Introduction
לטעון דחיסת נושאות ברקמות כגון סחוס במפרק או לדיסקים מורכבות אזורי רקמות הטרוגנית כי הם קריטיים עבור שניהם הפונקציה ביומכנית ו-התמר mechano המתאים בתוך הרקמה. לא רק ארגון הסלולר לתפקד ברור באזורים שונים, אך המטריצות התאיות (ECM) הן מגוונים גם בהרכב וארגון. לדוגמא, סחוס במפרק מורכב משלושה אזורים עיקריים עם מורפולוגיה תאים שונה, פונקציה מכאנית, ECM. הבדלים בעופרת ECM שלהם דיפרנציאלי אחריות נושאי העומס; השכבה השטחית מעורבת בעיקר לצורך מתן המענה המתיח לטעון, בעוד האזורים באמצע והעמוקים אחראים בעיקר בתגובת הדחיסה 1. בדומה לכך, הדיסק הבין חולייתי, pulposus גרעין דמוי ג'ל מוקף סיסטיק שבשבת annulus והתאים בתוך שני אלה תחומים ברורים לחוות סוגים שונים של גירויים biophysical2. בסוגים אלה של רקמות, תאים ואת המטריצות התאיות בתוך שכבות הרקמה לתקשר אחד עם השני כמו הרקמה עוברת ומגיבה כוחות מכאניים.
חזרה על מבנים רקמות הטרוגנית כזה עדיין מהווה אתגר בהנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית, ואת הבנתנו המשמעות הביולוגית שלהם מוגבל. יש צורך culturing פלטפורמות לניתוח רקמות מרובדת כמו גם שיתוף תרבויות של אוכלוסיות שונות של תאים בתוך מבנה אחד. בהנדסת רקמות סחוס במפרק, פיגום פחות שכבתי מבנים נבנו על ידי רתימת היכולת של כונדרוציטים אזורים להפקיד ECM המגוונת לחקות את השכבות השונות של רקמה זו 3,4. עם זאת, בונת הידרוג'ל שכבתית לספק הזדמנות לחקור את האינטראקציה של סוגים שונים של אוכלוסיות תאים חסרות היכולת ליצור רקמות חזקות באופן עצמאי. לדוגמה, פופ שונהulations של בתאי גזע mesenchymal יכול להיות שיתוף תרבותי בתוך מבנים שכבתיים. פיגומים שכבתיים כאלה שמשו בשני chondrocytes ומבדל בתאי גזע mesenchymal עבור הנדסת רקמות משופרת 5. לא רק יכולים אוכלוסיות תאים שונות להיות שיתוף תרבותי בשכבות הידרוג'ל דומות, אבל סוג תא בודד יכול גם להיות מתורבת בתוך שכבות כי נפלו קורבן למניפולציות יש קשיחות משתנית או תוכן ביוכימיים לעורר תגובות שונות מתאי 6,7.
הידרוג ביולוגי שונה רב שנוצל שכבת אוכלוסיות תאים עבור הנדסת רקמות סחוס כגון אלה באמצעות פוליאתילן גליקול או בסיסים ויניל אלכוהול פולי 7-9. עם זאת, הידרוג אלגינט אחד biomaterials הפשוטה שממנו ניתן ליצור פיגומים שכבתיים ללימוד אוכלוסיות תאי הטרוגנית שיתוף התרבות. בעוד הידרוג agarose גם נוצר בקלות, הידרוג אלגינט יש ערך המוסף של שמאפשר קלolation של תאים מן המבנה 3-D לניתוח של תאים בודדים, כמו תוארה בעבר 10. במחקרים קודמים, הידרוג אלגינט דו-שכבתי נוצר בסדינים דקים מגיליונות אלה, סעיפים היו פרוסים (למשל., באמצעות אגרוף ביופסיה) עבור יישומים מסוימים כגון ניתוח התוכן ביוכימיים או נכסי גזירת interfacial 11,12. שיטה נוספת להרכבת גליונות אלגינט דק תוארה עם פוטנציאל ריבוד לתוך שכבות מרובות, אך עדיין ידרוש שינוי אל הידרוג'ל לשימוש לבדיקות מכניות 13.
כאן, אנו מציגים שיטה ליצירת reproducibly דו-שכבתי דיסקים הידרוג'ל אלגינט לשימוש באוכלוסיות שונות-culturing שיתוף של תאים. פלטפורמת דיסק אלגינט זה הוא בעל מספר יתרונות. בראש ובראשונה, את הצורה לשחזור וגודל קטן הוא מסיע עבור גירוי מכני של תאים משובצים ללא צורך בביופסיה puNCH או שינוי פיזי אחר אל הידרוג'ל עבור יישומים רבים. בנוסף, כדאיויות תא נותרות גבוהות במהלך תהליך השכבות, ולאחר היווצרות קריש הפרדה ברורה של שתי אוכלוסיות התאים בתוך הג'ל גלויה ללא באזור חופפים ראשוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה להרכבת דיסקים אלגינט
- הכן 4% (w / v) פתרון אלגינט ב בופר פוספט של 1x Dulbecco ללא סידן כלורי הוסיף או מגנזיום כלוריד ומקום באמבט המים 37 מעלות צלזיוס. ריכוזים של פתרון אלגינט יכולים להשתנות, אבל 1 - 4% (w / v) פתרונות אלגינט מומלצים.
- מערבב את הפתרון אלגינט ביחס של 1: 1 עם בסיס תקשורת תרבית תאים חם (למשל, בינוני הנשר השונה של Dulbecco.) עבור סוג התא הרצוי. ריכוז אלגינט הוא עכשיו מחצית הריכוז המקורי, כלומר., 2% (w / v). לעקר פתרון אלגינט / מדיה באמצעות מסנני מזרק 0.2 מיקרומטר ניילון סטריליים.
- הכן אמבט של מימית סידן כלורי סטרילי 102 מ"מ במים סטריליים עם פתרון מספיק כדי להטביע תבניות (~ 200 - 300 מ"ל).
- אסוף את סטרילי "היווצרות קריש העובש" (6 מ"מ קוטר x 3 מ"מ בארות גליליות גבוהות בתוך 3 x 3 לוחית אלומיניום, ראה
- חותכי נייר סינון עבה (נייר סינון נייר סופג) ואת קרום התא microsieve (10 מיקרומטר גודל נקבובי) את הגדלים של העליון endplates התחתונה ומניח אותם באמבטית סידן כלורי עד רווי, כ 1 דקות. אם תרצה, לעקר את נייר סינון העבה קרום microsieve באמצעות אור אולטרה סגול חיטוי או למשך 30 דקות לפני השימוש.
- הגדרה למחצית (חצי התחתונה) של מבנה העובש.
- הנח את הפריטים הבאים על גבי אחד אחר לפי הסדר הבא ו להחליק בעזרת מרית סטרילי: endplate גדול (3 אינץ 'x 3), נייר סינון עבה, ולאחר מכן קרום microsieve.
- הפוך ולחץ על עובש על ערימה של מגבות נייר כדי להבטיח הפסד של פתרון כלוריד סידן עודף.
- מניח את "עובש היווצרות קריש" עם הבארות הגליליות על גבי גell microsieve קרום בעדינות להדק את התבנית יחד על שני הצדדים באמצעות קליפים קלסר על שמאל ובצד ימין. הקפד להשאיר מספיק מקום עבור endplate העליון (1.5 x 3) כדי לכסות את הבארות לחלוטין מאוחר יותר.
- הגדרה במחצית השנייה (חצי העליונה) של מבנה העובש.
- הנח את הפריטים הבאים על גבי אחד אחר לפי הסדר הבא ואת smoothen: endplate קטן, נייר סינון עבה, קרום microsieve.
- הפוך ולחץ המחצית של עובש על ערימה של מגבות נייר כדי להבטיח הפסד של פתרון כלוריד סידן עודף. אל תהדק המחצית של עובש באמצעות קליפים קלסר בשלב זה.
הערה: בעת שימוש בשיטה זולהכנת שכבות עם תאים מסוגים שונים, הקפידו סוגי תאי תרבות שניהם במקביל עבור שכבות. בתאי גזע mesenchymal (MSCs) זורעים בצפיפות תא של 1 x 10 6 תאים / מ"ל ישמש כדוגמה בפרוטוקול הבא. מספר סלולרי ומספר דיסק וניתן לשנותם לניסויים לפי הצורך.
- שבוע עד שבועיים לפני הטבעה, תאי גזע זרע mesenchymal בצפיפות תא של 3,000 - 5,000 תאים / 2 ס"מ ב 10 מ"ל של התקשורת צמיחה הבזליים (בינוני הנשר שונה של Dulbecco, 10% בסרום שור עוברית, 2% L-Glutamine, 1 שאינם חיוניים% חומצות אמינו, 1% פניצילין / סטרפטומיצין) צלוחיות T-75.
- סר מדיה בזבזה כל 2 - 3 ימים ולהחליף עם 10 מיליליטר של תקשורת צמיחה הבזליים עד שהתאים הם 80 - 90% ומחוברות.
- כדי לקצור תאים, להסיר התקשורת בילו, פיפטה 3 מ"ל של בופר פוספט של 1x Dulbecco ללא סידן כלורי הוסיף או מגנזיום כלוריד כדי לשטוף תאים. הסר פתרון זה, פיפטה 3 מ"ל של נסה 0.25%psin-EDTA על תאים הגדלים צלוחיות T-75, ו דגירה במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר התאים נוקף מפני השטח החסיד, להוסיף 6 - 9 מיליליטר של תקשורת צמיחה הבזליים.
- MSCs צנטריפוגה ב 600 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, לשאוב supernatant, מחדש להשעות ב 1 - 5 מ"ל של התקשורת צמיחה הבזליים. ספירת התאים באמצעות hemocytometer באמצעות הוראות התקן.
- סר 1 x 10 6 תאים מן resuspension התא הכולל, צנטריפוגה באמצעות אותם התנאים, ואת לשאוב supernatant.
2. כינונה של דיסקי אלגינט Seeded ניידים
- Re- להשעות את התא גלולה עם 1 מ"ל של הפתרון אלגינט / מדיה סטרילי כדי להשיג צפיפות התאים של 1 x 10 6 תאים / מ"ל. תערובת התא-אלגינט תהיה מעונן homogenously במראה כאשר תאים מעורבבים כראוי.
- פיפטה 130 μl של התערובת אלגינט תא לשש 6 מ"מ קוטר x בארות גבוהות 3 מ"מ במחצית התחתונה של העובשלבנות dropwise, כדי לא ליצור בועות. המניסקוס קמור קל צריך להיות גלוי מעל הקצה של כל טוב.
- בזהירות להחליק את המחצית העליונה של מבנה העובש בעזרת מרית סטרילי והפוך אותו, כך קרום התא microsieve הוא על גבי הבארות. מניחים את התבנית לבנות על גבי בארות, והקפד לכסות את הבארות המכיל את התא תערובת אלגינט לחלוטין.
- הרם את מבנה עובש טעון, תוך כדי לחיצה כלפי מטה בחוזקה על מרכז, קלסר קליפ שני הצדדים הנותרים (העליון והתחתון) להדק את חצאי העליון והתחתון של המבנה עובש. הפתרונות-אלגינט התא צריך להיות השוכן בבטחה בארות בשלב זה.
- לטבול את מבנה עובש מהודק באמבטיה כלוריד 102 מ"מ סידן, ולוודא כי המבנה כולו הוא שקוע. מדגירים את מכסה המנוע תרבית תאים בטמפרטורת החדר למשך 90 דקות.
- בסוף של 90 דקות, להסיר את מבנה התבנית מן כלוריד סידן 102 מ"מאמבטיה ומניח על ערימה של מגבות נייר בשכונת תרבית תאים. הסר את כל הארבעה מהדקים להפריד בין שני החצאים של מבנה העובש. הידרוג נוצר הבארות לא צריך שום בועות וצריך למלא את הבארות לחלוטין.
- בעזרת מרית, בזהירות להתחקות קצה בארות המכיל את הידרוג כדי לשחרר בזהירות טריז את הידרוג. לאחר הסרת הידרוג מן המבנה עובש, ושחרר את הידרוג ישירות לתוך אמבט של בופר פוספט של 1x Dulbecco עם כלוריד סידן מגנזיום כלוריד. מכסה את ג'ל לחלוטין לשטוף פתרון כלוריד סידן העודף עבור 1 - 5 דקות.
- מעביר את הידרוג לתוך פתרון תקשורת צמיחה הבזליים בצלחת רצויה (למשל., 6 צלחות גם) המכסה את הידרוג לחלוטין. דגירה במשך שעה 1 לפחות בחממת תרבית תאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לפני שתמשיך לשלב השכבות.
הערה: הידרוג המכיל תאים יכול להישמרחממת תרבית תאים ללא הגבלה זמן בשלב זה עד שכבות של ג'ל עם אוכלוסיית תא אחרת היא רצויה, ובלבד שינויי תקשורת הושלמו כל 2 - 3 ימים.
3. שכבות של דיסקים אלגינט
- במהלך חצי השעה האחרונה של דגירה 1 hr, לאסוף ולהכין תבניות סטרילית פתרון חישול הג'לים.
- הכן את "עובש החיתוך" על ידי הידוק עובש כי יש חצי בארות של הגובה של "עובש היווצרות הקריש" (6 מ"מ קוטר x 1.5 בארות גבוהות מ"מ בתוך 3 x 3 לוחית אלומיניום) אל endplate (3 x 3 ב לוחית אלומיניום) באמצעות קליפים קלסר על שמאל ובצד ימין.
- הכן את "עובש החישול" על ידי הידוק עובש כי הוא 3 מ"מ גדול יותר בקוטר מאשר "עובש היווצרות הקריש" (9 מ"מ קוטר x 3 מ"מ בארות גבוהות בתוך 3 x 3 לוחית אלומיניום) אל endplate (3 x 3 ב לוחית אלומיניום) באמצעות קליפים קלסר על שמאל ובצד ימין.
- הכן פתרון שלנתרן ציטרט 100 מ"מ / 30 מ"מ EDTA (מימית נתרן ציטרט, מימית מלח tetrasodium חומצה ethylenediaminetetraacetic) במים סטריליים.
- סר ג'לים של אוכלוסיות תאים רצויות (בדוגמא זו, שני דיסקים עם hMSCs) מהתקשורת בצלחת, והמקום לתוך בארות "חיתוך עובש". ג'ל כל צריך להתאים בנוחות לתוך הבארות עם מחצית ג'ל בולטת מעל התבנית.
- באמצעות אזמל, לחתוך את הג'ל על פני השטח של עובש (זה יקצץ הידרוג'ל לשניים). תהפוך את החצי העליון של ג'ל ולמקם אותו לתוך באר עובש פתוח. החצי של הג'ל צריך גם להתאים בנוחות לתוך התבנית היטב, אבל עכשיו הוא ג'לי חצי צריכים להיות בגובה של העובש עם המשטח הפנימי לחתוך גלוי. חזור עם ג'ל שני.
הערה: אזהרה: רק משטחי החתך הפנימיים יהוו דיסקים שכבתיים. שימוש המשטחים החיצוניים תגרום הפרדה חצאים. על פי החשד, מרקם מן הקרום microsieve מועברים על גבי משטח ג'ל למנועהצלחה של תהליך החישול. - מניחים פיסת קרום microsieve תא יבש על גבי בארות, ולוודא כי הממברנה microsieve נמצא בקשר עם כל חצאי ג'ל להיות מרותק ומכסה אותם לגמרי. מניחים נייר פילטר עבה על גבי קרום microsieve, והקפד לכסות את הג'לים לחלוטין.
- פיפטה פתרון של נתרן ציטרט 100 מ"מ / 30 מ"מ EDTA (מימית נתרן ציטרט, מימית מלח tetrasodium חומצה Ethylenediaminetetraacetic) על נייר הסינון עבה עד שהוא רווי. כ 750 μl מספיק במשך ארבע בארות.
- דגירה ג 'לים 1 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להסיר את קרום התא microsieve ונייר מסנן עבה וזורק אותן. הסר את הסרטונים קלסר ופתח את התבנית.
- עבור כל ג'ל annealed, להעביר נתרן ציטרט אחד / חצי שטופלו EDTA של הידרוג'ל אל "עובש חישול" מוכן עם המשטח החתוך כלפי מעלה. זה יהיה מחצית אחת const annealedruct.
- בעזרת מרית, להרים ולמקם וחצי-ג'ל נתרן ציטרט השני / שטופלו EDTA (עשוי להכיל סוג תא אחר) על ג'ל כבר "עובש חישול", מרפרף-ג'ל במחצית השנייה זה כך את פני השטח חתך נמצא במגע עם פני שטח החתך של ג'ל כבר "עובש החישול".
- לחצו בעדינות על שני ג'לים בעזרת מרית כדי להסיר בועות כלשהו בין שני הג'לים. כמו כן, למקם את הג'לים לפי הצורך לוודא כי הם ישירות על גבי זו.
- הרם בעדינות את "עובש חישול" לצלול אותו באמבט כלוריד סידן 102 מ"מ במשך 30 דקות. אין לכסות את הבארות עם endplate.
- לאחר דגירה 30 דקות, להסיר את "עובש חישול" והנח אותו על מגבות נייר. הסר את הסרטונים קלסר ולהפריד את התבנית מן endplate.
- בעזרת מרית, לאסוף את הג'לים annealed ומניחים אותם לתוך בופר פוספט של 1x Dulbecco עם כלוריד סידן מאמבטיה כלוריד agnesium לשטוף את הג'לים. בהמשך לכך, להעביר הידרוג מרותק אל תקשורת תרבית תאים בצלחת רצויה (למשל., 6-גם צלחת) לתרבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מתאר את היווצרות שכבות של הידרוג אלגינט. הושלם דו-שכבתי ג'לים להפגין הפרדה ראשונית מלאה של אוכלוסיות תאים כפי שמוצג באיור 2. כדאיויות תא של אדם בתאי גזע mesenchymal) מוטבעות בתוך הידרוג אלה שכבתיות נותרת גבוהות להשוות את הידרוג בתפזורת כפי שמוצג באיור 3. הכדאיות הוערכה לאחר חישול, חיתוך הג'לים אנכי כדי לגשת למרכז ולאחר מכן מכתים תאי החיים בג'לים annealed עם גשש תא חי, CMFDA (ירוק) לבין התאים המתים (אדום) עם Ethidium homodimer-1 באמצעות הוראות היצרן. Z-ערימות Confocal נלקחו של משטח לחתוך באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כ 100 מיקרומטר לתוך הג'ל. תמונות אלה הוקרנו לתמונת 2D אחד. תאי חיים ומתים היו אז לכמת באמצעות תכונת מנתח החלקיקים בתוכנת ImageJ.
jpg "/>
איור 1:. סכמטי של גיבוש הידרוג'ל Layered א תמונה של העובש המוערם עבור התוספת של אלגינט 2% + תא תערובת עם תיאור של סדר הערימה עבור החצאים העובש התחתונים ועליונים. ב סכמטי המתאר נוהל שכבות של ג'ל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. הפרדת נציג של אוכלוסיות תאי Layered הידרוג'ל שורת תאי דגם 293FT HEK תאים הוכתמו גם עם CMFDA גשש תא חי (ירוק) או CMTPX (אדום). כל אחת מקבוצות תאים אלה היו משובצים 2% (w / v) דיסקים אלגינט, ולאחר מכן חצאי הדיסקים האלה היו בשכבות יחד. חתיכת נחתך מצד CMTPX לזהות אותו במהלך הדמיה. סרגל קנה מידה = 100 & #181;. מ ' אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. כדאיות התא גבוהה תוך הידרוג'ל Layered לאחר Layering שהתהליך יושלם בתאי גזע mesenchymal האדם מוטבע הידרוג בכמויות דו-שכבתית הוכתמו תא חי (ירוק) גשש CMFDA ותאים מתים (אדום) הוכתמו homodimer-1 Ethidium . כדאיות נותרת גבוהה בשתי קבוצות הידרוג'ל לאחר תהליך השכבות. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Figur. ה 4: מגמות שינויים משמעותית, של Layered הידרוג'ל מחזור דחיסת התגובה מחזורית דחיסת הידרוג הודגרו באינקובטור תרבית תאים במשך שבעה ימים ו נתונה ובהמשך ל 0 - 10% דחיסה מחזורית unconfined במשך ארבע שעות 1 רץ. מדגיש שיא (± SEM) לכל מחזור בודד את המגמות לאורך תקופת הטעינה מנותחת. מגמות תחת דחיסה מחזורית unconfined מן 0 - 10% זן עבור שכבתית (n = 9) וחומרי תפזורת (n = 8) ג'לים שונים באופן משמעותי (p = 0.03). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירת תקליטורי הידרוג'ל אלגינט שכבתיים ללימוד שיתוף תרבויות של אוכלוסיות תאים מרובות, כגון אלה ברקמות שכבתיות פיסיולוגי, למשל, סחוס. מבנים שכבתיים, כגון פלטפורמת התרבות המתוארת, יכולים לשמש כדי לבחון את יחסי הגומלין בין שתי אוכלוסיות תאים מובחנות נתונות באותה סביבת התרבות או תחת עומס.
אלגינט הוא פוליסכריד ליניארי anionic כי כבר מצא להיות ביולוגיים שמש בהצלחה למחקר הנדסת ביולוגית סחוס ורקמות 12,14. הידרוג אלגינט נוצר באמצעות קטיונים divalent עבור crosslinking, למשל., יוני סידן. Crosslinks אלה ניתן לבטל על ידי הסרת קטיונים באמצעות chelator, כגון נתרן ציטרט או EDTA, ותהליך זה כבר השתמשו בעבר כדי לבודד chondrocytes כי כבר מתורבת בג'לים 3,4,12. באופן דומה, אותו העיקרוןגם יושם בהצלחה לדבוק גליונות אלגינט ב bilayers או אפילו אשכולות של חרוזים אלגינט ביחד 11,12,15. הפלטפורמה המתוארת כאן מסתמכת על אותו התהליך, אבל משמשת ליצירת הידרוג שכבתית בצורת דיסק קטנה. זהו תהליך דו-שלבי שבו ראשון, דיסקים אלגינט נוצרים באמצעות תבניות שקועות בתוך אמבט עשיר בסידן. אלו מכן פרוס לשניים מטופלים עם פתרון chelating סידן מקומית לשחרר את יוני סידן מן אלגינט crosslinked. על ידי הצבת מטופלים אלה משטחים יחד מחדש טבילת הדיסקים בתמיסה עשירה בסידן, crosslinks הוא רפורמה, מה שהופך מבנים דו-שכבתיים. ג'לים השכבתי הקטן אלה לבטל את צורך אגרופי ביופסיה כדי ליצור וקלות תרבות דגימות תואמות מבחנים וניסויים כגון בדיקות מכאניות, כפי שמוצג באיור 4, ובכך לצמצם בזבוז של תאים יקרים לעתים קרובות כמו גם חומרי ייצור.
כפי שניתן לראותאיור 3, תהליך זה של יצירת שכבות הידרוג הביא כדאיויות גבוהות באופן דומה כמו השליטה או הידרוג'ל בתפזורת המציין כי הליך זה אינו מפרך מדי לאוכלוסיית התא למרות האורך והיעדר חומרים מזינים חידוש. חוסר אזור חופפים ראשוני בתוך הג'ל מאפשר הפרדה פיזית במהלך שיתוף התרבות ראשונית ואת היכולת להתבונן שינויים בממשק כי לאורך זמן. מחקרים הראו כי לאורך תקופות תרבות ארוכות ממשק זה עלול לאבד הגדרה בשל-חדיר צלב הסלולר בתצהיר תאי מטריקס 11. כשהדיסק השכבתי הראשוני אינו מכיל מולקולות דבקות, כפי מופקדים תאי מטריקס, יש גם פוטנציאל חוקר את ההתמזגות של אוכלוסיות תאים ואת ממשק השינוי בין השכבות.
דיסקים דו-שכבתי אלה יכולים לשמש בקלות לגירוי דחיסה דינמית. הצלחנו לאשר thes הידרוג דואר לעמוד דחיסה דינמית ללא הפרדה של שתי המחציות. עם זאת, במהלך תהליך זה, עומס שיא הוצג על ידי הידרוג השכבתי במהלך הדחיסה המחזורית ארבע השעות נמצאו להיות שונה באופן מהותי מן הלא-השכבתית, בתפזורת, הידרוג'ל. תוצאה זו מרמזת העברת זן מורכבת, שאינה ליניארי בין השכבות וחושפות צורך ג'ל שליטת שכבות פיזית, למשל., דו-שכבתי הידרוג'ל עם תא אוכלוסייה / מצב זהה בכל שכבה, פרט חשוב לציין בעת תכנון עיצוב ניסיוני עבור מחקרים שכללו העמסה מכנית. הבנה טובה יותר של ההבדלים שנצפו יכולה להיות מושגת באמצעות מודלים חישוביים של מכניקת מרחבים בתוך ג'ל אלו. לא זו בלבד שניתוח כזה הוא לעזור להבהיר את חלוקת המתח והעביר בין השכבות, אבל זה גם יהיה אינסטרומנטלי לפירוש התנהגות הסלולר ג'ל השכבתית אלה, במיוחד עם שכבות של משתנה תכונות מכאניות.
= "Jove_content"> זוהי מערכת התרבות צדדי, שניתן להשתמש בהם עבור הפרדה פיזית של אוכלוסיות תאים במהלך שיתוף התרבות כמתואר. בנוסף, הוא יכול גם לשמש כמבנה בסיס להמשך פיתוח. שינויים במבנה הקיים יכולים לכלול הגדלת מספר השכבות, לשנות את הגדלים או נוקשות היחסיות של השכבות, ושילוב רכיבים תאים מטריקס נוסף לתוך אחד או יותר של השכבות. עם זאת, הרחבות אלה ידרשו הערכה זהירה. בנוסף לשינויים בחלוקת הכוחות ברחבי הדיסקים, הגדלת הגודל ומספר השכבות יכולות להוביל לירידות כדאי תא במרכז הג'לים וחוסר היציבות פיזית במהלך גירוי מכאני. יתר על כן, תוספות גדולות של תאי מטריקס ומגרתי חלבונים או שינויים אל אלגינט לספק moieties הדבקה עלול להפריע לתהליכי היווצרות חישול ג'ל.
ווה פלטפורמת תרבות זושעות שפותחו עבור יישומי מחקר על חקירת היחסים בין אוכלוסיות תאים שונות בתרבות 3D. לפיכך, הוא מוגבל על ידי חוסר של הרחבה עבור יישומים קליניים. שיטות חלופיות ליצירת הידרוג שכבתית, כגון הדפסת 3D, עשויות בסופו של דבר להיות יותר רלוונטי מבחינה קלינית בשל התקדמות מדרגיות עתידית צפויה, שליטה על מייקרו בפנים הדיסק, ואת ההתאמה אישית של תכונות גיאומטריות macroscale. עבור יישומי מחקר, כפי שהוצג כאן, את הדיסקים אלגינט אינם מספקים moieties הדבקה באופן עצמאי עבור תאים, אשר יכולה להגביל את תחולתו סוגי תאים אחרים. החלופה להשוות אלגינט כאשר בוחנים קלות השימוש היא agarose, הסובלת ממגבלות דומות. יתר על כן, זה מחייב שימוש של אנזימים לשחרר תאים לניתוח במורד הזרם, תוך crosslinks אלגינט להיות יכול להסיר בבטחה באמצעות סוכני chelating סידן. בראש ובראשונה, פלטפורמת תרבות זו תסייע בשיפור understanding של יחסים בין אוכלוסיות תאים הידרוג ואפשרות את ההשפעות של גירוי מכני של שיתוף תרבויות אלה. הבנה זו מכן תודיע בפיתוח שיטות ריפוי רקמות הטרוגנית, במיוחד טעינת רקמות נושאות כגון סחוס במפרק או לדיסקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginic Acid sodium salt | Sigma Aldrich | A1112 | Solution made in wt% using DPBS (-/-) |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-/-) | Gibco Life Technologies | 14190 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (+/+) | Gibco Life Technologies | 14190 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco Life Technologies | 11965 | Example. Use desired medium type |
| Syringe Filters (0.02 μm Nylon) | FisherBrand | 0979C | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Bioreagents | BP510 | Prepare solution in sterile water |
| Criterion Blotter Filter Paper | Biorad | 1704085 | Cut to size of endplates for mold formation |
| Cell Microsieve Membrane (10 μm pore size) | Biodesign Inc of New York | N10R | Cut to size of endplates for mold formation |
| Sodium citrate dihydrate | FisherScience | S93364 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA) | FisherBioreagent | BP121 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Life Technologies | 26140 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| Penicilin/Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco Life Technologies | 15140 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco Life Technologies | 25030081 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| Non-essential Amino Acids (100x) | Gibco Life Technologies | 11140050 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
References
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The Basic Science of Articular Cartilage. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
- Neidlinger-Wilke, C., et al. Mechanical loading of the intervertebral disc: from the macroscopic to the cellular level. Eur. Spine J. 23 (3), 333-343 (2013).
- Klein, T. J., et al. Tissue engineering of stratified articular cartilage from chondrocyte subpopulations. Osteoarth. Cartilage. 11 (8), 595-602 (2003).
- Han, E., et al. Scaffold-free Grafts for Articular Cartilage Defects. Clin. Orthop. Relat. R. 466 (8), 1912-1920 (2008).
- Ng, K. W., Ateshian, G. A., Hung, C. T. Zonal chondrocytes seeded in a layered agarose hydrogel create engineered cartilage with depth-dependent cellular and mechanical inhomogeneity. Tissue Eng. A. 15 (9), 2315-2324 (2009).
- Ng, K. W., et al. A layered agarose approach to fabricate depth-dependent inhomogeneity in chondrocyte-seeded constructs. J. Orthop. Res. 23 (1), 134-141 (2005).
- Nguyen, L. H., Kudva, A. K., Saxena, N. S., Roy, K. Engineering articular cartilage with spatially-varying matrix composition and mechanical properties from a single stem cell population using a multi-layered hydrogel. Biomaterials. 32 (29), 6946-6952 (2011).
- Leone, G., et al. Continuous multilayered composite hydrogel as osteochondral substitute. J. Biomed. Mater. Res. A. 103 (8), 2521-2530 (2015).
- Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels. Sci. Rep. 3, (2013).
- Vigfúsdòttir, ÁT., Pasrija, C., Thakore, P. I., Schmidt, R. B., Hsieh, A. H. Role of Pericellular Matrix in Mesenchymal Stem Cell Deformation during Chondrogenic Differentiation. Cell. Mol. Bioeng. 3 (4), 387-397 (2010).
- Lee, C. S. D., Gleghorn, J. P., Won Choi, N., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. Integration of layered chondrocyte-seeded alginate hydrogel scaffolds. Biomaterials. 28 (19), 2987-2993 (2007).
- Gleghorn, J. P., Lee, C. S. D., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures. J. Biomed. Mater. Res. A. 85 (3), 611-618 (2008).
- Gharravi, A. M., Orazizadeh, M., Ansari-Asl, K., Banoni, S., Izadi, S., Hashemitabar, M. Design and Fabrication of Anatomical Bioreactor Systems Containing Alginate Scaffolds for Cartilage Tissue Engineering. Avicenna J. Med. Biotechnol. 4 (2), 65-74 (2012).
- Xu, J., et al. Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells in Three-Dimensional Alginate Gels. Tissue Eng. A. 14 (5), 667-680 (2008).
- Yeatts, A. B., Gordon, C. N., Fisher, J. P. Formation of an aggregated alginate construct in a tubular perfusion system. Tissue Eng. C, Methods. 17 (12), 1171-1178 (2011).
