Introduction
इस तरह के जोड़ कार्टिलेज या intervertebral डिस्क के रूप में Compressive भार वहन ऊतकों विषम ऊतक क्षेत्रों है कि दोनों biomechanical समारोह और ऊतकों में उचित mechano पारगमन के लिए महत्वपूर्ण हैं से मिलकर बनता है। इतना ही नहीं सेलुलर संगठन है और अलग-अलग क्षेत्रों में अलग-अलग समारोह, लेकिन बाह्य matrices (ईसीएम) भी रचना और संगठन में विविध रहे हैं। उदाहरण के लिए, जोड़ कार्टिलेज अलग-अलग सेल आकृति विज्ञान, यांत्रिक समारोह, और ईसीएम के साथ तीन प्राथमिक क्षेत्रों के होते हैं। उनकी ईसीएम नेतृत्व भार वहन करने के लिए अंतर जिम्मेदारियों में मतभेद; सतही परत मुख्य रूप से लोड करने के लिए तन्यता प्रतिक्रिया में शामिल है, जबकि मध्यम और गहरी क्षेत्रों संपीड़न 1 के जवाब के लिए मुख्य रूप से जवाबदेह हैं। इसी तरह, intervertebral डिस्क, एक जेल की तरह नाभिक pulposus एक परतदार वलय फाइब्रोसिस से घिरा हुआ है और इन दो विशिष्ट क्षेत्रों के भीतर कोशिकाओं biophysical उत्तेजनाओं के विभिन्न प्रकार के अनुभवके रूप में ऊतक से होकर गुजरती है और यांत्रिक बलों के लिए जवाब है 2। ऊतकों, कोशिकाओं और ऊतकों परतों के भीतर कोशिकी matrices के इन प्रकार में एक दूसरे के साथ बातचीत।
ऐसी विषम ऊतक संरचनाओं की संक्षिप्त ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्योजी चिकित्सा के क्षेत्र में एक चुनौती बनी हुई है, और उनके जैविक महत्व के बारे में हमारी समझ को सीमित है। एक का निर्माण भीतर स्तरीकृत ऊतकों के रूप में अच्छी तरह से कोशिकाओं के विभिन्न आबादी के सह संस्कृतियों का विश्लेषण करने के लिए प्लेटफार्म संवर्धन के लिए एक आवश्यकता है। जोड़ कार्टिलेज ऊतक इंजीनियरिंग में, पाड़-कम बहुस्तरीय निर्माणों इस ऊतक 3,4 की विभिन्न परतों नकल करने के लिए विविध ईसीएम जमा करने के लिए जोनल chondrocytes की क्षमता का दोहन करके निर्माण किया गया है। हालांकि, बहुस्तरीय हाइड्रोजेल निर्माणों सेल आबादी है कि स्वतंत्र रूप से एक मजबूत ऊतक के रूप में करने की क्षमता की कमी के विविध प्रकार की बातचीत की जांच के लिए एक अवसर प्रदान करते हैं। उदाहरण के लिए, विभिन्न पॉपmesenchymal स्टेम कोशिकाओं की ulations बहुस्तरीय निर्माणों के भीतर सह सुसंस्कृत जा सकता है। इस तरह से बहुस्तरीय scaffolds दोनों chondrocytes और बेहतर ऊतक इंजीनियरिंग 5 के लिए mesenchymal स्टेम सेल फर्क के साथ इस्तेमाल किया गया है। इतना ही नहीं अलग सेल आबादी जा सह सुसंस्कृत कर सकते हैं समान हाइड्रोजेल परतों में है, लेकिन एक एकल कोशिका प्रकार का भी परतों है कि अलग-अलग कठोरता या जैव रासायनिक सामग्री कोशिकाओं 6.7 से अलग प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना करने के लिए चालाकी से किया गया है भीतर संवर्धित किया जा सकता।
कई अलग अलग biomaterial हाइड्रोजेल ऐसे पॉलीथीन ग्लाइकोल या पाली विनाइल शराब ठिकानों 7-9 का उपयोग उन लोगों के रूप में उपास्थि ऊतक इंजीनियरिंग के लिए सेल आबादी परत करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, alginate हाइड्रोजेल से सह संस्कृति में विषम सेल आबादी के अध्ययन के लिए बहुस्तरीय scaffolds बनाने के लिए सबसे सरल biomaterials में से एक हैं। agarose हाइड्रोजेल भी आसानी से बनते हैं, वहीं alginate हाइड्रोजेल की अनुमति के लिए आसान है का जोड़ा लाभ हैव्यक्ति की कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए 3 डी निर्माण से कोशिकाओं की olation के रूप में पहले 10 में वर्णित किया गया है। पिछले अध्ययनों में, द्वि-स्तरीय alginate हाइड्रोजेल पतली शीट में गठन किया गया है और इन चादरों से, वर्गों कटा रहे थे (जैसे।, एक बायोप्सी पंच का उपयोग) इस तरह के जैव रासायनिक सामग्री या इंटरफेसियल कतरनी गुण 11,12 के विश्लेषण के लिए के रूप में विशेष अनुप्रयोगों के लिए। पतली शीट alginate के गठन के लिए एक अन्य तरीका कई परतों में स्तरीकरण के लिए क्षमता के साथ वर्णित किया गया है, लेकिन अभी भी यांत्रिक परीक्षण 13 में उपयोग के लिए हाइड्रोजेल करने के लिए परिवर्तन की आवश्यकता होगी।
यहाँ, हम reproducibly कोशिकाओं के सह संवर्धन विभिन्न आबादी में उपयोग के लिए द्वि-स्तरित alginate हाइड्रोजेल डिस्क बनाने के लिए एक तरीका मौजूद है। इस alginate डिस्क मंच के कई फायदे के पास। जाहिर है, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य आकार और छोटे आकार के एक बायोप्सी पु आवश्यकता के बिना एम्बेडेड कोशिकाओं के यांत्रिक उत्तेजना के लिए अनुकूल हैएनसीएच या कई अनुप्रयोगों के लिए हाइड्रोजेल करने के लिए अन्य शारीरिक परिवर्तन। इसके अतिरिक्त, सेल व्यवहार्यता लेयरिंग प्रक्रिया के दौरान उच्च बनी हुई है, और जेल गठन के बाद जेल के भीतर दो सेल आबादी के एक स्पष्ट विभाजन कोई प्रारंभिक ओवरलैपिंग क्षेत्र के साथ दिख रहा है।
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Protocol
1. Alginate डिस्क के गठन के लिए तैयारी
- एक 4% तैयार (डब्ल्यू / वी) जोड़ा कैल्शियम क्लोराइड या मैग्नीशियम क्लोराइड और एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जगह बिना 1x Dulbecco फास्फेट बफर खारा में alginate समाधान। alginate समाधान की सांद्रता भिन्न हो सकते हैं, लेकिन 1 - 4% (डब्ल्यू / वी) alginate समाधान सिफारिश कर रहे हैं।
- वांछित सेल प्रकार के लिए 1 गर्म सेल संस्कृति मीडिया आधार के साथ (जैसे, Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम।): 1 के अनुपात में alginate समाधान मिश्रण। Alginate एकाग्रता, अब मूल एकाग्रता का आधा है अर्थात्।, 2% (डब्ल्यू / वी)। बाँझ 0.2 माइक्रोन नायलॉन सिरिंज फिल्टर का उपयोग alginate / मीडिया समाधान जीवाणुरहित।
- (- 300 मिलीलीटर 200 ~) के नए नए साँचे डूब के लिए पर्याप्त समाधान के साथ बाँझ पानी में बाँझ 102 मिमी कैल्शियम क्लोराइड dihydrate की एक स्नान तैयार करें।
- बाँझ "जेल गठन ढालना" (6 मिमी व्यास एक्स 3 मिमी लंबा बेलनाकार एक 3 में एल्यूमिनियम प्लेट में एक्स 3 में कुओं लीजिए, वहाँ
- मोटी फिल्टर पेपर (चूसक फिल्टर पेपर) और सेल microsieve झिल्ली (10 माइक्रोन ताकना आकार) ऊपर और नीचे endplates के आकार में कटौती और, लगभग 1 मिनट उनमें कैल्शियम क्लोराइड स्नान में जगह जब तक संतृप्त। अगर वांछित, 30 मिनट पहले का उपयोग करने के लिए आटोक्लेव या पराबैंगनी प्रकाश के माध्यम से मोटी फिल्टर पेपर और microsieve झिल्ली बाँझ।
- सेट-अप ढालना निर्माण के एक आधे (नीचे आधा)।
- मोटी, फिल्टर पेपर, और फिर microsieve झिल्ली (एक्स 3 में 3) बड़े endplate: निम्न क्रम में एक दूसरे के ऊपर निम्न वस्तुओं जगह है और एक बाँझ रंग का उपयोग smoothen।
- पलटना और अतिरिक्त कैल्शियम क्लोराइड समाधान के नुकसान सुनिश्चित करने के लिए कागज तौलिए के एक ढेर पर मिट्टी प्रेस।
- बेलनाकार कुओं के साथ "जेल गठन मोल्ड" सी के शीर्ष पर रखेंपक्ष microsieve झिल्ली और धीरे बाएँ और दाएँ पक्ष पर बांधने की मशीन क्लिप का उपयोग कर दोनों पक्षों पर एक साथ ढालना जकड़ना। (में एक्स 3 में 1.5) शीर्ष endplate के लिए पर्याप्त जगह छोड़ने के लिए पूरी तरह से बाद में कुओं को कवर करने के लिए सुनिश्चित करें।
- सेट-अप ढालना निर्माण की दूसरी छमाही (ऊपर आधा)।
- इस क्रम में एक दूसरे के ऊपर निम्न वस्तुओं जगह है और smoothen: छोटे endplate, मोटी फिल्टर पेपर, microsieve झिल्ली।
- पलटना और अतिरिक्त कैल्शियम क्लोराइड समाधान के नुकसान सुनिश्चित करने के लिए कागज तौलिए के एक ढेर पर मोल्ड के इस आधे दबाएँ। मोल्ड इस समय बांधने की मशीन क्लिप का उपयोग कर के इस आधे जकड़ना मत करो।
नोट: इस विधि का उपयोग करते हैंविभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के साथ परतों बनाने के लिए, लेयरिंग के लिए समानांतर में संस्कृति दो प्रकार की कोशिकाओं के लिए सुनिश्चित करें। Mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं के एक सेल घनत्व पर वरीयता प्राप्त / एमएल निम्नलिखित प्रोटोकॉल के लिए एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा। जरूरत के रूप में सेल नंबर और डिस्क नंबर प्रयोगों के लिए बढ़ाया जा सकता है।
- बेसल विकास मीडिया के 10 मिलीलीटर (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2% एल Glutamine, 1 में 5000 कोशिकाओं / 2 सेमी - एक से दो सप्ताह पहले की 3,000 के एक सेल घनत्व पर embedding, बीज mesenchymal स्टेम कोशिकाओं को % गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन) टी 75 बोतल में।
- 3 दिन और बेसल विकास मीडिया के 10 मिलीलीटर के साथ की जगह तक कोशिकाओं 80 कर रहे हैं - - खर्च मीडिया हर 2 हटाये 90% मिला हुआ।
- जोड़ा कैल्शियम क्लोराइड या मैग्नीशियम क्लोराइड कोशिकाओं कुल्ला करने के लिए बिना कोशिकाओं फसल के लिए, खर्च मीडिया को हटाने, और पिपेट 1x Dulbecco फास्फेट खारा बफर के 3 मिलीलीटर। इस समाधान निकालें, पिपेट का 0.25% की कोशिश करो 3 मिलीलीटरpsin EDTA के टी 75 बोतल में बढ़ कोशिकाओं पर, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं। बेसल विकास मीडिया के 9 मिलीलीटर - कोशिकाओं पक्षपाती सतह से उठा लिया है के बाद, 6 जोड़ें।
- अपकेंद्रित्र MSCs कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 600 XG पर तैरनेवाला aspirate, और 1 में फिर से निलंबित - 5 बेसल विकास मीडिया की मिलीलीटर। एक hemocytometer डिवाइस निर्देशों का उपयोग कर का उपयोग कोशिकाओं की गणना करें।
- कुल सेल मेजबान से 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं निकालें, सेंट्रीफ्यूज ही परिस्थितियों का उपयोग कर, और सतह पर तैरनेवाला aspirate।
2. सेल वरीयता प्राप्त Alginate डिस्क का गठन
- 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए बाँझ alginate / मीडिया समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ सेल गोली फिर से निलंबित। जब कोशिकाओं को उचित रूप में मिलाया जाता सेल alginate मिश्रण उपस्थिति में homogenously बादल होगा।
- पिपेट आचारण के नीचे छमाही में छह 6 मिमी व्यास एक्स 3 मिमी लंबा कुओं में सेल alginate मिश्रण के 130 μl, Dropwise निर्माण के रूप में तो किसी भी बुलबुले बनाने के लिए नहीं। एक मामूली उत्तल meniscus अच्छी तरह से प्रत्येक के किनारे के ऊपर दिखाई जानी चाहिए।
- ध्यान से एक बाँझ रंग का उपयोग ढालना निर्माण के शीर्ष आधा सुगम और इतना है कि सेल microsieve झिल्ली कुओं के शीर्ष पर है, यह मोड़ पर। जगह मोल्ड कुओं के शीर्ष पर निर्माण, सेल और alginate मिश्रण पूरी तरह से युक्त कुओं को कवर करने के लिए सुनिश्चित कर रही है।
- लोड ढालना निर्माण लिफ्ट और है, जबकि केंद्र पर मजबूती से नीचे दबाने, बांधने की मशीन शेष दो पक्षों (ऊपर और नीचे) क्लिप ढालना निर्माण के ऊपर और नीचे के हिस्सों दृढ़ करने के लिए। सेल alginate समाधान सुरक्षित रूप से इस समय कुओं में बसे किया जाना चाहिए।
- 102 मिमी कैल्शियम क्लोराइड स्नान में बांधा ढालना निर्माण को विसर्जित कर दिया, यकीन है कि पूरे निर्माण डूबे हुए है बना रही है। 90 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेल संस्कृति हुड में सेते हैं।
- 90 मिनट के अंत में, 102 मिमी कैल्शियम क्लोराइड से मोल्ड निर्माण हटानेस्नान और सेल संस्कृति हुड में कागज तौलिए के ढेर पर जगह है। सभी चार बांधने की मशीन क्लिप निकालें और मोल्ड निर्माण के दो हिस्सों को अलग। कुओं में गठित हाइड्रोजेल किसी भी बुलबुले नहीं होना चाहिए और पूरी तरह से कुओं को भरने चाहिए।
- एक रंग का प्रयोग, ध्यान हाइड्रोजेल युक्त ध्यान से ढीला और हाइड्रोजेल बाहर कील कुओं के किनारे का पता लगा। मोल्ड निर्माण से हाइड्रोजेल हटाने के बाद, सीधे कैल्शियम क्लोराइड और मैग्नीशियम क्लोराइड के साथ 1x Dulbecco फास्फेट खारा बफर के एक स्नान में हाइड्रोजेल ड्रॉप। जैल पूरी तरह से कवर 1 के लिए अतिरिक्त कैल्शियम क्लोराइड समाधान को धोने के लिए - 5 मिनट।
- वांछित डिश में बेसल विकास मीडिया समाधान (जैसे।, 6 अच्छी तरह प्लेटें) है कि पूरी तरह से हाइड्रोजेल कवर में हाइड्रोजेल स्थानांतरण। 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में कम से कम 1 घंटा और 5% लेयरिंग कदम के लिए जारी रखने से पहले सीओ 2 के लिए सेते हैं।
नोट: कोशिकाओं से युक्त hydrogels में रखा जा सकता हैइस समय सेल संस्कृति इनक्यूबेटर अनिश्चित काल के एक और सेल की आबादी के साथ जैल की लेयरिंग जब तक वांछित है, बशर्ते कि मीडिया में परिवर्तन हर 2 पूरा कर रहे है - 3 दिन।
3. Alginate डिस्क के layering
- 1 घंटा ऊष्मायन के अंतिम आधे घंटे के दौरान, इकट्ठा करने और जैल annealing के लिए नए नए साँचे और बाँझ समाधान तैयार है।
- (एक्स में एक endplate करने के लिए एक फफूंदी (एल्यूमिनियम प्लेट में एक्स 3 में एक 3 में 6 मिमी व्यास x 1.5 मिमी लंबा कुओं) "जेल गठन ढालना" की ऊंचाई के कुओं आधा है कि बन्धन 3 से "काटने ढालना" तैयार एल्यूमिनियम प्लेट में 3) बाएँ और दाएँ पक्ष पर बांधने की मशीन क्लिप का उपयोग कर।
- "Annealing ढालना" (एक्स में (9 मिमी व्यास एक्स 3 एक्स 3 मिमी एल्यूमिनियम प्लेट में एक 3 में लंबा कुओं) एक endplate करने के लिए एक साँचे में ढालना है कि 3 मिमी "जेल गठन ढालना" व्यास की तुलना में बड़ा बन्धन से तैयार 3 एल्यूमिनियम प्लेट में 3) बाएँ और दाएँ पक्ष पर बांधने की मशीन क्लिप का उपयोग कर।
- का एक समाधान तैयार100 मिमी सोडियम साइट्रेट / 30 मिमी EDTA (सोडियम साइट्रेट dihydrate, ethylenediaminetetraacetic एसिड tetrasodium नमक dihydrate) बाँझ पानी में।
- वांछित सेल आबादी के जैल निकालें (इस उदाहरण में, hMSCs के साथ दो डिस्क) डिश में मीडिया से, और "काटने ढालना" कुओं में जगह है। प्रत्येक जेल के जेल मोल्ड के ऊपर फैला हुआ के आधे के साथ कुओं में आराम से फिट होना चाहिए।
- एक छुरी का उपयोग, मिट्टी की सतह के साथ जेल (इस छमाही में हाइड्रोजेल कटौती करेगा) टुकड़ा। जेल के शीर्ष आधा पलटें और एक खुला ढालना अच्छी तरह से में जगह। जेल का आधा भी अच्छी तरह से मोल्ड में आराम से फिट होना चाहिए, लेकिन अब दोनों आधे जैल कटौती भीतरी सतह दिखाई साथ मोल्ड की ऊंचाई होना चाहिए। दूसरी जेल से दोहराएँ।
नोट: चेतावनी: केवल भीतरी सतहों कटौती बहुस्तरीय डिस्क के रूप में होगा। बाहरी सतहों का उपयोग करते हुए हिस्सों को अलग करने में परिणाम होगा। यह microsieve झिल्ली जेल सतह को रोकने पर स्थानांतरित से कि बनावट संदेह हैannealing प्रक्रिया की सफलता। - कुओं के शीर्ष पर सूखी सेल microsieve झिल्ली का एक टुकड़ा रखें, यह सुनिश्चित करें कि microsieve झिल्ली जेल हिस्सों के सभी के साथ संपर्क annealed जा करने में है बना रही है और उन्हें पूरी तरह से कवर किया गया। microsieve झिल्ली के शीर्ष पर मोटी फिल्टर पेपर की जगह, पूरी तरह से जैल कवर करने के लिए सुनिश्चित कर रही है।
- मोटी फिल्टर पेपर पर 100 मिमी सोडियम साइट्रेट / 30 मिमी EDTA (सोडियम साइट्रेट dihydrate, ethylenediaminetetraacetic एसिड tetrasodium नमक dihydrate) का एक समाधान पिपेट जब तक यह संतृप्त है। लगभग 750 μl चार कुओं के लिए पर्याप्त है।
- कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए जैल सेते हैं। फिर, सेल microsieve झिल्ली और मोटी फिल्टर पेपर को हटाने और उन्हें त्यागें। बांधने की मशीन क्लिप निकालें और ढालना खुला।
- प्रत्येक annealed जेल के लिए, कटौती की सतह ऊपर की ओर का सामना करना पड़ के साथ तैयार "annealing मोल्ड करने के लिए" हाइड्रोजेल से एक सोडियम साइट्रेट / EDTA का इलाज आधे हस्तांतरण। इस annealed const में से एक आधा हो जाएगाruct।
- एक रंग, लिफ्ट (मई को एक अलग सेल प्रकार के होते हैं) का उपयोग करना और एक दूसरे सोडियम साइट्रेट / EDTA का इलाज आधे जेल जगह पहले से ही "annealing ढालना" में जेल पर, इस दूसरी छमाही जेल flipping इतना है कि कटौती की सतह में है पहले से ही "annealing ढालना" में जेल की कटौती की सतह के साथ संपर्क करें।
- धीरे से एक रंग का उपयोग कर दो जैल के बीच किसी भी बुलबुले को दूर करने के लिए दो जैल पर नीचे प्रेस। इसके अलावा, जैल के रूप में यकीन है कि वे एक दूसरे के शीर्ष पर सीधे हैं बनाने के लिए आवश्यक स्थान।
- धीरे "annealing ढालना" उठा और 30 मिनट के लिए 102 मिमी कैल्शियम क्लोराइड स्नान में डूब। एक endplate के साथ कुओं को कवर नहीं है।
- 30 मिनट ऊष्मायन के बाद, "annealing ढालना" को हटाने और कागज तौलिए पर जगह है। बांधने की मशीन क्लिप निकालें और endplate से मोल्ड अलग।
- एक रंग का प्रयोग, annealed जैल इकट्ठा करने और उन्हें कैल्शियम क्लोराइड और मीटर के साथ एक 1x Dulbecco फास्फेट खारा बफर में जगहagnesium क्लोराइड स्नान जैल धोने के लिए। बाद में, सेल संस्कृति मीडिया के लिए annealed हाइड्रोजेल एक वांछित डिश में (जैसे।, 6 अच्छी तरह से थाली) हस्तांतरण संस्कृति के लिए।
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Representative Results
चित्रा 1 गठन और alginate हाइड्रोजेल की लेयरिंग दर्शाया गया है। के रूप में 3 चित्र में दिखाया के रूप में मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं की चित्रा 2। सेल व्यवहार्यता) इन हाइड्रोजेल और बहुस्तरीय उच्च और थोक हाइड्रोजेल करने के लिए तुलनीय रहता है के भीतर एम्बेडेड में दिखाया पूरे द्वि-स्तरीय जैल सेल आबादी का एक पूरा प्रारंभिक जुदाई दिखा रहे हैं। व्यवहार्यता का आकलन किया गया था annealing के बाद, केंद्र तक पहुँचने के लिए जैल टुकड़ा करने की क्रिया खड़ी है और फिर एक जीवित सेल ट्रैकर, CMFDA (हरा) और मृत कोशिकाओं (लाल) ethidium homodimer -1 निर्माता के निर्देशों का उपयोग करने के साथ साथ annealed जैल में जीवित कोशिकाओं धुंधला हो जाना। Confocal जेड ढेर कटौती की सतह लगभग 100 माइक्रोन जेल में एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग के लिए ले जाया गया। इन छवियों को एक 2 डी छवि में पेश किया गया। रहते हैं और मृत कोशिकाओं को फिर थे ImageJ सॉफ्टवेयर में कण विश्लेषक सुविधा का उपयोग मात्रा।
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चित्रा 1:। बहुस्तरीय हाइड्रोजेल गठन के योजनाबद्ध ए नीचे और ऊपर ढालना हिस्सों के लिए स्टैकिंग आदेश के चित्रण के साथ 2% alginate + सेल मिश्रण के अलावा के लिए खड़ी ढालना की छवि। बी योजनाबद्ध जेल की लेयरिंग के लिए प्रक्रिया का चित्रण है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2:। बहुस्तरीय हाइड्रोजेल मॉडल सेल लाइन 293FT HEK कोशिकाओं में सेल आबादी के प्रतिनिधि पृथक्करण या तो जीवित कोशिका पर नजर रखने CMFDA (हरा) या CMTPX (लाल) के साथ दाग रहे थे। इन सेल समूहों में से प्रत्येक में 2% में एम्बेडेड थे (डब्ल्यू / वी) alginate डिस्क, और फिर इन डिस्क के हिस्सों को एक साथ स्तरित थे। एक टुकड़ा इमेजिंग के दौरान यह पहचान करने के लिए CMTPX तरफ से काट दिया गया। स्केल बार = 100 & #181;। एम यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3:। Layering प्रक्रिया के पूरा होने के बाद बहुस्तरीय हाइड्रोजेल भीतर उच्च सेल व्यवहार्यता मानव mesenchymal स्टेम सेल थोक और द्वि-स्तरीय हाइड्रोजेल में एम्बेडेड जीवित कोशिका (हरा) पर नजर रखने CMFDA और मृत कोशिकाओं (लाल) के साथ दाग थे ethidium homodimer-1 के साथ दाग थे । व्यवहार्यता लेयरिंग प्रक्रिया के बाद दोनों हाइड्रोजेल समूहों के लिए उच्च बनी रही। स्केल बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Figurई। 4: चक्रीय संपीड़न के लिए बहुस्तरीय हाइड्रोजेल चक्रीय संपीड़न रिस्पांस से काफी अलग रुझान Hydrogels सात दिनों के लिए एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में incubated रहे थे और बाद में 0 के अधीन - 1 हर्ट्ज पर चार घंटे के लिए 10% असमीमित चक्रीय संपीड़न। पीक तनावों (± SEM) प्रत्येक चक्र के लिए अलग थे और लदान की अवधि में प्रवृत्तियों का विश्लेषण किया। 0 से असमीमित चक्रीय संपीड़न के तहत रुझान - बहुस्तरीय (एन = 9) और थोक के लिए 10% तनाव (एन = 8) जैल काफी अलग (पी = 0.03) कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
यहाँ, हम इस तरह के physiologically बहुस्तरीय ऊतकों में उन लोगों के हैं, जैसे, उपास्थि के रूप में कई सेल आबादी के सह संस्कृतियों के अध्ययन के लिए बहुस्तरीय alginate हाइड्रोजेल डिस्क के गठन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। ऐसे में वर्णित संस्कृति मंच के रूप में बहुस्तरीय संरचनाओं, एक ही संस्कृति में पर्यावरण के लिए या लोड के तहत अधीन दो अलग सेल आबादी के बीच परस्पर क्रिया की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Alginate एक anionic रेखीय polysaccharide कि biocompatible होना पाया गया है और सफलतापूर्वक उपास्थि जीव विज्ञान और ऊतक इंजीनियरिंग रिसर्च 12,14 के लिए इस्तेमाल किया गया है। Alginate हाइड्रोजेल, crosslinking के लिए द्विसंयोजक फैटायनों का उपयोग कर बनते हैं जैसे।, कैल्शियम आयनों। ये crosslinks जैसे सोडियम साइट्रेट या EDTA के रूप में एक chelator, का उपयोग कर फैटायनों को हटाने के द्वारा नष्ट किया जा सकता है, और इस प्रक्रिया chondrocytes कि जैल 3,4,12 में संवर्धित किया गया है को अलग-थलग करने के लिए पहले से इस्तेमाल किया गया है। इसी तरह, एक ही सिद्धांतयह भी सफलतापूर्वक bilayers या alginate मोती एक साथ 11,12,15 की भी समूहों में alginate शीट पालन करने के लिए लागू किया गया है। मंच यहाँ वर्णित इसी प्रक्रिया पर निर्भर करता है, लेकिन छोटे डिस्क के आकार बहुस्तरीय हाइड्रोजेल फार्म का उपयोग किया जाता है। यह एक दो कदम प्रक्रिया है जिसमें पहले, alginate डिस्क एक कैल्शियम युक्त स्नान में डूबे हुए नए नए साँचे का उपयोग का गठन कर रहे हैं। ये तो आधे में कटा हुआ है और स्थानीय स्तर पर crosslinked alginate से कैल्शियम आयनों जारी करने के लिए एक कैल्शियम chelating समाधान के साथ व्यवहार कर रहे हैं। इन इलाज सतहों को एक साथ रखने और एक कैल्शियम युक्त समाधान में डिस्क को फिर से डुबो कर, crosslinks सुधार कर रहे हैं, द्वि-स्तरीय निर्माणों बना रही है। इन छोटे बहुस्तरीय जैल, बायोप्सी घूंसे assays और इस तरह के यांत्रिक परीक्षण के रूप में प्रयोगों के साथ संगत आसान करने के लिए संस्कृति के नमूने उत्पन्न करने के लिए समाप्त करने की जरूरत के रूप में चित्रा 4 में दिखाया गया है, जिससे बार बार कीमती कोशिकाओं की बर्बादी के साथ ही निर्माण सामग्री कम से कम।
के रूप में दिखाया गयाचित्रा 3, बनाने और हाइड्रोजेल लेयरिंग की इस प्रक्रिया को इसी तरह उच्च व्यवहार्यता के परिणामस्वरूप के रूप में नियंत्रण या थोक हाइड्रोजेल यह दर्शाता है कि इस प्रक्रिया पीढ़ी की लंबाई और भरपाई पोषक तत्वों के अभाव के बावजूद सेल की आबादी को चुंगी नहीं है। जेल में एक प्रारंभिक ओवरलैपिंग क्षेत्र की कमी प्रारंभिक सह संस्कृति और समय के साथ कि इंटरफ़ेस करने के लिए परिवर्तन का पालन करने की क्षमता दौरान भौतिक जुदाई की अनुमति देता है। अध्ययनों से पता चला है कि लंबे समय तक संस्कृति अवधि में इस इंटरफेस सेलुलर पार घुसपैठ और बाह्य मैट्रिक्स बयान करने के लिए 11 कारण परिभाषा खो सकते हैं। प्रारंभिक बहुस्तरीय डिस्क, किसी भी आसंजन अणुओं को शामिल नहीं करता है के रूप में बाह्य मैट्रिक्स जमा किया जाता है, वहाँ भी सेल आबादी के विलय और परतों के बीच बदलते इंटरफेस की जांच के लिए एक संभावित है।
ये द्वि-स्तरित डिस्क गतिशील संपीड़न उत्तेजना के लिए आसानी से इस्तेमाल किया जा सकता है। हम जानते हैं कि इस बात की पुष्टि करने के लिए एचटीएमएल में सक्षम थेई हाइड्रोजेल हिस्सों की जुदाई के बिना गतिशील संपीड़न का सामना। हालांकि, इस प्रक्रिया के दौरान, शिखर चार घंटे की चक्रीय संपीड़न के दौरान बहुस्तरीय हाइड्रोजेल द्वारा प्रदर्शित लोड, गैर बहुस्तरीय, थोक से काफी अलग होने की हाइड्रोजेल पाए गए। इस परिणाम के परतों के बीच जटिल, गैर रेखीय तनाव हस्तांतरण पता चलता है और एक शारीरिक रूप से बहुस्तरीय नियंत्रण जेल लिए एक की जरूरत का पता चलता है, उदाहरण के लिए।, प्रत्येक परत में एक ही सेल आबादी / शर्त के साथ द्वि-स्तरीय हाइड्रोजेल, नोट करने के लिए एक महत्वपूर्ण विस्तार की योजना बना जब यांत्रिक लोड हो रहा शामिल अध्ययन के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन। मनाया मतभेद की बेहतर समझ इन जैल के भीतर स्थानिक यांत्रिकी के कम्प्यूटेशनल मॉडलिंग के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। इतना ही नहीं इस तरह के विश्लेषण में मदद मिलेगी परतों के बीच तनाव वितरण और हस्तांतरण स्पष्ट है, लेकिन यह भी इन बहुस्तरीय जैल में सेलुलर व्यवहार की व्याख्या, विशेष रूप से यांत्रिक गुणों में परिवर्तन के परतों के साथ के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई होगी।
यह संस्कृति मंच वा3 डी संस्कृति में अलग सेल आबादी के बीच संबंधों की जांच के लिए अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए विकसित कर रहा है। इस प्रकार, यह नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए scalability की कमी के द्वारा सीमित है। ऐसी 3 डी मुद्रण के रूप में बहुस्तरीय हाइड्रोजेल, बनाने के लिए वैकल्पिक तरीकों, अंततः प्रत्याशित भविष्य scalability अग्रिम, डिस्क इंटीरियर में microstructure पर नियंत्रण, और macroscale ज्यामितीय सुविधाओं के customizability के कारण चिकित्सकीय प्रासंगिक हो सकता है। अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए, यहाँ के रूप में प्रस्तुत किया है, alginate डिस्क स्वतंत्र रूप से आसंजन moieties कोशिकाओं है, जो अन्य कोशिकाओं प्रकार के लिए अपने आवेदन को सीमित कर सकता लिए प्रदान नहीं करते। तुलनीय विकल्प alginate करने के लिए जब उपयोग में आसानी पर विचार जो इसी तरह की सीमाओं से ग्रस्त agarose है। इसके अलावा, यह जबकि alginate crosslinks सुरक्षित रूप से कैल्शियम chelating एजेंट का उपयोग कर हटाया जा सकता है, नीचे की ओर विश्लेषण के लिए कोशिकाओं को रिहा करने के लिए एंजाइमों के उपयोग की आवश्यकता है। जाहिर है, इस संस्कृति मंच understandi में सुधार के साथ मदद मिलेगीहाइड्रोजेल में सेल आबादी और संभवतः इन सह संस्कृतियों के यांत्रिक उत्तेजना के प्रभाव के बीच संबंधों की एनजी। यह समझ तो, विषम ऊतकों के लिए उपचारों के विकास के बारे में सूचित करेंगे विशेष रूप से इस तरह के जोड़ कार्टिलेज या intervertebral डिस्क के रूप में असर ऊतकों लोड हो रहा है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginic Acid sodium salt | Sigma Aldrich | A1112 | Solution made in wt% using DPBS (-/-) |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-/-) | Gibco Life Technologies | 14190 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (+/+) | Gibco Life Technologies | 14190 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco Life Technologies | 11965 | Example. Use desired medium type |
| Syringe Filters (0.02 μm Nylon) | FisherBrand | 0979C | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Bioreagents | BP510 | Prepare solution in sterile water |
| Criterion Blotter Filter Paper | Biorad | 1704085 | Cut to size of endplates for mold formation |
| Cell Microsieve Membrane (10 μm pore size) | Biodesign Inc of New York | N10R | Cut to size of endplates for mold formation |
| Sodium citrate dihydrate | FisherScience | S93364 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA) | FisherBioreagent | BP121 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Life Technologies | 26140 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| Penicilin/Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco Life Technologies | 15140 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco Life Technologies | 25030081 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| Non-essential Amino Acids (100x) | Gibco Life Technologies | 11140050 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
References
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