Introduction
Drukbelasting dragende weefsels zoals kraakbeen of tussenwervelschijven bestaan uit heterogene weefsel gebieden die van cruciaal belang voor zowel de biomechanische functie en passende mechanisch-transductie in het weefsel zijn. Niet alleen is de cellulaire organisatie en werking verschillend in verschillende gebieden, maar de extracellulaire matrix (ECM) zijn daarbij elk samenstelling en organisatie. Bijvoorbeeld gewrichtskraakbeen bestaat uit drie primaire zones met verschillende celmorfologie, mechanische functie en ECM. Verschillen in hun ECM leiden tot differentiële dragende verantwoordelijkheden; de oppervlakkige laag is voornamelijk betrokken bij trek reactie te laden, terwijl het midden en diepe zones zijn voornamelijk verantwoordelijk voor het antwoord op de compressie 1. Ook in de tussenwervelschijf, een gelachtige nucleus pulposus is omgeven door een lamellaire annulus fibrosis en de cellen in deze twee verschillende gebieden onder verschillende categorieën biofysische stimuli2. In dit soort weefsels, cellen en extracellulaire matrices binnen de weefsellagen met elkaar als het weefsel ondergaat en reageert op mechanische krachten.
Recapitulatie van dergelijke heterogene weefselstructuren blijft een uitdaging in tissue engineering en regeneratieve geneeskunde, en ons begrip van hun biologische betekenis is beperkt. Er is behoefte aan het kweken platforms voor het analyseren gelaagde weefsels en co-culturen van verschillende populaties van cellen in één construct. In gewrichtskraakbeen weefselmanipulatie, zijn scaffold-less gelaagde constructies geconstrueerd door gebruik te maken van het vermogen van chondrocyten zonale gevarieerde ECM afzetten van de verschillende lagen van dit weefsel 3,4 nabootsen. Echter, gelaagde hydrogel constructen gelegenheid voor het onderzoeken van de interactie van diverse soorten celpopulaties die het vermogen om een robuust weefsel vormen onafhankelijk missen. Bijvoorbeeld verschillende populations van mesenchymale stamcellen kunnen worden samen gekweekt binnen gelaagde constructies. Dergelijke gelaagde steigers zijn gebruikt zowel chondrocyten differentiëren mesenchymale stamcellen verbeterde weefselmanipulatie 5. Niet alleen kunnen verschillende celpopulaties tezamen worden gekweekt in vergelijkbare hydrogel lagen, maar een enkel type cel kan worden gekweekt in lagen die zijn gemanipuleerd om variërende stijfheid of biochemische inhoud verschillende reacties van cellen 6,7 wekken hebben.
Veel verschillende biomateriaal hydrogels zijn gebruikt om celpopulaties kraakbeen tissue engineering laag zoals gebruikt polyethyleenglycol of polyvinylalcohol basen 7-9. Echter, alginaat hydrogelen een van de eenvoudigste biomaterialen om gelaagde scaffolds te creëren voor het bestuderen heterogene celpopulaties in co-cultuur. Terwijl agarose hydrogels zijn ook gemakkelijk gevormd, alginaat hydrogels hebben het extra voordeel van het toestaan van eenvoudig isolation van cellen van de 3-D construct voor analyse van individuele cellen als eerder 10 beschreven. In vorige studies hebben bi-lagen alginaat hydrogelen gevormd in dunne platen en van deze platen, werden secties gesneden (bv. Met behulp van een biopsie punch) voor bepaalde toepassingen zoals voor het analyseren van biochemische inhoud of raakvlak afschuifeigenschappen 11,12. Een andere werkwijze voor het vormen van dunne platen alginaat is beschreven met een mogelijke vakken met meerdere lagen, maar zou wijziging van de hydrogel voor gebruik in mechanische testen 13 vereisen.
Hier presenteren we een werkwijze voor het reproduceerbaar maken van bi-lagen alginaat hydrogel schijven voor gebruik in co-kweken van verschillende populaties van cellen. Dit alginaat disc platform bezit een aantal voordelen. In de eerste plaats, de reproduceerbare vorm en de geringe afmetingen is bevorderlijk voor de mechanische stimulatie van de ingebedde cellen zonder dat een biopsie punch of andere fysieke verandering aan de hydrogel voor vele toepassingen. Bovendien cellevensvatbaarheid blijft hoog tijdens de gelaagdheid proces en na gelvorming een duidelijke scheiding van de twee celpopulaties in de gel zichtbaar zonder initiële overlappingsgebied.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding voor de vorming van Alginate Discs
- Bereid een 4% (w / v) alginaat oplossing 1 x Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder toevoeging van calciumchloride of magnesiumchloride en in een 37 ° C waterbad. Concentraties van de alginaatoplossing kan variëren, maar 1-4% (w / v) alginaat oplossingen aanbevolen.
- Meng de alginaatoplossing in een verhouding van 1: 1 met warm celkweekmedium base (bijvoorbeeld Dulbecco's Modified Eagle Medium.) Voor het gewenste celtype. De alginaatconcentratie nu de helft van de oorspronkelijke concentratie, bijv., 2% (w / v). Steriliseren alginaat / media oplossing met behulp van een steriele 0,2 um nylon spuit filters.
- Bereid een bad van steriele 102 mM calciumchloride dihydraat in steriel water met voldoende oplossing vormen dompelen (~ 200-300 ml).
- Verzamel de steriele "gelvorming mal" (6 mm diameter x 3 mm lange cilindrische putten in een 3 x 3 in aluminium plaat, zie
- Snijd dik filtreerpapier (blotter filtreerpapier) en de cel microzeef membraan (10 pm poriegrootte) aan de afmetingen van de bovenste en onderste eindplaten en plaats ze in het calciumchloridebad tot verzadiging, ongeveer 1 min. Indien gewenst, gesteriliseerd dik filtreerpapier en de microzeef membraan via autoclaaf of ultraviolet licht gedurende 30 minuten voor gebruik.
- Set-up de helft (de onderste helft) van de mal construct.
- Plaats de volgende punten op dezelfde positie in deze volgorde en glad met een steriele spatel: grote eindplaat (3 cm x 3 inch), dik filtreerpapier, waarna de microzeef membraan.
- Omkeren en druk de matrijs op een stapel papieren zakdoekjes om verlies van overgewicht calciumchlorideoplossing waarborgen.
- Leg het "gelvorming mold" met de cilindrische putten bovenop de cell microzeef membraan en voorzichtig draai de mal samen aan twee kanten met behulp van bindmiddel clips aan de linker- en rechterkant. Zorg ervoor dat je genoeg ruimte voor de top eindplaat te verlaten (1,5 in x 3 inch) aan de putjes volledig later te dekken.
- Set-up van de tweede helft (de bovenste helft) van de mal construct.
- Plaats de volgende punten op dezelfde positie in deze volgorde en glad: kleine eindplaat, dik filtreerpapier microzeef membraan.
- Omkeren en druk op deze helft van de mal op een stapel papieren zakdoekjes om verlies van overgewicht calciumchlorideoplossing waarborgen. Doe dit de helft van de mal met behulp van bindmiddel clips op dit moment niet vast.
Opmerking: Bij gebruik van deze methodevoor het maken van lagen met verschillende celtypen, zorg ervoor dat cultuur twee celtypen in parallel voor gelaagdheid. Mesenchymale stamcellen (MSC's) uitgezaaid met een celdichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml wordt gebruikt als een voorbeeld voor volgende protocol. Celaantal en CD-nummer kan worden opgeschaald voor experimenten nodig.
- Een tot twee weken voorafgaand aan inbedding, zaad mesenchymale stamcellen bij een celdichtheid van 3000 - 5000 cellen / cm2 in 10 ml basale kweekmedium (Dulbecco's Modified Eagle Medium, 10% foetaal runderserum, 2% L-Glutamine, 1 % niet-essentiële aminozuren, 1% penicilline / streptomycine) in T-75 kolven.
- Verwijder verbruikte media elke 2-3 dagen vervangen en 10 ml basale kweekmedium totdat de cellen 80-90% confluent.
- Om cellen te oogsten, te verwijderen besteed media en pipet 3 ml 1x Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder toegevoegde calciumchloride of magnesiumchloride om cellen te spoelen. Verwijder deze oplossing pipet 3 ml 0,25% Trypsin-EDTA op cellen groeien in T-75 kolven en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Na de cellen van het hechtoppervlak hebben opgeheven, voeg 6-9 ml van basale groei media.
- Centrifugeer MSC's bij 600 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, zuig de supernatant en resuspendeer in 1-5 ml basale kweekmedium. Tel de cellen met een hemocytometer behulp instructies apparaat.
- Verwijder 1 x 10 6 cellen van de totale cel resuspensie centrifuge onder dezelfde omstandigheden, en zuig de supernatant.
2. Vorming van de Cel Seeded Alginate Discs
- Resuspendeer de celpellet met 1 ml van de steriele alginaat / media oplossing tot een celdichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml bereiken. De cel-alginaat mengsel wordt homogeen troebel in uiterlijk wanneer de cellen worden gemengd in geschikte wijze.
- Pipetteer 130 ul van de cel-alginaat mengsel in zes 6 mm diameter x 3 mm lang putten in de onderste helft van de matrijsconstruct druppelsgewijs, zodat er geen eventuele luchtbellen creëren. Een lichte convexe meniscus moet goed zichtbaar boven de rand van elk van hen.
- glad voorzichtig de bovenste helft van de mal construct met een steriele spatel en omdraaien, zodat de cel microzeef membraan bovenop de putjes. Los de vormen construct bovenop de putjes en let op de putjes die de cel en alginaat mengsel volledig omsluit.
- Til de matrijs geladen construct en terwijl stevig in te drukken op het midden, bindmiddel clip de overige twee zijden (boven en onder) aan de bovenste en onderste helften van de mal construct vast. De cel-alginaat oplossingen moeten stevig genesteld in de putjes op dit moment.
- Dompel de mal bevestigd construct in de 102 mm calciumchloride bad, om ervoor te zorgen dat de hele constructie wordt ondergedompeld. Incubeer in de celkweek kap bij kamertemperatuur gedurende 90 min.
- Aan het einde van de 90 minuten, verwijder de mal construct van 102 mM calciumchloridebad en leg ze op een stapel papieren handdoekjes in de celkweek kap. Verwijder alle vier bindmiddel clips en scheiden de twee helften van de mal construct. Hydrogelen gevormd in de putjes geen luchtbellen en moeten de wells volledig vullen.
- Met een spatel voorzichtig sporen de rand van de putjes die de hydrogels zorgvuldig losmaken en vastklemmen van de hydrogelen. Na verwijdering van de hydrogelen uit de vorm construct, laat de hydrogels direct in een bad van 1 x Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing met calcium en magnesiumchloride. Bedek de gels volledig de overmaat calciumchloride-oplossing af te wassen voor 1-5 min.
- Breng de hydrogels in basale kweekmedium oplossing gewenste schaal (bijv., 6 putjes) die volledig bedekt hydrogels. Incubeer gedurende ten minste 1 uur in de celkweek incubator bij 37 ° C en 5% CO 2 te gaan naar de stap lagen.
Noot: Hydrogels bevattende cellen kunnen worden bewaardde celkweek incubator oneindig momenteel tot lagen van gels met een andere celpopulatie gewenst, mits de verandering van medium elke 2 voltooid - 3 dagen.
3. gelaagdheid van Alginate Discs
- Tijdens het laatste half uur van de 1 uur incubatie, te verzamelen en voor te bereiden steriele matrijzen en oplossing voor het uitgloeien van de gels.
- Bereid de "cutting mold" door het bevestigen van een schimmel die putjes helft van de hoogte van de "gelvorming mold" heeft (6 mm diameter x 1,5 mm lang putjes in een 3 cm x 3 in aluminiumplaat) een eindplaat (3 in x 3 in aluminium plaat) met behulp van bindmiddel clips aan de linker- en rechterkant.
- Bereid de "gloeien mal" door het bevestigen van een schimmel die is 3 mm groter in diameter dan de "gel formatie mold" (9 mm diameter x 3 mm lang putten in een 3 in x 3 in aluminiumplaat) een eindplaat (3 in x 3 in aluminium plaat) met behulp van bindmiddel clips aan de linker- en rechterkant.
- Bereid een oplossing van100 mM natriumcitraat / 30 mM EDTA (natriumcitraat dihydraat, ethyleendiaminetetra-azijnzuur tetranatriumzout dihydraat) in steriel water.
- Verwijderen gels gewenste cel populaties (in dit voorbeeld beide schotels hMSCs) vanaf het medium in de schaal, en plaats in de "cutting mold" putten. Elke gel moet goed passen in de putjes met de helft van de gel uitsteekt boven de mal.
- Met behulp van een scalpel, snijd de gel aan het oppervlak van de mal (dit zal de hydrogel gehalveerd). Draai de bovenste helft van de gel en plaats deze in een open vorm ook. De helft van de gel moet ook goed passen in de mal goed, maar nu zowel de helft van gels zou de hoogte van de mal met de cut binnenkant zichtbaar zijn. Herhaal dit met de tweede gel.
Let op: Let op: Alleen de binnenste snijvlakken zullen gelaagde schijven vormen. Met de buitenvlakken leidt tot de helften scheiden. Vermoed wordt dat de structuur van de microzeef membraan overgebracht op het gel oppervlak te voorkomenHet succes van het gloeien proces. - Leg een stuk droge cel Microzeef membraan op de top van de putten, zorg ervoor dat de microzeef membraan in contact met alle van de gel helften te worden gekoppeld en ze te bedekken geheel. Plaats dik filterpapier bovenop de microzeef membraan, en zorg ervoor dat de gels volledig te bedekken.
- Pipetteer een oplossing van 100 mM natriumcitraat / 30 mM EDTA (Natriumcitraatdihydraat, Ethyleendeniaminetetraacetaat tetranatriumzout dihydraat) op de dikke filterpapier totdat deze verzadigd is. Ongeveer 750 gl voldoende vier putten.
- Incubeer de gels gedurende 1 min bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de cel microzeef membraan en dik filter papier en gooi ze weg. Verwijder de bindmiddel clips en open de mal.
- Voor elke gegloeid gel, overdragen één natriumcitraat /-EDTA behandelde helft van de hydrogel op de voorbereide "gloeien mal" met het snijvlak naar boven. Dit zal de helft van de ontlaten const wordenruct.
- Met behulp van een spatel, een lift en plaats een tweede natriumcitraat /-EDTA behandelde helft-gel (kan bevatten een ander type cel) op de gel al in het "gloeien mal", flippen deze tweede helft-gel, zodat het snijvlak is in contact met het uiteinde van het gel reeds in het "annealing mold".
- Druk voorzichtig neer op de twee gels met behulp van een spatel om eventuele luchtbellen tussen de twee gels te verwijderen. Ook de positie van de gels als nodig is om ervoor te zorgen dat ze rechtstreeks op de top van elkaar.
- Til de "gloeien mal" en dompel het in de 102 mm calciumchloride bad gedurende 30 min. Bedek de putten met een eindplaat.
- Na de 30 min incubatie, verwijder de "gloeien mal" en plaats deze op keukenpapier. Verwijder de bindmiddel clips en haal de mal van de eindplaat.
- Met behulp van een spatel, laat het ontlaten gels en plaats ze in een 1 x Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing met calcium chloride en magnesium chloride bad om de gels te wassen. Vervolgens overdracht gehybridiseerd hydrogels te celkweekmedium in een gewenste schaal (bijv., 6-well plaat) cultuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont de vorming en de gelaagdheid van het alginaat hydrogels. Afgesloten bi-gelaagde gels vertonen een volledige initiële scheiding van celpopulaties zoals in figuur 2. Cel levensvatbaarheid van menselijke mesenchymale stamcellen) ingebed in deze hydrogelen en gelaagd hoog en vergelijkbaar met de bulk hydrogels zoals getoond in figuur 3. Levensvatbaarheid werd bepaald na gloeien, snijden de gels verticaal om het centrum en kleuren van de levende cellen in de gegloeide gels met een levende cel tracker, CMFDA (groen) en de dode cellen (rood) met ethidium homodimeer-1 volgens de instructies van de fabrikant. Confocale Z-stacks werden van het snijvlak met een fluorescentiemicroscoop ongeveer 100 urn in de gel. Deze beelden werden geprojecteerd een 2D-beeld in. Levende en dode cellen werden vervolgens gekwantificeerd met behulp van het deeltje analyser functie in de ImageJ software.
jpg "/>
Figuur 1:. Schema van gelaagde Hydrogel Vorming A. Afbeelding van de gestapelde vorm voor toevoeging van 2% alginaat + celmengsel met een afbeelding van de stapelvolgorde van de onderste en bovenste vormhelften. B. Schematische beeltenis procedure voor de gelaagdheid van de gel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Vertegenwoordiger Scheiding van Cell Populaties in gelaagde Hydrogel Model cellijn 293FT HEK-cellen werden ofwel gekleurd met levende cellen tracker CMFDA (groen) of CMTPX (rood). Elk van deze celgroepen ingebed in 2% (w / v) alginaat schijven en vervolgens helften van deze schijven werden samen gelaagd. Een stuk werd gesneden uit de CMTPX kant om het te identificeren tijdens de beeldvorming. Schaal bar = 100 & #181; m. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. High levensvatbaarheid van de cellen binnen Layered Hydrogel na Gelaagdheid proces is voltooid Menselijke mesenchymale stamcellen ingebed in bulk en bi-gelaagde hydrogels werden gekleurd met levende cellen (groen) tracker CMFDA en dode cellen (rood) werden gekleurd met ethidiumhomodimeer-1 . Levensvatbaarheid bleef hoog voor zowel hydrogel groepen na de gelaagdheid proces. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figur. e 4: evolutie aanzienlijk verschilt van gelaagde Hydrogel Cyclische compressie Response to Cyclische compressie Hydrogelen werden in een celkweek incubator gedurende zeven dagen en vervolgens onderworpen aan 0-10% onbeperkte cyclische compressie gedurende vier uur bij 1 Hz. Piekspanningen (± SEM) voor elke cyclus werden geïsoleerd en de trends in de laden periode geanalyseerd. Trends onder onbeperkte cyclische compressie van 0 - 10% belasting voor gelaagde (n = 9) en bulk (n = 8) gels zijn significant verschillend (p = 0,03). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven hier een protocol voor het vormen van gelaagde alginaat hydrogel schijven voor de co-kweken van meerdere celpopulaties, zoals in fysiologisch gelaagde weefsels, bijvoorbeeld kraakbeen. Gelaagde structuren, zoals beschreven cultuur platform kan gebruikt worden om de interactie tussen twee verschillende celpopulaties aan dezelfde cultuuromgeving of onder belasting onderzocht.
Alginaat een anionisch lineair polysaccharide dat is gevonden biocompatibel te zijn en is met succes gebruikt voor kraakbeenbiologie en weefseltechnologie onderzoek 12,14. Alginaat hydrogelen gevormd middels divalente kationen voor verknoping, bijv., Calciumionen. De verknopingen kunnen worden ongedaan gemaakt door het verwijderen van kationen met een chelator, zoals natriumcitraat of EDTA, en dit proces is eerder gebruikt om chondrocyten die zijn gekweekt in de gels 3,4,12 isoleren. Evenzo hetzelfde principeis ook met succes toegepast voor het hechten alginaat vellen dubbellagen of clusters van alginaatparels elkaar 11,12,15. De hier beschreven platform voert hetzelfde proces, maar worden kleine schijfvormige gelaagde hydrogels vormen. Twee-staps proces waarbij enerzijds alginaat schijven worden gevormd middels matrijzen ondergedompeld in een kalkrijke bad. Deze worden vervolgens in tweeën gesneden en behandeld met een oplossing van calcium chelerende lokaal calcium ionen uit het verknoopte alginaat. Door deze behandelde oppervlakken bij elkaar te plaatsen en opnieuw onder te dompelen de schijven in een calcium-rijke oplossing, worden crosslinks hervormd, waardoor bi-gelaagde constructies. Deze kleine gelaagde gels elimineren de noodzaak voor biopsie slagen op eenvoudig te kweekmonsters geschikt tests en experimenten zoals mechanische testen genereren, zoals getoond in figuur 4, waardoor verspilling van vaak kostbare cellen alsmede fabricage materialen minimaliseren.
Zoals getoond inFiguur 3 is dit proces van het vormen en lagen de hydrogels geleid vergelijkbaar hoog levensvatbaarheid als controle of bulk hydrogels aangeeft dat deze procedure niet overdreven belasten de celpopulatie ondanks de lengte en de afwezigheid van voedingsstoffen aanvullen. Het ontbreken van een eerste overlappingsgebied in de gel laat fysische scheiding tijdens de eerste co-kweek en de mogelijkheid om veranderingen aan die interface observeren tijd. Studies hebben aangetoond dat gedurende lange cultuurperioden deze interface kan definitie verliezen door mobiele cross-infiltratie en extracellulaire matrixafzetting 11. Terwijl het eerste gelaagde disc geen adhesie moleculen, extracellulaire matrix is afgezet, is er een potentieel voor het onderzoeken van de samenvoeging van celpopulaties en de veranderende grensvlak tussen de lagen.
Deze bi-gelaagde schijven kunnen eenvoudig worden gebruikt voor dynamische compressie stimulatie. We waren in staat om te bevestigen dat these hydrogels dynamische compressie weerstaan zonder afscheiding van de helften. Tijdens dit proces piekbelasting vertoond door de gelaagde hydrogelen gedurende de vier uur durende cyclische compressie bleken significant van de niet-gelaagde, bulk zijn, hydrogels. Dit resultaat suggereert complex, non-lineaire spanning-overdracht tussen de lagen en onthult een behoefte aan een fysiek gelaagde control gel, bijv., Bi-gelaagde hydrogel met dezelfde celpopulatie / conditie in elke laag, een belangrijk detail te merken bij de planning van de experimenteel ontwerp voor studies met mechanische belasting. Beter begrip van de waargenomen verschillen kunnen worden bereikt door computationeel modelleren van ruimtelijke monteurs binnen deze gels. Niet alleen zouden dergelijke analyses duidelijker aangegeven rekverloop en overdracht tussen de lagen, maar het zou ook een hulpmiddel voor het interpreteren van cellulair gedrag in deze gelaagde gels, vooral met lagen van verschillende mechanische eigenschappen zijn.
Deze cultuur platform was ontwikkeld voor onderzoek toepassingen voor het onderzoeken van de relaties tussen de verschillende celpopulaties in 3D cultuur. Aldus wordt beperkt door het gebrek aan schaalbaarheid voor klinische toepassingen. Alternatieve methoden voor het maken van gelaagde hydrogels, zoals 3D-printing, kan uiteindelijk meer klinisch relevant zijn als gevolg van verwachte toekomstige ontwikkelingen schaalbaarheid, controle over de microstructuur op de schijf interieur, en de aanpasbaarheid van macroschaal geometrische functies. Voor onderzoek toepassingen, zoals hier gepresenteerd, het alginaat schijven niet zelfstandig voorzien adhesie groepen voor cellen, die de toepassing ervan op andere cellen types zou kunnen beperken. Het vergelijkbare alternatief voor alginaat bij het overwegen van het gebruiksgemak is agarose, die lijdt aan soortgelijke beperkingen. Verder vereist het gebruik van enzymen om cellen geven voor downstream analyse, terwijl alginaat verknopingen veilig kan worden verwijderd met calcium chelerende middelen. In de eerste plaats, zal deze cultuur platform te helpen met het verbeteren van de understanding relaties tussen celpopulaties in hydrogels en mogelijk de effecten van mechanische stimulatie van deze co-kweken. Dit begrip zal vervolgens het volgende aan de ontwikkeling van therapieën voor heterogene weefsels, vooral lastdragend weefsels zoals kraakbeen of tussenwervelschijven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginic Acid sodium salt | Sigma Aldrich | A1112 | Solution made in wt% using DPBS (-/-) |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-/-) | Gibco Life Technologies | 14190 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (+/+) | Gibco Life Technologies | 14190 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco Life Technologies | 11965 | Example. Use desired medium type |
| Syringe Filters (0.02 μm Nylon) | FisherBrand | 0979C | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Bioreagents | BP510 | Prepare solution in sterile water |
| Criterion Blotter Filter Paper | Biorad | 1704085 | Cut to size of endplates for mold formation |
| Cell Microsieve Membrane (10 μm pore size) | Biodesign Inc of New York | N10R | Cut to size of endplates for mold formation |
| Sodium citrate dihydrate | FisherScience | S93364 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA) | FisherBioreagent | BP121 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Life Technologies | 26140 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| Penicilin/Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco Life Technologies | 15140 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco Life Technologies | 25030081 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| Non-essential Amino Acids (100x) | Gibco Life Technologies | 11140050 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
References
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The Basic Science of Articular Cartilage. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
- Neidlinger-Wilke, C., et al. Mechanical loading of the intervertebral disc: from the macroscopic to the cellular level. Eur. Spine J. 23 (3), 333-343 (2013).
- Klein, T. J., et al. Tissue engineering of stratified articular cartilage from chondrocyte subpopulations. Osteoarth. Cartilage. 11 (8), 595-602 (2003).
- Han, E., et al. Scaffold-free Grafts for Articular Cartilage Defects. Clin. Orthop. Relat. R. 466 (8), 1912-1920 (2008).
- Ng, K. W., Ateshian, G. A., Hung, C. T. Zonal chondrocytes seeded in a layered agarose hydrogel create engineered cartilage with depth-dependent cellular and mechanical inhomogeneity. Tissue Eng. A. 15 (9), 2315-2324 (2009).
- Ng, K. W., et al. A layered agarose approach to fabricate depth-dependent inhomogeneity in chondrocyte-seeded constructs. J. Orthop. Res. 23 (1), 134-141 (2005).
- Nguyen, L. H., Kudva, A. K., Saxena, N. S., Roy, K. Engineering articular cartilage with spatially-varying matrix composition and mechanical properties from a single stem cell population using a multi-layered hydrogel. Biomaterials. 32 (29), 6946-6952 (2011).
- Leone, G., et al. Continuous multilayered composite hydrogel as osteochondral substitute. J. Biomed. Mater. Res. A. 103 (8), 2521-2530 (2015).
- Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels. Sci. Rep. 3, (2013).
- Vigfúsdòttir, ÁT., Pasrija, C., Thakore, P. I., Schmidt, R. B., Hsieh, A. H. Role of Pericellular Matrix in Mesenchymal Stem Cell Deformation during Chondrogenic Differentiation. Cell. Mol. Bioeng. 3 (4), 387-397 (2010).
- Lee, C. S. D., Gleghorn, J. P., Won Choi, N., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. Integration of layered chondrocyte-seeded alginate hydrogel scaffolds. Biomaterials. 28 (19), 2987-2993 (2007).
- Gleghorn, J. P., Lee, C. S. D., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures. J. Biomed. Mater. Res. A. 85 (3), 611-618 (2008).
- Gharravi, A. M., Orazizadeh, M., Ansari-Asl, K., Banoni, S., Izadi, S., Hashemitabar, M. Design and Fabrication of Anatomical Bioreactor Systems Containing Alginate Scaffolds for Cartilage Tissue Engineering. Avicenna J. Med. Biotechnol. 4 (2), 65-74 (2012).
- Xu, J., et al. Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells in Three-Dimensional Alginate Gels. Tissue Eng. A. 14 (5), 667-680 (2008).
- Yeatts, A. B., Gordon, C. N., Fisher, J. P. Formation of an aggregated alginate construct in a tubular perfusion system. Tissue Eng. C, Methods. 17 (12), 1171-1178 (2011).
