Introduction
压缩载荷轴承组织如关节软骨或椎间盘组成是在组织都生物力学功能和适当的机械性转导临界异质组织区域。不仅是蜂窝组织和功能在不同的区域不同，但细胞外基质（ECM）是在组合物和组织也变化。例如，关节软骨由具有不同细胞形态，机械功能，和ECM三个主要区域。在他们的ECM导致差承载责任的差异;表面层主要涉及拉伸响应负载，而中间和深区是主要负责为响应于压缩1。同样，在椎间盘，凝胶状髓核由层状纤维环包围，这两个不同的区域中的细胞经历不同类型的生物物理刺激2。在这些类型的组织层内的组织，细胞和细胞外基质的彼此交互的组织经受并响应机械力。
这种多相组织结构的概括保持在组织工程和再生医学的一个挑战，并提供了它们的生物学意义的理解是有限的。有必要培养平台对于一个构建体中分析分层组织以及细胞的不同群体的共培养物。在关节软骨组织工程，支架少层状结构已通过利用带状软骨细胞以沉积不同的ECM来模仿这种组织3,4的不同层的能力构成。然而，层状凝胶结构提供用于研究不同类型的细胞群缺少独立形成一个坚固的组织的能力的相互作用的机会。例如，不同的流行间质干细胞的ulations可分层结构内共培养。这类层状支架已被用于与两个软骨细胞和改进组织工程5分化间质干细胞。不仅可以在不同的细胞群进行共培养在类似凝胶的层，但单一细胞类型也可已操纵以具有变化的刚度或生化内容引发从细胞6,7-不同反应层内培养。
许多不同的生物材料的水凝胶已被用于层软骨组织工程细胞群体，如使用聚乙二醇或聚乙烯醇碱基7-9的那些。然而，藻水凝胶是从中创建层状支架为在共培养研究异质细胞群体的最简单的生物材料中的一个。同时也容易形成琼脂糖凝胶，藻水凝胶具有允许容易是额外的好处从三维构建为单个细胞的分析的细胞olation如前面10所描述。在以前的研究中，已形成在薄片的双层藻酸盐水凝胶和从这些片，切片切片（ 例如 ，使用活检冲）为特定的应用，如用于生化内容或界面剪切性能11,12分析。用于形成薄藻片另一种方法，已与潜在描述为分层成多层，但仍然需要改变，以机械测试13的水凝胶的使用。
在这里，我们提出在细胞共培养不同人群可重复创建双层海藻酸钠水凝胶光盘中使用的方法。这海藻酸钠盘平台具有几个优点。为主，可重现的形状和尺寸小，有利于为嵌入式细胞机械刺激，而不需要活检普NCH或其它物理变化，以水凝胶对于许多应用。此外，细胞存活率仍然在分层过程高，并且后形成凝胶的凝胶中的两个细胞群的一个明确的分离是没有初始重叠区域可见。
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Protocol
1.准备海藻酸钠光盘的形成
- 制备4％（重量/体积）在1×Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水藻酸盐溶液没有在37℃水浴中加入氯化钙或氯化镁和地点。藻酸盐溶液的浓度可以不同，但1 - 4％（重量/体积）藻酸盐溶液推荐使用。
- 混合以1:1的比率的藻酸盐溶液：1用温细胞培养基基为所需的细胞类型（ 例如 ，Dulbecco氏改良的Eagle培养基）。现在藻酸盐的浓度为原始浓度的一半， 即 ，2％（重量/体积）。用无菌0.2微米的尼龙注射器过滤器消毒海藻酸钠/媒体解决方案。
- 制备无菌102 1mM氯化钙二水合物的浴在无菌水中有足够的溶液淹没模具（〜200 - 300毫升）中。
- 收集无菌“凝胶形成模子”（直径6毫米×3毫米高的圆柱形孔中3在铝基板×3，看
- 切割厚滤纸（吸墨纸滤纸）和细胞微筛膜（10微米孔径），以在顶部和底部端板的尺寸，并将其放置在氯化钙浴中直到饱和的，大约为1分钟。如果需要的话，灭菌通过高压釜或紫外光的厚滤纸和微筛膜为在使用前30分钟。
- 设置在模具构建体的一半（下半部分）。
- 放置以下项顶上彼此按下列顺序，并使用无菌刮刀平滑：大板（3×3英寸），厚滤纸，然后在微筛膜。
- 倒置并按模具到纸巾的叠层，以确保过量氯化钙溶液的损失。
- 放置“凝胶形成模子”与圆柱孔对C的顶部ELL微筛膜，并轻轻两侧使用左侧和右侧长尾夹固定在一起的模具。确保（在×3 1.5）留下足够的空间顶部端板后完全覆盖井。
- 设置在模具构建体的第二半（上半部分）。
- 将以下物品之上彼此以下顺序和平滑：小终板，厚滤纸，微筛膜。
- 倒置并按下此半模具的上纸巾的叠层，以确保过量氯化钙溶液的损失。不要拧紧这一半使用长尾夹此时的模具。
注意：使用此方法用于与不同类型的细胞层，确保文化两类细胞并行的层次感。间充质干细胞（MSCs）接种1×10 6个细胞的细胞密度/ ml的将被用作用于以下方案的例子。细胞数量和盘片号码可以按需要被缩放为实验。
- 5000细胞/ cm 2在10毫升基础生长培养基（Dulbecco氏改良的Eagle培养基，10％胎牛血清，2％L-谷氨酰胺，1 -在3000的细胞密度嵌入，种子间质干细胞前一到两周％非必需氨基酸，1％青霉素/链霉素）中的T-75烧瓶中。
- 移除用过的培养基，每2 - 3天用10 ml基础生长培养基替换直至细胞是80 - 90％汇合。
- 收获细胞，取出用过的培养基，和吸管3毫升1×Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水的不加氯化钙或氯化镁冲洗细胞。删除此解决方案，吸管3毫升0.25％的尝试PSIN-EDTA到在T-75瓶中生长的细胞，并在37℃下孵育5分钟。后细胞已经从粘附表面抬起，添加6 - 8 ml基础生长培养基。
- 离心机的MSC在600 xg离心在室温下5分钟，吸出上清液，并在1重悬 - 5 ml基础生长培养基。使用计数使用设备指令的血球细胞。
- 从总细胞悬浮除去1×10 6个细胞，使用相同的条件下离心，并吸出上清液。
2.细胞海藻晶种光盘的形成
- 重悬用1ml无菌藻酸盐/介质溶液的细胞沉淀，以达到1×10 6个细胞/ ml的细胞密度。细胞 - 海藻酸钠混合物将是均匀混浊的外观，当细胞的适当混合。
- 吸移管130微升细胞 - 藻酸盐混合物的成六个直径6毫米×3毫米高孔在模具的下半部分构造滴加以免产生任何气泡。轻微凸弯月形应该是每个边缘上方可见很好。
- 使用无菌刮刀仔细平滑模具构建体的上半部分和翻面，从而使细胞微筛膜是在井的顶部。将模具构造上的孔的顶部，确保以覆盖含有细胞和完全藻酸盐混合物的孔中。
- 解除装载模具构建体和，同时用力压下的中心，粘合剂夹剩下的两个边（顶部和底部）来固定模具构建体的顶部和底部两半。细胞 - 藻酸盐溶液应牢固坐落在此时的孔中。
- 沉浸在102毫氯化钙浴中的固定模结构，确保整个构建体淹没。孵育在室温下细胞培养罩90分钟。
- 在的90分钟结束时，请从102毫米氯化钙模具结构浴和地点纸巾在细胞培养罩堆栈上。除去所有四个长尾夹和模具结构的两半分开。形成在井中水凝胶不应该有任何气泡，并应完全填满孔中。
- 用锅铲，仔细追查含有水凝胶仔细放松和楔形出来的水凝胶孔的边缘。从模具构建体除去水凝胶后，丢弃水凝胶直接进入1X Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水的用氯化钙和氯化镁的浴中。完全覆盖凝胶洗掉过量氯化钙溶液进行1 - 5分钟。
- 转移的水凝胶成期望的盘基底的生长培养基溶液（ 例如 ，6孔板），该完全覆盖凝胶。孵育在37℃下在细胞培养孵化器至少1小时，5％CO 2继续成层步骤之前。
注意：含有细胞的水凝胶，可以保持在此时无限期细胞培养培养箱直到与另一细胞群体的凝胶的分层是期望的，提供该媒体的变化，每2完成 - 3天。
3.海藻酸钠光盘的分层
- 在1小时培养的最后半小时，收集和退火凝胶准备无菌模具及解决方案。
- 通过以x具有孔的一半“凝胶形成模具”的高度的（直径6毫米×1.5毫米高孔中3×3在铝板）的模具紧固到一个端板（3准备了“切割模具”在铝板3）用的左，右两侧的粘合剂片段。
- 通过紧固的模具为3的直径比“凝胶形成模具”较大毫米x中准备了“退火模具”（9毫米直径×3毫米高孔中3×3在铝盘），一个端板（3在铝板3）用的左，右两侧的粘合剂片段。
- 制备的溶液中的100mM柠檬酸钠/ 30毫摩尔EDTA（柠檬酸钠二水合物，乙二胺四乙酸四钠盐二水合物）在无菌水中。
- 除去所需的细胞群的凝胶（在这个例子中，两个圆盘具有的hMSCs）从在盘媒体和放置到“切割模具”井。每个凝胶应紧贴入孔与模具上方突出的凝胶的一半。
- 使用手术刀，片沿着所述模具的表面的凝胶（这将减少一半的水凝胶）。翻转凝胶的上半部分，将其放入一个敞开的模具很好。凝胶的一半还应该紧贴到模具，但是现在两个半凝胶应与切内表面可见模具的高度。与第二凝胶重复。
注：警告：只有内切表面会形成多层光盘。使用的外表面将导致半部分离。它被怀疑从转印到凝胶表面防止微筛膜纹理退火过程的成功。 - 放置在孔的上方的一块干细胞微筛膜，确保微筛膜是在与所有的凝胶半部的接触，进行退火处理，并覆盖它们完全。放置在微筛膜顶部厚滤纸，确保完全覆盖凝胶。
- 直到它被饱和吸取的100mM柠檬酸钠/ 30毫摩尔EDTA（柠檬酸钠二水合物，乙二胺四乙酸四钠盐二水合物）的到厚滤纸的溶液。约750微升足以用于四口井。
- 孵育凝胶在室温下1分钟。然后，取出细胞微筛膜厚滤纸丢弃它们。除去粘结剂剪辑和打开模具。
- 对于每个退火凝胶，水凝胶的一种柠檬酸钠/ EDTA处理的一半转移到准备“退火模子”用切面朝上。这将是退火常数的二分之一构作。
- 使用刮刀，升降机和放置柠檬酸第二钠/ EDTA处理的半凝胶（可以含有不同的细胞类型）已经在“退火模具”凝胶上，翻转这个第二半凝胶，使得切割表面是在与凝胶的切割表面接触已经处于“退火模具”。
- 按用抹刀两个凝胶之间消除任何气泡两种凝胶轻轻放下。另外，根据需要，以确保它们是直接在彼此的顶部重新定位凝胶。
- 轻轻提起“退火模具”和淹没它在102毫氯化钙浴中30分钟。切勿用端板的井。
- 30分钟的孵育后，去掉“退火模子”，并将其放置到纸巾。去除粘合剂的剪辑和模具从端板分开。
- 用刮刀收集退火凝胶并将它们放入一个1X贝科的磷酸盐缓冲液与氯化钙和Magnesium氯化物浴洗凝胶。接着，转移退火水凝胶到细胞培养基中的所需盘（ 例如 ，6孔板）进行培养。
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Representative Results
图1描绘了藻酸盐水凝胶的形成和分层。 如图3完成的双层凝胶中所示嵌入这些水凝胶和层状保持为高，并相媲美的散装水凝胶内的人类间充质干细胞的图2。细胞活性）表现出的细胞群的一个完整的初步分离。生存力评估退火后，切片凝胶垂直访问中心，然后染色在退火凝胶活细胞与活细胞追踪器，CMFDA（绿色）和死细胞（红色）乙锭同型二聚体-1使用制造商的说明使用。共焦的Z堆叠取使用荧光显微镜大约100微米到凝胶切割表面的。这些图像被投影到一个2D图像。活的和死细胞，然后用颗粒分析仪功能在ImageJ的软件定量。
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图 1： 分层水凝胶形成示意图 A.用于添加2％藻酸+有细胞混合物与堆叠顺序的底部和顶部半模的描绘层叠模具的图像。 B.示意图描绘程序为凝胶的层次感。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：在层状凝胶模型细胞系293FT HEK细胞细胞群的代表性分离要么与活细胞跟踪CMFDA（绿色）或CMTPX（红色）染色。每个这些单元组包埋在2％（重量/体积）藻光盘，然后将这些盘的两半被层叠在一起。一块从CMTPX侧切开成像过程中识别它。比例尺= 100＆＃181;：M 请点击此处查看该图的放大版本。
图 3： 分层过程完成后层状凝胶内高细胞活力嵌入散装和双层凝胶人类间充质干细胞与活细胞（绿色）跟踪CMFDA和死细胞（红色）染色以乙锭同型二聚体-1染色。活力仍然很高的分层处理后的水凝胶两者组。比例尺= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
FIGUR即 4： 层状凝胶循环压缩响应循环压缩的显着不同的趋势水凝胶在细胞培养恒温箱中温育七天，并随后经受0 -在1Hz 10％无侧限循环压缩四小时。峰值应力（±SEM）的每个周期中分离，并通过装载时段的趋势进行分析。在从0无侧限循环压缩趋势- 10％应变分层（9例）和体（N = 8）凝胶显著差异（p = 0.03）。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在这里，我们描述了用于形成层状藻酸盐水凝胶的光盘用于研究多种细胞群，例如在生理学层状组织，例如软骨的共培养物的协议。层状结构，如所描述的培养平台，可用于检查进行同样的培养环境或在负载下两种不同的细胞群之间的相互影响。
藻酸盐是已被发现是生物相容的，并已成功地用于软骨生物学和组织工程研究12,14的阴离子直链多糖。藻酸盐水凝胶是使用二价阳离子交联形成的， 例如 ，钙离子。这些交联可以通过使用螯合剂，如柠檬酸钠或EDTA除去阳离子撤消，而这个过程以前已经用于分离已在凝胶3,4,12被培养软骨细胞。类似地，同样的原理也已成功地应用于在双层甚至藻酸盐珠一起11,12,15团簇附着藻片。这里所描述的平台依靠这个相同的过程，但用于形成小的盘形层状凝胶。这是在其中第一，藻光盘使用在富钙浴浸没模具形成的两个步骤的过程。这些然后在半切片和与钙螯合溶液局部地从交联藻酸盐释放钙离子处理。通过将这些处理过的表面在一起，再浸泡在富含钙的解决方案光盘，交联的改革，使得双层结构。这些小的层状的凝胶消除需要活检穿孔，以产生与测定和实验如机械测试兼容易于培养样品， 如图4中 ，从而最大限度地减少经常珍贵细胞废物，以及制造材料。
如图图3中 ，形成和分层的水凝胶的这个过程导致了类似的高存活率作为对照或散装水凝胶表明该程序是不是过于繁重的细胞群，尽管补充养分的长度和不存在。缺乏在凝胶的初始重叠区域的允许初始共培养并随着时间的推移，观察变化到该接口的能力中物理分离。有研究表明，在长期培养期间这个界面可能会失去清晰度由于蜂窝交叉渗透和细胞外基质沉积11。虽然最初的分层盘不含有任何的粘附分子，细胞外基质沉积，也有用于研究的细胞群的合并和层与层之间变化的界面的电位。
这些双层光盘可很容易地进行动态压缩刺激被使用。我们能够确认，采取这些Ë水凝胶承受动态压缩无半的分离。然而，在此过程中，通过四小时循环压缩过程中在层状凝胶表现出峰值负载被发现是从非分层，本体显著不同，水凝胶。这一结果表明在层之间复杂的，非线性应变传递和揭示了需要物理上分层的对照用凝胶， 例如 ，在每个层中的相同的细胞群/条件双层水凝胶，一个重要的细节要注意规划时实验设计涉及机械负荷的研究。观察到的差异更深入的了解可以通过这些凝胶内的空间力学计算模型来实现。不仅将这样的分析有助于澄清层之间的应变分布和转移，但它也将是仪器在这些层状凝胶解释细胞行为，尤其是具有不同的机械性能的层。
这种文化平台娃自称对研究应用的调查三维培养不同的细胞群之间的关系发展。因此，它是由它缺乏可扩展性的临床应用的限制。用于创建分层水凝胶，如三维打印的替代方法，可能最终会更临床相关的，由于预期的未来的扩展性的进步，用在盘内部微结构控制，以及宏观几何特征定制。适用于科研应用，这里介绍，海藻酸钠光盘不单独为细胞，这可能其应用仅限于其他细胞类型的提供粘合部分。可比替代藻酸盐时考虑使用方便是琼脂糖，从类似的限制受到影响。另外，它需要使用酶来释放细胞用于下游分析，而藻酸盐交联可以使用钙螯合剂被安全地移除。首先，这种文化的平台将有助于提高understandi在水凝胶的细胞群以及潜在这些共培养物的机械刺激的效果之间的关系的纳克。那么这种理解将通知疗法异构组织的发展，特别是装载轴承组织如关节软骨或椎间盘。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginic Acid sodium salt | Sigma Aldrich | A1112 | Solution made in wt% using DPBS (-/-) |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-/-) | Gibco Life Technologies | 14190 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (+/+) | Gibco Life Technologies | 14190 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco Life Technologies | 11965 | Example. Use desired medium type |
| Syringe Filters (0.02 μm Nylon) | FisherBrand | 0979C | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Bioreagents | BP510 | Prepare solution in sterile water |
| Criterion Blotter Filter Paper | Biorad | 1704085 | Cut to size of endplates for mold formation |
| Cell Microsieve Membrane (10 μm pore size) | Biodesign Inc of New York | N10R | Cut to size of endplates for mold formation |
| Sodium citrate dihydrate | FisherScience | S93364 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA) | FisherBioreagent | BP121 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Life Technologies | 26140 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| Penicilin/Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco Life Technologies | 15140 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco Life Technologies | 25030081 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| Non-essential Amino Acids (100x) | Gibco Life Technologies | 11140050 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
References
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