Introduction
Trycklastbärande vävnader såsom ledbrosk eller diskarna består av heterogena vävnadsområden som är kritiska för både biomekanisk funktion och lämplig mekanisk-transduktion i vävnaden. Inte bara är cellulär organisation och funktion skiljer sig i olika regioner, men de extracellulära matriser (ECM) är också varieras i sammansättning och organisation. Till exempel ledbrosk består av tre huvudzoner med varierande cellmorfologi, mekanisk funktion, och ECM. Skillnader i sin ECM leder till differentiell bärande ansvar; ytskiktet är främst inblandade i drag svar att ladda, medan de mellersta och djupa zonerna är huvudsakligen ansvariga för svar på kompression 1. Även i mellankotskivan är en gel-liknande nucleus pulposus omgiven av en lamellär trådbroskringen och cellerna inom dessa två olika områden upplever olika typer av biofysiska stimuli2. I dessa typer av vävnader, celler och de extracellulära matriserna inom mjukpappersskikten samverkar med varandra som vävnaden genomgår och svarar på mekaniska krafter.
Rekapitulation av sådana heterogena vävnadsstrukturer fortfarande en utmaning i tissue engineering och regenerativ medicin, och vår förståelse av deras biologiska betydelse är begränsad. Det finns ett behov för odling av plattformar för att analysera skiktade vävnader samt co-kulturer av olika populationer av celler inom en konstruktion. I ledbrosk vävnadsteknik, har byggnadsställning-less skiktade konstruktioner konstruerats genom att utnyttja förmågan hos zonal kondrocyter att deponera varierad ECM för att efterlikna de olika lagren av denna vävnad 3,4. Men skiktade hydrogel konstruktioner ger en möjlighet för att undersöka interaktionen mellan olika typer av cellpopulationer som saknar förmågan att bilda en robust vävnad självständigt. Till exempel, olika populations av mesenkymala stamceller kan samodlas inom skiktade konstruktioner. Sådana skiktade byggnadsställningar har använts med både kondrocyter och differentierande mesenkymala stamceller för förbättrad tissue engineering 5. Inte bara kan olika cellpopulationer samodlas i liknande hydrogel skikt, men en enda celltyp kan också odlas i lager som har manipulerats för att ha varierande styvhet eller biokemiska innehåll för att framkalla olika svar från celler 6,7.
Många olika biomaterial hydrogeler har använts till skiktet cellpopulationer för broskvävnadsteknik, såsom de som använder polyetylenglykol eller polyvinylalkohol baserna 7-9. Men alginat hydrogeler är ett av de enklaste biomaterial som att skapa skiktade ställningar för att studera heterogena cellpopulationer i co-kultur. Medan agaros hydrogeler också lätt bildas, alginat hydrogeler har den extra fördelen att tillåta lätt ärolation av celler från den 3-D-konstruktionen för analys av enskilda celler som har beskrivits tidigare 10. I tidigare studier har bi-skiktade alginat hydrogeler bildats i tunna ark och från dessa ark var sektioner skuret (eg., Med användning av en biopsistans) för speciella tillämpningar såsom för analys av biokemiska innehåll eller gräns skjuvningsegenskaper 11,12. En annan metod för att bilda tunna alginat ark har beskrivits med potential för stratifiering i flera lager, men ändå skulle kräva ändring till hydrogelen för användning i mekanisk provning 13.
Här presenterar vi en metod för att reproducerbart skapa dubbel lager alginat hydrogel-skivor för användning i samodling olika populationer av celler. Denna alginat skiva plattform besitter flera fördelar. I första hand är det reproducerbar form och liten storlek gynnsamt för mekanisk stimulering av de inbäddade cellerna utan att kräva en biopsi punch eller annan fysisk förändring till hydrogelen för många tillämpningar. Dessutom förblir cellviabilitet hög under beläggningsprocess, och efter gelbildning en klar separation av de två cellpopulationer inom gelén är synlig med ingen initial överlappande region.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse för bildande av alginat-skivor
- Bered en 4% (vikt / volym) alginatlösningen i 1x Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning utan tillsatt kalciumklorid eller magnesiumklorid och placera i ett 37 ° C vattenbad. Koncentrationer av alginatlösningen kan variera, men 1-4% (vikt / volym) alginatlösningar rekommenderas.
- Blanda alginatlösningen vid ett förhållande av 1: 1 med varmt cellodlingsmedia bas (t.ex., Dulbeccos Modified Eagle Medium.) För den önskade celltypen. Alginat-koncentrationen är nu hälften av den ursprungliga koncentrationen, dvs.., 2% (vikt / volym). Sterilisera alginat / medielösning med sterila 0,2 pm nylonsprutfilter.
- Förbereda ett bad av sterilt 102 mM kalciumklorid-dihydrat i sterilt vatten med tillräckligt med lösning för att dränka formarna (~ 200 - 300 ml).
- Samla den sterila "gelbildning mögel" (6 mm diameter x 3 mm höga cylindriska brunnar i en 3 i x 3 i aluminiumplåt, se
- Skär tjocka filterpapper (läskfilterpapper) och cell mikrosil membran (10 ^ m porstorlek) till storleken på de övre och nedre ändplattorna och placera dem i kalciumkloridbadet tills mättad, ca 1 min. Om så önskas, sterilisera den tjocka filterpapper, och mikrosil membranet via autoklav eller ultraviolett ljus under 30 min före användning.
- Ställt upp en halv (den nedre halvan) av formen konstruktionen.
- Placera följande ovanpå varandra i följande ordning och jämna med en steril spatel: stor ändplattan (3 tum x 3 tum), tjockt filterpapper och sedan mikrosil membranet.
- Vänd och tryck på formen på en stapel av pappershanddukar för att säkerställa förlust av överskott kalciumkloridlösning.
- Placera "gelbildning mold" med de cylindriska brunnar ovanpå cell mikrosil membran och försiktigt fast formen tillsammans på två sidor med bindemedel klipp på vänster och höger sida. Se till att lämna tillräckligt med utrymme för den övre ändplattan (1,5 tum x 3 tum) för att täcka brunnarna fullständigt senare.
- Ställt upp den andra halvan (den övre halvan) av formen konstruktionen.
- Placera följande ovanpå varandra i följande ordning och jämna: liten ändskiva, tjocka filterpapper, mikrosil membran.
- Vänd och tryck på hälften av formen på en stapel av pappershanddukar för att säkerställa förlust av överskott kalciumkloridlösning. Sätt inte fast denna halvan av formen med hjälp av bind klipp vid denna tidpunkt.
Obs: När du använder den här metodenför att göra skikt med olika celltyper, se till att kulturen två celltyper parallellt för skiktning. Mesenkymala stamceller (MSC) ympades vid en celldensitet av 1 x 10 6 celler / ml kommer att användas som ett exempel för följande protokoll. Antalet celler och skivnummer kan skalas för experiment som behövs.
- En till två veckor före inbäddning, frö mesenkymala stamceller vid en celldensitet på 3000 - 5000 celler / cm 2 i 10 ml basal tillväxtmedia (Dulbeccos modifierade Eagle-medium, 10% fetalt bovint serum, 2% L-glutamin, 1 % Icke-essentiella aminosyror, 1% penicillin / streptomycin) i T-75-kolvar.
- Ta tillbringade media varje 2 - 3 dagar och ersätta med 10 ml basal tillväxt media tills cellerna är 80-90% sammanflytande.
- Att skörda celler, ta bort förbrukade media och pipett 3 ml 1x Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning utan tillsatt kalciumklorid eller magnesiumklorid för att skölja cellerna. Ta bort denna lösning, pipett 3 ml 0,25% FörsökPSIN-EDTA på celler som växer i T-75-kolvar, och inkubera under 5 min vid 37 ° C. Efter det att cellerna har lyft från vidhäftande ytan, tillsätt 6 - 9 ml av basaltillväxtmedia.
- Centrifugera MSCs vid 600 xg under 5 minuter vid rumstemperatur, aspirera supernatanten och återsuspendera i 1 - 5 ml basala tillväxtmedia. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer med hjälp av enhets instruktioner.
- Avlägsna 1 x 10 6 celler från den totala cell resuspension, centrifug med användning av samma betingelser, och aspirera supernatanten.
2. Bildning av cell seedade alginat skivor
- Återsuspendera cellpelleten med 1 ml av det sterila alginat / media lösning för att uppnå en celldensitet av 1 x 10 6 celler / ml. Cellen-alginat blandningen blir homogent grumlig när cellerna blandas i lämpligt sätt.
- Pipettera 130 ul av cell alginat blandningen i sex 6 mm diameter x 3 mm höga brunnar i den undre halvan av formenkonstruera droppvis, för att inte skapa några bubblor. En lätt konvex menisk bör vara synlig ovanför kanten av varje brunn.
- Försiktigt jämna den övre halvan av formen konstruktionen med en steril spatel och vänd på den, så att cell mikrosil membranet är på toppen av brunnarna. Placera formen bygga ovanpå brunnarna, och se till att täcka brunnarna innehållande cellen och alginat blandningen helt.
- Lyft den laddade formkonstruktionen och samtidigt trycka nedåt på mitten, bindemedel klipp de två återstående sidorna (övre och undre) för att fästa de övre och nedre halvorna av formkonstruktionen. Cell-alginat lösningar bör säkert inbäddat i brunnarna vid denna tid.
- Doppa fäst formkonstruktionen i 102 mM kalciumklorid bad och se till att hela konstruktionen är nedsänkt. Inkubera i cellodlings huven vid rumstemperatur under 90 min.
- Vid slutet av den 90 minuter, ta bort mögel-konstruktionen från 102 mM kalciumkloridbad och plats på en stapel av pappershanddukar i cellkultur huva. Ta bort alla fyra bindemedel klipp och separera de två halvorna av formen konstruktionen. Hydrogeler bildas i brunnarna bör inte ha några bubblor och ska fylla brunnarna fullständigt.
- Användning av en spatel, noggrant spåra kanten av brunnarna innehållande hydrogelerna att lossa försiktigt och kila ut hydrogelerna. Efter avlägsnande hydrogelerna från formen konstruktet, släpp hydrogelerna direkt i ett bad av 1x Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning med kalciumklorid och magnesiumklorid. Täck gelerna helt för att tvätta bort överskottet av kalciumkloridlösning under 1 - 5 min.
- Överför hydrogeler i basal tillväxt media lösning i önskad skålen (t.ex.., 6 brunnsplattor) som helt täcker de hydrogel. Inkubera under minst en timme i cellodlingsinkubator vid 37 ° C och 5% CO2 innan du fortsätter med skiktning steg.
Note: Hydrogeler innehållande celler kan hållas icellodlingsinkubator under obegränsad tid vid denna tid tills skiktning av geler med en annan cellpopulation är önskvärt, förutsatt att byte av medium är slutförda varje 2 - 3 dagar.
3. Skiktning av alginat-skivor
- Under den sista halvtimmen av en timme inkubation, samla in och förbereda sterila formar och lösningar för glödgning gelerna.
- Förbered "cutting mold" genom att fästa en form som har brunnar hälften av höjden av den "gelbildning mold" (6 mm diameter x 1,5 mm höga brunnar i en 3 tum x 3 i aluminiumplatta) till en ändplatta (3 in x 3 i aluminiumplåt) med hjälp av bindemedel klipp på vänster och höger sida.
- Förbered "glödgning mold" genom att fästa en form som är 3 mm större i diameter än den "gelbildning mold" (9 mm diameter x 3 mm hög brunnar i en 3 i x 3 i aluminiumplatta) till en ändplatta (3 in x 3 i aluminiumplåt) med hjälp av bindemedel klipp på vänster och höger sida.
- Bered en lösning av100 mM natriumcitrat / 30 mM EDTA (natriumcitratdihydrat, etylendiamintetraättiksyra tetranatriumsalt-dihydrat) i sterilt vatten.
- Ta bort geler av önskade cellpopulationer (i det här exemplet, två skivor med hMSCs) från media i skålen och placera i "cutting form" brunnar. Varje gel bör passa väl in i brunnarna med hälften av gel som skjuter över formen.
- Med användning av en skalpell, skiva gelén längs ytan av formen (detta kommer att skära hydrogelen i halv). Vänd den övre halvan av gelén och placera den i en öppen form väl. Den halv av gelén bör också passa väl in i formen väl, men nu båda halv geler bör vara höjden av formen med den skär innerytan synlig. Upprepa med andra gel.
Obs: Varning: Endast de inre snittytorna kommer att bilda skiktade skivor. Med användning av de yttre ytorna kommer att resultera i halvor separerande. Man misstänker att texturen från mikrosil membranet överförs till gelytan förhindrarframgång av glödgningsprocessen. - Placera en bit torrt cell mikrosil membran ovanpå brunnarna, och se till att mikrosil membranet är i kontakt med alla gel halvorna glödgas och täcker dem helt. Placera tjockt filterpapper ovanpå mikrosil membranet, och se till att täcka gelerna helt.
- Pipettera en lösning av 100 mM natriumcitrat / 30 mM EDTA (Natriumcitratdihydrat, Etylendiamintetraättiksyra tetranatriumsalt-dihydrat) på tjocka filterpapper tills den är mättad. Cirka 750 pl är tillräcklig för fyra brunnar.
- Inkubera gelerna under 1 min vid rumstemperatur. Ta sedan bort cell mikrosil membranet och tjocka filterpapper och kassera dem. Ta bort klipp bindemedlet och öppna formen.
- För varje glödgade gel, överföra en natriumcitrat / EDTA-behandlade hälften av hydrogelen till den förberedda "glödgning mögel" med snittytan uppåt. Detta kommer att vara en halv av glödgat construct.
- Med hjälp av en spatel, hiss och placera en andra natriumcitrat / EDTA-behandlade halv-gel (kan innehålla en annan celltyp) på gelén redan i "glödgning mögel", vända den andra halv gel så att snittytan är i kontakt med den skurna ytan av gelén redan i "glödgning mold".
- Tryck försiktigt ned på de två geler med hjälp av en spatel för att avlägsna eventuella bubblor mellan de två gelerna. Också, placera om gelerna efter behov för att säkerställa att de är direkt ovanpå varandra.
- Lyft försiktigt "glödgning mold" och dränka den i 102 mM kalciumklorid bad under 30 min. Täck inte brunnarna med en ändplatta.
- Efter 30 min inkubation, ta bort "glödgning mögel" och placera den på hushållspapper. Ta bort klipp bindemedlet och separera formen från ändplattan.
- Användning av en spatel, samla de hybridiserade geler och placera dem i en 1x Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning med kalciumklorid och magnesium klorid bad att tvätta gelerna. Därefter överför härdade hydrogeler till cellodlingsmedia i en önskad skålen (eg., 6-brunnar) för kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 skildrar bildningen och skiktning av de alginat hydrogeler. Avslutade bi-skiktade geler uppvisar en fullständig initial separation av cellpopulationer som visas i figur 2. Cellviabiliteten av humana mesenkymala stamceller) inbäddade i dessa hydrogeler och skiktade förblir hög och jämförbar med de bulk hydrogeler såsom visas i figur 3. Viabiliteten bedömdes efter glödgning, skiv gelerna vertikalt för att komma åt centrum och sedan färgning av levande celler i glödgat geler med en levande cell tracker, CMFDA (grön) och döda celler (röd) med Ethidium homodimer-1 med användning av tillverkarens instruktioner. Konfokala Z-stackar togs av den skurna ytan med användning av ett fluorescensmikroskop ungefär 100 | im in i gelén. Dessa bilder projiceras i en 2D-bild. Levande och döda celler var därefter kvantifieras med användning av partikelanalysatom funktionen i ImageJ programvara.
jpg "/>
Figur 1:. Schematisk bild av Layered Hydrogel Bildning A. Bilden av den staplade formen för tillsats av 2% alginat + cellblandningen med en skildring av staplingsordningen för de undre och övre formhalvor. B. Schematisk visar förfarande för skiktning av gelen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Representant Separation av cellpopulationer i Layered Hydrogel Modell cellinje 293FT HEK celler färgades antingen med levande cell tracker CMFDA (grön) eller CMTPX (röd). Var och en av dessa cellgrupper inbäddades i 2% (vikt / volym) alginat skivor, och sedan halvorna av dessa skivor skiktades tillsammans. Ett stycke skars från CMTPX sida för att identifiera det under avbildning. Skalstreck = 100 & #181;. M klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Hög Cellviabiliteten inom Layered Hydrogel efter beläggningsprocess är klar mänskliga mesenkymala stamceller inbäddade i bulk och bi-skikt hydrogeler färgades med levande cell (grön) tracker CMFDA och döda celler (röd) färgades med Ethidium homodimer-1 . Livskraft fortsatt hög för både hydrogel grupper efter beläggningsprocess. Skalstreck = 100 nm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur. e 4: Signifikant olika trender i Layered Hydrogel Cyklisk Compression Response to Cykliska Compression Hydrogeler inkuberades i en cellodlings inkubator för sju dagar och utsattes därefter för 0-10% unconfined cyklisk kompression under fyra timmar vid 1 Hz. Peak påfrestningar (± SEM) för varje cykel isolerades och trender över last analyserade perioden. Trender inom unconfined cyklisk kompression 0-10% töjning för lager (n = 9) och bulk (n = 8) geler är signifikant (p = 0,03). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi ett protokoll för bildandet av skiktade alginat hydrogel-skivor för att studera samodlingar av flera cellpopulationer, såsom de i fysiologiskt skiktade vävnader, t ex brosk. Skiktade strukturer, såsom det beskrivna odlings plattformen kan användas för att undersöka samspelet mellan två distinkta cellpopulationer utsatta för samma odlingsmiljö eller under belastning.
Alginat är en anjonisk linjär polysackarid som har visat sig vara biokompatibla och har med framgång använts för broskbiologi och tissue engineering forskning 12,14. Alginat hydrogeler bildas med användning av tvåvärda katjoner för tvärbindning, t ex., Kalciumjoner. Dessa tvärbindningar kan ångras genom att ta bort katjoner med hjälp av en kelator, såsom natriumcitrat eller EDTA, och denna process har tidigare använts för att isolera kondrocyter som har odlats i gelerna 3,4,12. På liknande sätt, samma principhar också framgångsrikt tillämpats för vidhäftning alginat ark i dubbelskikt eller ens kluster av alginatpärlor tillsammans 11,12,15. Plattformen beskrivs här förlitar sig på denna samma process, men används för att bilda små skivformade skiktade hydrogeler. Detta är en två-stegsprocess i vilken det första, är alginat skivor bildas med användning av formarna nedsänkta i en kalciumrik bad. Dessa är sedan skivas i halv och behandlas med en kalcium kelatbildande lösning att lokalt frigöra kalciumjoner från den tvärbundna alginat. Genom att placera dessa behandlade ytorna och åter nedsänkning skivorna i en kalciumrik lösning, är tvärbindningar reformeras, vilket bi-skiktade konstruktioner. Dessa små skiktade geler eliminera behovet av biopsi stansar för att generera lättodlingsprover som är kompatibla med analyser och experiment såsom mekanisk testning, såsom visas i fig 4, vilket minimerar slöseri med ofta dyrbara celler såväl som tillverkningsmaterial.
Såsom visas iFigur 3, denna process att bilda och skiktning hydrogelerna resulterade i lika hög lönsamhet som kontroll eller bulk hydrogeler indikerar att detta förfarande inte är alltför är att beskatta till cellpopulationen trots längden och frånvaro av påfyllning näringsämnen. Avsaknaden av en initial överlappande region i gelén tillåter fysisk separering under första co-kultur och förmåga att observera förändringar till det gränssnitt över tiden. Studier har visat att under långa odlingsperioder detta gränssnitt kan förlora definition på grund av cellulär kors infiltration och extracellulära matrixdeposition 11. Även om den ursprungliga skiktade skivan inte innehåller några adhesionsmolekyler, som extracellulära matrisen deponerad finns också en potential för att undersöka sammanslagning av cellpopulationer och den föränderliga gränssnittet mellan skikten.
Dessa bi-lager skivor kan användas enkelt för dynamisk kompression stimulering. Vi kunde bekräfta att these hydrogeler tål dynamisk komprimering utan separation av halvorna. Under denna process har toppbelastning som uppvisas av de skiktade hydrogelerna under fyra timmar cyklisk kompression befanns vara avsevärt skiljer sig från den icke-skiktade, bulk, hydrogeler. Detta resultat tyder på komplex, icke-linjär stam överföring mellan skikten och avslöjar ett behov av ett fysiskt skiktade styr gel, t ex., Bi-skiktade hydrogel med samma cellpopulationen / skick i varje skikt, en viktig detalj att notera vid planering av experimentell design för studier med mekanisk belastning. Bättre förståelse av de observerade skillnaderna skulle kunna uppnås genom datormodellering av rumsliga mekanik inom dessa geler. Inte bara skulle sådana analyser bidra till att klargöra fördelningen och överföra spänningar mellan skikten, men det skulle också vara ett medel för att tolka cellulära beteende i dessa skiktade geler, särskilt med lager av varierande mekaniska egenskaper.
Denna kultur plattform was utvecklats för forskningsansökningar för att undersöka sambanden mellan olika cellpopulationer i 3D kultur. Således är det begränsad av dess brist på skalbarhet för kliniska tillämpningar. Alternativa metoder för att skapa skiktade hydrogeler, såsom 3D-utskrifter, i slutändan kan vara mer kliniskt relevant på grund av förväntade framtida skalbarhet framsteg, kontroll över mikro i skiv inre, och anpassningsförmåga av makroskala geometriska funktioner. För forskningsansökningar, som presenteras här, alginat skivorna inte självständigt ge vidhäftningsdelar för celler, som kan begränsa dess tillämpning till andra celltyper. Den jämförbara alternativ till alginat när man överväger användarvänlighet är agaros, som lider av liknande begränsningar. Vidare kräver det användning av enzymer för att frigöra celler för efterföljande analys, medan alginat tvärbindningar kan tas bort med hjälp av kalcium kelatmedel. I första hand kommer denna kultur plattform hjälpa till med att förbättra understanding av relationer mellan cellpopulationer i hydrogeler och potentiellt effekterna av mekanisk stimulering av dessa co-kulturer. Denna förståelse kommer då att informera utveckling av terapier för heterogena vävnader, särskilt lastning lager vävnader såsom ledbrosk eller diskarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginic Acid sodium salt | Sigma Aldrich | A1112 | Solution made in wt% using DPBS (-/-) |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-/-) | Gibco Life Technologies | 14190 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (+/+) | Gibco Life Technologies | 14190 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco Life Technologies | 11965 | Example. Use desired medium type |
| Syringe Filters (0.02 μm Nylon) | FisherBrand | 0979C | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Bioreagents | BP510 | Prepare solution in sterile water |
| Criterion Blotter Filter Paper | Biorad | 1704085 | Cut to size of endplates for mold formation |
| Cell Microsieve Membrane (10 μm pore size) | Biodesign Inc of New York | N10R | Cut to size of endplates for mold formation |
| Sodium citrate dihydrate | FisherScience | S93364 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA) | FisherBioreagent | BP121 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Life Technologies | 26140 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| Penicilin/Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco Life Technologies | 15140 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco Life Technologies | 25030081 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| Non-essential Amino Acids (100x) | Gibco Life Technologies | 11140050 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
References
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The Basic Science of Articular Cartilage. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
- Neidlinger-Wilke, C., et al. Mechanical loading of the intervertebral disc: from the macroscopic to the cellular level. Eur. Spine J. 23 (3), 333-343 (2013).
- Klein, T. J., et al. Tissue engineering of stratified articular cartilage from chondrocyte subpopulations. Osteoarth. Cartilage. 11 (8), 595-602 (2003).
- Han, E., et al. Scaffold-free Grafts for Articular Cartilage Defects. Clin. Orthop. Relat. R. 466 (8), 1912-1920 (2008).
- Ng, K. W., Ateshian, G. A., Hung, C. T. Zonal chondrocytes seeded in a layered agarose hydrogel create engineered cartilage with depth-dependent cellular and mechanical inhomogeneity. Tissue Eng. A. 15 (9), 2315-2324 (2009).
- Ng, K. W., et al. A layered agarose approach to fabricate depth-dependent inhomogeneity in chondrocyte-seeded constructs. J. Orthop. Res. 23 (1), 134-141 (2005).
- Nguyen, L. H., Kudva, A. K., Saxena, N. S., Roy, K. Engineering articular cartilage with spatially-varying matrix composition and mechanical properties from a single stem cell population using a multi-layered hydrogel. Biomaterials. 32 (29), 6946-6952 (2011).
- Leone, G., et al. Continuous multilayered composite hydrogel as osteochondral substitute. J. Biomed. Mater. Res. A. 103 (8), 2521-2530 (2015).
- Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels. Sci. Rep. 3, (2013).
- Vigfúsdòttir, ÁT., Pasrija, C., Thakore, P. I., Schmidt, R. B., Hsieh, A. H. Role of Pericellular Matrix in Mesenchymal Stem Cell Deformation during Chondrogenic Differentiation. Cell. Mol. Bioeng. 3 (4), 387-397 (2010).
- Lee, C. S. D., Gleghorn, J. P., Won Choi, N., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. Integration of layered chondrocyte-seeded alginate hydrogel scaffolds. Biomaterials. 28 (19), 2987-2993 (2007).
- Gleghorn, J. P., Lee, C. S. D., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures. J. Biomed. Mater. Res. A. 85 (3), 611-618 (2008).
- Gharravi, A. M., Orazizadeh, M., Ansari-Asl, K., Banoni, S., Izadi, S., Hashemitabar, M. Design and Fabrication of Anatomical Bioreactor Systems Containing Alginate Scaffolds for Cartilage Tissue Engineering. Avicenna J. Med. Biotechnol. 4 (2), 65-74 (2012).
- Xu, J., et al. Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells in Three-Dimensional Alginate Gels. Tissue Eng. A. 14 (5), 667-680 (2008).
- Yeatts, A. B., Gordon, C. N., Fisher, J. P. Formation of an aggregated alginate construct in a tubular perfusion system. Tissue Eng. C, Methods. 17 (12), 1171-1178 (2011).
