات يتم ملاحظتها من خلال النمذجة الحاسوبية من الميكانيكا المكانية ضمن هذه المواد الهلامية. ليس فقط أن مثل هذه التحليلات تساعد توضيح توزيع الضغط والتحويل بين الطبقات، ولكن سيكون لها دور أساسي لتفسير السلوك الخلوية في هذه المواد الهلامية المستويات، وخاصة مع طبقات متفاوتة الخواص الميكانيكية.
= "jove_content"> هذا هو نظام ثقافة متعددة الجوانب التي يمكن استخدامها لفصل المادي للسكان الخلية خلال الثقافة المشتركة كما هو موضح. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يمكن أيضا أن تستخدم بنية قاعدة لمزيد من التطوير. تغييرات على الهيكل الحالي ويمكن أن تشمل زيادة عدد الطبقات، وتغيير الأحجام أو صلابة النسبية للطبقات، ودمج مكونات المصفوفة خارج الخلية إضافية إلى واحد أو أكثر من طبقات. ومع ذلك، فإن هذه التوسعات تتطلب تقييم دقيق. بالإضافة إلى تغييرات في توزيع القوات في جميع أنحاء أقراص، وزيادة حجم وعدد من الطبقات يمكن أن تؤدي إلى انخفاض في بقاء الخلية في مركز المواد الهلامية وعدم الاستقرار المادي خلال التحفيز الميكانيكي. وعلاوة على ذلك، إضافات كبيرة من المصفوفة خارج الخلية وتحفيز البروتينات أو تعديلات على الجينات لتوفير الأنصاف التصاق قد تتداخل مع عمليات تشكيل هلام والصلب.
هذه المنصة وا ثقافةق وضعت لتطبيقات البحوث لدراسة العلاقات بين سكان الخلية مختلفة في الثقافة 3D. وهكذا، يحده افتقارها للقابلية للتطبيقات السريرية. طرق بديلة لخلق الهلاميات المائية الطبقات، مثل الطباعة 3D، قد تكون في النهاية أكثر أهمية سريريا بسبب المتوقع التقدم تطويره في المستقبل، والسيطرة على المجهرية في المناطق الداخلية القرص، والتفصيل من الميزات الهندسية macroscale. لالتطبيقات البحثية، كما وردت هنا، والأقراص الجينات لا توفر بشكل مستقل الأنصاف التصاق الخلايا، التي يمكن أن تحد من تطبيقه على أنواع الخلايا الأخرى. البديل مماثلة لالجيني عند النظر في سهولة الاستخدام غير الاغاروز، الذي يعاني من قيود مشابهة. وعلاوة على ذلك، فإنه يتطلب استخدام الإنزيمات لاطلاق سراح الخلايا لتحليل المصب، بينما crosslinks الجينات يمكن إزالتها بأمان باستخدام وكلاء مخلبية الكالسيوم. في المقام الأول، وهذه المنصة ثقافة تساعد في تحسين understandiنانوغرام من العلاقات بين سكان الخلية في الهلاميات المائية ويحتمل أن تكون آثار التحفيز الميكانيكي من هذه المشترك الثقافات. وهذا الفهم ثم إبلاغ تطوير علاجات لأنسجة غير المتجانسة، وخاصة تحميل الأنسجة تحمل مثل الغضروف المفصلي أو الأقراص الفقرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginic Acid sodium salt | Sigma Aldrich | A1112 | Solution made in wt% using DPBS (-/-) |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-/-) | Gibco Life Technologies | 14190 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (+/+) | Gibco Life Technologies | 14190 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco Life Technologies | 11965 | Example. Use desired medium type |
| Syringe Filters (0.02 μm Nylon) | FisherBrand | 0979C | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Bioreagents | BP510 | Prepare solution in sterile water |
| Criterion Blotter Filter Paper | Biorad | 1704085 | Cut to size of endplates for mold formation |
| Cell Microsieve Membrane (10 μm pore size) | Biodesign Inc of New York | N10R | Cut to size of endplates for mold formation |
| Sodium citrate dihydrate | FisherScience | S93364 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA) | FisherBioreagent | BP121 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Life Technologies | 26140 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| Penicilin/Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco Life Technologies | 15140 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco Life Technologies | 25030081 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| Non-essential Amino Acids (100x) | Gibco Life Technologies | 11140050 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
References
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The Basic Science of Articular Cartilage. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
- Neidlinger-Wilke, C., et al. Mechanical loading of the intervertebral disc: from the macroscopic to the cellular level. Eur. Spine J. 23 (3), 333-343 (2013).
- Klein, T. J., et al. Tissue engineering of stratified articular cartilage from chondrocyte subpopulations. Osteoarth. Cartilage. 11 (8), 595-602 (2003).
- Han, E., et al. Scaffold-free Grafts for Articular Cartilage Defects. Clin. Orthop. Relat. R. 466 (8), 1912-1920 (2008).
- Ng, K. W., Ateshian, G. A., Hung, C. T. Zonal chondrocytes seeded in a layered agarose hydrogel create engineered cartilage with depth-dependent cellular and mechanical inhomogeneity. Tissue Eng. A. 15 (9), 2315-2324 (2009).
- Ng, K. W., et al. A layered agarose approach to fabricate depth-dependent inhomogeneity in chondrocyte-seeded constructs. J. Orthop. Res. 23 (1), 134-141 (2005).
- Nguyen, L. H., Kudva, A. K., Saxena, N. S., Roy, K. Engineering articular cartilage with spatially-varying matrix composition and mechanical properties from a single stem cell population using a multi-layered hydrogel. Biomaterials. 32 (29), 6946-6952 (2011).
- Leone, G., et al. Continuous multilayered composite hydrogel as osteochondral substitute. J. Biomed. Mater. Res. A. 103 (8), 2521-2530 (2015).
- Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels. Sci. Rep. 3, (2013).
- Vigfúsdòttir, ÁT., Pasrija, C., Thakore, P. I., Schmidt, R. B., Hsieh, A. H. Role of Pericellular Matrix in Mesenchymal Stem Cell Deformation during Chondrogenic Differentiation. Cell. Mol. Bioeng. 3 (4), 387-397 (2010).
- Lee, C. S. D., Gleghorn, J. P., Won Choi, N., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. Integration of layered chondrocyte-seeded alginate hydrogel scaffolds. Biomaterials. 28 (19), 2987-2993 (2007).
- Gleghorn, J. P., Lee, C. S. D., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures. J. Biomed. Mater. Res. A. 85 (3), 611-618 (2008).
- Gharravi, A. M., Orazizadeh, M., Ansari-Asl, K., Banoni, S., Izadi, S., Hashemitabar, M. Design and Fabrication of Anatomical Bioreactor Systems Containing Alginate Scaffolds for Cartilage Tissue Engineering. Avicenna J. Med. Biotechnol. 4 (2), 65-74 (2012).
- Xu, J., et al. Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells in Three-Dimensional Alginate Gels. Tissue Eng. A. 14 (5), 667-680 (2008).
- Yeatts, A. B., Gordon, C. N., Fisher, J. P. Formation of an aggregated alginate construct in a tubular perfusion system. Tissue Eng. C, Methods. 17 (12), 1171-1178 (2011).
