Protocol
بروتوكول لابد من تنفيذها بما يتفق تماما مع التشريعات الوطنية والدولية واللوائح المحلية. وقد تم الحصول على الدم من المتبرعين الأصحاء التي أعطت موافقتها على التبرع بالدم لأغراض البحث من مراكز نقل الدم التي وقعت المؤسسات الاتفاق. يجب أن تؤخذ حماية خاصة عند استخدام الدم البشري. تجارب مع HIV-1 يجب ان تتم في مستوى السلامة الحيوية 3 أو 2 (BSL-3 أو 2) مختبر وفقا للتشريعات المحلية.
1. إعداد الضامة الوحيدات المستمدة-الإنسان (hMDMs) من خلال التدرج الكثافة الطرد المركزي واختيار من التصاق
- تبدأ مع دماء جديدة من المتبرعين الأصحاء (9 مل). تمييع كامل حجم دماء جديدة مع 1X العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) دون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ للحصول على الحجم النهائي من 70 مل وإضافة بلطف الدم المخفف إلى قسمين أنابيب مخروطية 50 مل (35 مل لكل أنبوب) ، وعلى رأس 15 مل منeutral، تشعبت للغاية، عالية الشامل، السكاريد ماء في حل بالفعل في كل أنبوب.
- أجهزة الطرد المركزي كل من أنابيب الدم في 537 x ج لمدة 20 دقيقة عند 20 درجة مئوية دون فرامل. ثم جمع الخلايا وحيدة النواة الدموية المحيطية (PBMCs) الواردة في عصابة خلية غائم في واجهة ونقلها إلى أنبوب 50 مل جديدة تحتوي على 15 مل من برنامج تلفزيوني 1X دون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+.
- الطرد المركزي الخلايا في 218 x ج لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية و resuspend بيليه في 45 مل من برنامج تلفزيوني 1X دون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+.
- الطرد المركزي الخلايا في 218 x ج لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية، Resuspend وبيليه في 10 مل من برنامج تلفزيوني 1X دون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+، والاعتماد على الخلايا عن طريق تمييع لتخفيف النهائي من 1/200 في التريبان الأزرق.
- الطرد المركزي الخلايا في 218 x ج لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية و resuspend بيليه في RPMI (روزويل معهد الحديقة التذكارية) 1640 المتوسطة تستكمل مع 2 مم L-الجلوتامين و 100 ميكروغرام / مل penicillin-الستربتومايسين لديك 7 × 10 6 PBMCs لكل بئر في 2 مل من المتوسط في كل بئر من بئر لوحة 6.
- احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 2 ساعة. بعد 2 ساعة وانضمت حيدات إلى البلاستيك.
- للسماح حيدات المعزولة حديثا لتفرق في hMDMs، نضح المتوسطة واستبدالها مع 2 مل hMDM المتوسطة (RPMI 1640، 10٪ decomplemented الجنين العجل المصل (FCS)، 2 مم L-الجلوتامين و 1٪ البنسلين ستربتومايسين) تستكمل مع المؤتلف الإنسان بلعم مستعمرة عامل تحفيز (RHM-CSF) بتركيز نهائي من 10 نانوغرام / مل.
- احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 11 يوما (الشكل 1).
- في يوم 11 إزالة المتوسطة وغسل 2 مرات مع 2 مل من المتوسط hMDM البارد لكل بئر. التالي غسل كل بئر 2 مرات مع 1 مل من البرد برنامج تلفزيوني 1X.
- لفصل hMDMs متباينة تماما، وغسل كل مرة بشكل جيد 1 مع 1 مل من البرد برنامج تلفزيوني 1X مع 2 مم حمض ethylenediaminetetraacetatic (EDTA) واحتضان الخلايا في 2 مل من البرد برنامج تلفزيوني 1X مع 2 مم EDTA لكل بئر ل15-60 دقيقة على 4 درجات مئوية.
ملاحظة: طرق بديلة لفصل الخلايا موجودة (على سبيل المثال، التربسين أو الأنشطة مثل التربسين) التي قد تعطي نتائج جيدة 11. - بعد انفصال (أنجزت من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا في البئر)، وجمع الخلايا ووضعها في أنبوب 50 مل على الجليد التي تحتوي على 10 مل من المتوسط hMDM البارد.
- الطرد المركزي الخلايا في 218 x ج لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية، Resuspend وبيليه في 10 مل من المتوسط hMDM البارد، والاعتماد على الخلايا عن طريق تمييع 1/20 في التريبان الأزرق.
- البذور الخلايا في 1 × 10 6 hMDMs في 35 مم المجهر الصف الزجاج طبق أسفل واحتضان لوحات عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 1 يوم.
2. الإنتاج النوعي والكمي لفيروس نقص المناعة البشرية-1 أسهم الفيروسية
ملاحظة: NLR4.3 HIV-1 الكمامة-iGFP (الأخضر بروتين فلوري) يحمل مظروفا R5-الاستوائية، هدية من السيد Schindlيستخدم إيه 10 إلى إصابة الضامة ورؤية الخلايا المصابة في الوقت الحقيقي.
- إنتاج مخزونات الفيروسية التي ترنسفكأيشن من الخلايا الجنينية البشرية 293T الكلى (2 × 10 6 في 100 طبق مم) مع 6 ميكروغرام من الحمض النووي proviral المقابلة باستخدام كاشف ترنسفكأيشن التجاري.
- قياس العدوى من مخزونات فيروس باستخدام خلايا مؤشر هيلا تزم-BL (تحمل الجين ß غالاكتوزيداز تحت سيطرة HIV-1 LTR) باستخدام التخفيفات المسلسل من الأسهم الفيروسية تليها تلوين ß غالاكتوزيداز من الخلايا والعد خلايا الزرقاء 12.
3. العدوى من hMDMs مع HIV-1
- إضافة الفيروس في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) 0،02-0،03 في 1 مل من hMDM المتوسطة إلى hMDMs (خلايا مطلي في 1.13). للسيطرة على آبار إضافة 1 فقط مل من hMDM المتوسطة واحتضان الأطباق عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 ل 2 أيام (الشكل 1).
- في يوم 2 غسل الخلايا مع hMDM ميدالبوتاسيوم 3 مرات وإضافة 1 مل من المتوسط hMDM جديدة لكل طبق. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 6 أيام (الشكل 1).
4. طهاية الأغنام خلايا الدم الحمراء
- لإعداد 7 × 10 6 SRBCs في طبق، وغسل SRBCs مرتين في 100 ميكرولتر من محلول يحتوي على 0.1٪ الأبقار مصل الزلال (BSA) في برنامج تلفزيوني 1X مع الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 4 دقائق.
- Resuspend وSRBCs غسلها في 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X / BSA 0.1٪ مع أرنب مفتش مكافحة SRBCs بتركيز-التصاق الفرعية في 5 ميكرولتر من SRBCs واحتضان مع التناوب في RT لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: لتحديد تركيز-التصاق الفرعية معاداة SRBCs مفتش، وإعداد التخفيفات المسلسل من مفتش (تركيز الأسهم بنسبة 13.1 ملغ / مل) من 1/50 إلى 1/25600 في 20 ميكرولتر في لوحة 96-جيدا. إضافة 2 × 10 6 SRBCs في 20 ميكرولتر في كل بئر ووضع لوحة في غرفة مظلمة خلال عدة ساعة. تركيز دون التصاق هوالتخفيف من البئر قبل البئر مع تراص (مفتش + SRBCs تشكيل شبكة). - بعد دوران، الطرد المركزي، SRBCs opsonized مفتش-في 600 x ج لمدة 4 دقائق ويغسل مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X / BSA 0.1٪ مع الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 4 دقائق.
- Resuspend و-SRBCs opsonized مفتش في متوسطة الفينول الحمراء الخالية RPMI استعد قبل أن تستكمل مع 2 مم L-الجلوتامين و 1٪ البنسلين ستربتومايسين (1 مل / طبق).
5. الخلية الحية فيديو المجهر البلعمة الفحص
- استخدام نظام التصوير متحد البؤر مثل نظام القرص الغزل مجهزة غرفة التدفئة عند 37 درجة مئوية مع CO 2 يمر زجاجة مع الماء لترطيب.
- بدوره على غرفة التدفئة قبل التجربة لمرحلة المجهر عند 37 درجة مئوية قبل بداية الفحص البلعمة. بدوره على المجهر والكمبيوتر، وتحميل برامج التصوير.
- تحسين إعدادات التصوير مثل سرعة المسح الضوئي، وتعظمأيون، والقرار، وما إلى ذلك ليكون خلية واحدة على الأقل لكل حقل وصورة إطار واحد كل دقيقة ما بين 60 إلى 120 دقيقة.
ملاحظة: هنا، هو تصوير العينة إطار واحد كل دقيقة خلال 60 دقيقة مع 63X عدسة. - ضع صحن التصوير على المسرح المجهر. ضبط التركيز والموقع إلى العثور على واحد فقط كله HIV-1 بلعم المصابين في هذا المجال. استخدام إعدادات الإثارة / الانبعاثات المناسبة بناء على نظام التصوير المستخدمة والتحقيق. تشمل قناة مشرق الميدان (BF) لمراقبة جسم بلعمي (الشكل 1ii). تحسين مظهر الصور قناة مختلفة عن طريق ضبط نسبة تنتقل وقت الضوء والتعرض.
ملاحظة: وهنا، كان NLR4.3 HIV-1 الكمامة-iGFP متحمس باستخدام الليزر 491 نانومتر مع 50 ميللي ثانية من التعرض لفترة مع 20٪ من الليزر (الشكل 1I). - إزالة الطبق التصوير وإضافة 1 مل من تعليق SRBC في 7 × 10 6 SRBCs / مل إلى الطبق (الشكل 1).
- أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج ل2 دقيقة في RT لمزامنة البلعمة، وتسجيل الوقت في نهاية هذا الطرد المركزي وعودة الطبق إلى المرحلة.
- تحسين التركيز والتقاط GFP والصور BF في Z-مداخن (طوال سمك الخلية مع خطوة مسافة 0.3 ميكرون - عادة 20 طائرة) كل دقيقة على الأقل 1 ساعة. حفظ الفيديو في الوقت الفاصل بين الأصلي الملفات شكل نظام التصوير المستخدمة.
ملاحظة: هنا، وحفظ الوقت الفاصل بين الأفلام في تنسيق أصلي، * ملفات .stk.
6. تحليل أفلام الوقت الفاصل
- لتحرير الفيديو، انقر على القائمة المنسدلة "تطبيقات" وعلى علامة التبويب "مراجعة متعدد الأبعاد بيانات" في برامج تحرير الفيديو.
- لفتح الملف، اضغط على "ملف قاعدة الاختيار" ثم على "تحديد دليل". في "مجموعات البيانات"، حدد الحصول على تحليل (في شكل .nd) وانقر على "إرسال". يتم تمثيل البيانات في الجدول مع الوقت في عمودد Z-الخطة في الخط.
- لتمثيل العدوى في Z-الإسقاط (الشكل 2، لوحات اليسار)، وحدد 491 نانومتر الطول الموجي في خانة "موجات" وانقر على "Z إسقاط" علامة التبويب مع "كل الطائرات".
- لتحليل التسلسل الزمني، حدد BF الطول الموجي في خانة "موجات" واختيار الطائرة المثلى على المحور Z لتمييز SRBCs الخارجية (الشكل 2، رأس السهم الأحمر)، SRBCs الداخلية (الشكل 2، دائرة حمراء) والنواة ( الرقم 2، الدائرة الزرقاء).
- لحفظ مونتاج الفيديو، اضغط على "اختيار [إكس]" علامة التبويب، ثم على "تحميل صورة (الصورة)". وأخيرا، حفظ الصور المحملة في. TIF شكل وفتحها المقبل على برنامج ImageJ.
- استخدام البرنامج المساعد "تتبع يدوي" على برنامج ImageJ لقياس موقف نواة وجسم بلعمي المختلفة التي لوحظت في قناة BF (الشكل 3).
- داوnload "دليل تتبع" المساعد على موقع يماغيج. على يماغيج، فتح البرنامج المساعد وتسلسل الصور ليتم تحليلها (الشكل 3، الخطوة 1 و 2).
- إدخال الضبط مثل "الفاصل الزمني" الذي يمثل مقدار الوقت بين الإطارات المجاورة، و "س / ص المعايرة" التي تمثل المسافة لكل بكسل (الشكل 3، الخطوة 3).
ملاحظة: هنا، حفظ تسلسل الصور مع فاصل زمني من 1 دقيقة بين كل إطار وس / ص معايرة 0.205 ميكرون لأنه يتم استخدام التكبير 63X وكاميرا مع حجم بكسل 6.45 س 6.45 ميكرون 2. - لبدء تتبع، انقر على "أضف المسار" (الشكل 3، الخطوة 4) وانقر على مركز SRBC في المرة الأولى عندما المنضوية ذلك. يظهر الإطار التالي تلقائيا.
- مواصلة الضغط على مركز SRBC في جميع الأطر لديهما مواقف مختلفة خلال الفترة (الشكل 3، الخطوة 6 في مربع أحمر).
- البدء في تتبع نواة لمكانتها في جميع الأطر من خلال النقر على وسطها. التالي تتبع جسم بلعمي (بالنقر على مركزها) واحدا تلو الآخر في ذلك الوقت (الإطار) من استيعاب، ومختلف في وظيفة SRBCs. لراحة لرؤية SRBC على قناة BF، استخدام إطار "السطوع والتباين" خلال تتبع (الشكل 3، الخطوة 5).
- بين كل تتبع SRBC، انقر على "أضف المسار" (الشكل 3، الخطوة 4) أن يكون مسار جديد. سيتم تغيير عدد تتبع في العمود الثاني، "المسار رقم" من جدول النتائج (الشكل 3، الخطوة 6).
- حفظ البيانات في جداول للمتابعة إلى الخطوة التالية من التحليل.
- استخدام برنامج جداول البيانات لحساب المسافة المقطوعة من جسم بلعمي تحتوي على SRBCs نحو النواة وسرعة للجسم بلعمي خلال دقائق 5 الأولى بعد استيعاب SRBCs (فايجوري 4).
- فتح جدول البيانات وملف جدول جديد. نقل إلى هذا الملف الجديد المعلمات التالية فقط، والوقت، وX- وY- تنسيق النواة وجميع SRBCs الشكل (4A).
- لحساب المسافة بين SRBCs والنواة مع الإحداثيات الخاصة بها فقط، والنظر في نواة وSRBC في-XY تنسيق الطائرة (الشكل 4B).
ملاحظة: المسافة بين نقطتين هو طول المسار الذي يربط بينها. في الطائرة، ونظرا للمسافة بين SRBC والنواة التي كتبها نظرية فيثاغورس.- إذا ج (المسافة بين النواة وSRBC) يدل على طول الوتر وأ و ب للدلالة على أطوال الجانبين الآخرين، والتعبير عن نظرية فيثاغورس 'كما معادلة فيثاغورس:
ملاحظة: في الوقت نفسه، على المتعامدة المعيرة، والمسافة الأفقيةوهو (خ نواة -x SRBC) والمسافة ب الرأسية (ذ نواة -y SRBC). - وهكذا، وحساب المسافة بين النواة وSRBC (الشكل 4A، مربع الأرجواني) من خلال:
ملاحظة: مضاعفة قيمة المسافة التي تم الحصول عليها (بالبكسل) من س / ص المعايرة لديك المسافة في ميكرون. هنا، معايرة س / ص هو 0.205 ميكرون. - في كل مرة، طرح المسافة بين النواة وSRBC لبعد المسافة الأولى (الشكل 4C).
- رسم قياس ضد الساعة لمدة 5 دقائق الأولى. تطبيق خط الاتجاه الخطي (الشكل 5A) في المؤامرة وتحديد المنحدر من خط الاتجاه الخطي الذي يمثل سرعة يبلوع نحو النواة خلال دقائق 5 الأولى بعد استيعاب SRBC.
- جمع البيانات لحساب الخطأ العادي والإحصائي للقيم السرعة ومؤامرة لهم في شكل ملائم باستخدام البرنامج المناسب (الشكل 5B).
- إذا ج (المسافة بين النواة وSRBC) يدل على طول الوتر وأ و ب للدلالة على أطوال الجانبين الآخرين، والتعبير عن نظرية فيثاغورس 'كما معادلة فيثاغورس:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FCR بوساطة البلعمة من قبل hMDMs المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية (1) وغير المصابين يوصف هنا باستخدام SRBCs opsonized مفتش-كأهداف نموذج (الشكل 1). الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول هي إعداد hMDMs والإصابة بفيروس HIV-1. والواقع أن المحصول وجودة الضامة متباينة تتراوح بين الجهات المانحة، وكذلك معدل الإصابة مع الكفاءة في حدود 10-40٪. وبالإضافة إلى ذلك، وإعداد مفتش-opsonized-SRBCs مهم أيضا لتجنب إتلاف خلايا الدم الحمراء، لأن هذا يمكن أن تؤدي إلى الاعتراف بها وامتصاص كما الحطام بدلا من البلعمة بوساطة FCR. سوف طهاية الأمثل ضمان البلعمة فعالة.
ويتم تحليل حركة يبلوع في العيش الضامة المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية في الوقت الحقيقي مع قناة BF على المجهر متحد البؤر القرص الغزل في المختبر BSL-3. إعدادات قناة BF ور الحاسمo شاهد النواة (الشكل 2، الدائرة الزرقاء) وللتمييز والخارجي (الشكل 2، السهام الحمراء) من SRBCs المنضوية (الشكل 2، الدوائر الحمراء). يعتبر الفحص المجهري BF كما أبسط المجهر الضوئي إضاءة تقنية كافية لرؤية جسم بلعمي، والتي هي أقل انكساري من SRBCs الخارجية.
الخطوة الأولى بعد الحصول على تسلسل الصور هي تتبع اليدوي على برنامج ImageJ (الشكل 3). هذه النقطة يمكن أن تكون طويلة ومملة بشكل خاص، لأنه من الأفضل أن تتبع كل يبلوع، واحدا تلو الآخر لجميع متواليات الصورة، ويعتبر أن التجارب يجب أن تتكرر مع لا يقل عن 3 المانحين في حالة التوصل الى ما يكفي من حجم العينة كبير ل التحليل الإحصائي (لا يقل عن 30 جسم بلعمي مع 3 جهات مانحة مختلفة).
الخطوة الثانية هي تحليل في برنامج جداول البيانات لحساب سرعة يبلوع خلال دقائق 5 الأولى بعد استيعاب لكل SRBCs المنضوية (الشكل 4). لهذا، فإننا رسم لكل يبلوع سافر المسافة خلال دقائق 5 الأولى ضد الساعة. ويرد مثال تمثيلي في hMDMs غير المصابين على الشكل 5A. التالي نحصل على سرعة من يبلوع، وهو المنحدر من منحنى الانحدار الخطي. تم العثور على سرعة 0.5384 ميكرون / دقيقة لهذا يبلوع.
وتجدر الإشارة، فمن الممكن لتحليل سرعة يبلوع خلال الدقائق الأولى القليلة بعد استيعاب، كما هو موضح هنا أو في دوما وآخرون. 8، أو في وقت لاحق عن طريق تحليل سرعة على امتداد فترات زمنية أطول. في دراستنا، لاحظنا أن سرعة يبلوع خلال دقائق 5 الأولى بعد تدخيل في hMDMs المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية هو أقل مقارنة hMDMs غير المصابة (الشكل 5B).
معشوقة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> 
الشكل 1. إعداد السيطرة وhMDMs المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية للتصوير البلعمة. وتنقيته وحيدات من التصاق (1) ومتباينة في الضامة لمدة 11 يوما مع M-CSF (2). بعد ذلك، يصاب hMDMs مع NLR4.3 بفيروس نقص المناعة البشرية 1Gag-iGFP ط) في وزارة الداخلية بين 0.02 و 0.03 لمدة 8 أيام مع الغسيل في يوم 2 (3). (4) تضاف SRBCs opsonized مفتش-على hMDMs لالبلعمة خلال 1 ساعة. في جسم بلعمي تحتوي على SRBCs قابلة للكشف على الصور BF (دائرة حمراء، والثاني). الصور هي من قاعدة بيانات الصور سرفييه. بار = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم اكتساب 2. في الوقت الحقيقي أثناءيتم إعداد البلعمة عن طريق التحكم التمثيلية وhMDMs المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية. hMDMs والمصابين كما هو موضح في الشكل 1. يتم الكشف عن الخلايا NLR4.3 بفيروس نقص المناعة البشرية 1Gag-iGFP المصابين الليزر 491 نانومتر. يتم الحصول على Z-رزمة من الصور مبائر القرص الغزل وتحليلها باستخدام كل من برنامج الحصول على المجهر ويماغيج (لوحات اليسرى). معرض الصور BF تمثل (لوحات أعلى الموافق الفيلم 1) غير المصابة وNLR4.3 بفيروس نقص المناعة البشرية 1Gag-iGFP المصابة (لوحات أسفل الموافق فيلم 2) خلية خلال اقتناء 45 دقيقة (46 صور مع الوقت المشار إليها كما ح ح : مم). غشاء الخلية (الخط المتقطع الأسود)، النواة (الدائرة الزرقاء)، وSRBCs الخارجية (المشار إليها بعضهم مع السهام الحمراء) وSRBCs الداخلية (المشار إليها بعضهم مع الدوائر الحمراء) قابلة للكشف على الصور BF. بار = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الخطوات تعليمات للتحليل الصور مع البرنامج المساعد تتبع دليل على يماغيج. بعد فتح "دليل تتبع" المساعد (1) وتحميل الفيديو في الوقت الفاصل بين قناة BF (2)، أدخل المعلمات من اكتساب (3). انقر على "أضف المسار" (4) والبدء في قياس تتبع من خلال النقر على يبلوع واحد (5) للحصول على نافذة جديدة مع مواقف X و Y من يبلوع المختار (6، مربع أحمر). لمتابعة يبلوع على التسلسل الزمني للراحة، وتختلف السطوع والتباين (5 '). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. خطوات التدريس لتحليل البيانات من يبلوع سرعة الهجرة في برنامج جداول البيانات (أ) تجميع X و Y الموقف من نواة وكل يبلوع (المربع الأحمر) في جدول البيانات. في عمود آخر (مربع الأرجواني)، وحساب المسافة بين يبلوع والنواة مع نظرية فيثاغورس "حيث تمثل ج طول بين النواة وSRBC ووب أطوال الجانبين غيرها من مثلث قائم الزاوية ( B). (C) وأخيرا، وحساب المسافة التي يقطعها جسم بلعمي في كل مرة (المربع الأخضر) عن طريق طرح المسافة بين SRBC والنواة في وقت معين من المسافة الأولية في وقت 0. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
p_upload / 54568 / 54568fig5.jpg "/>
الشكل 5. الكمي ليبلوع سرعة الهجرة في السيطرة وhMDMs المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية. (A) لكل SRBC وبعد استيعاب SRBC، يتم قياس المسافة المقطوعة نحو النواة وتآمر ضد الساعة. يتم احتساب سرعته خلال 5 دقائق الأولى باستخدام الانحدار الخطي في برنامج جداول البيانات. ويرد تجربة تمثيلية (من SRBC الداخلي من الشكل 3-4). (ب) يتم قياس جميع السرعات خلال 5 دقائق الأولى ل66 جسم بلعمي في غير المصابة (5 المانحين) و 60 جسم بلعمي في الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية (4 المانحين). تمثل البيانات يعني ± SEM (أونبايريد الطلاب ر اختبار مع التصحيح ولش، **، ف <0،01). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
العمر = "1"> 
فيلم 1: حركة يبلوع في بلعم تمثيل غير مصاب. . (انقر بالزر الأيمن للتحميل) تم الكشف عن حركة خلايا الدم الحمراء opsonized في قناة BF خلال 45 دقيقة من البلعمة مع صورة واحدة في الدقيقة (46 صور مع الوقت المشار إليها كما ح ح: مم). بار = 10 ميكرون.
فيلم 2: حركة يبلوع في البلاعم المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية ممثل. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل). HIV-1 (NLR4.3 HIV-1 الكمامة iGFP) تم تحديد الضامة بعد الإضاءة مع الليزر 491 -infected. تم الكشف عن حركة خلايا الدم الحمراء opsonized في قناة BF خلال 45دقيقة من البلعمة مع صورة واحدة في الدقيقة (46 صور مع الوقت المشار إليها كما ح ح: مم). بار = 10 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذه التقنية لديها العديد من الخطوات الحاسمة. أولا، إعداد hMDMs والعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية-1 هو في غاية الأهمية لأن نسبة الإصابة هي من المانحين التابع. وتجدر الإشارة، قررنا استخدام الضامة التي لم يتم الاستقطاب في المختبر قبل الإصابة، لأن الوضع الضامة يحتمل أن تكون من الفيروس في الجسم الحي واجه لم يتم توصيفه جيدا حتى الآن. نحن فحصنا التعبير العديد من علامات السطحية، مشيرا إلى أن الضامة ليست M1 M2 ولا، والتحقق من التعبير عن CD4 وCCR5. معدلات الإصابة متفاوتة وتتراوح 10-40٪، وأقل في بعض الأحيان. هذا معدل الإصابة المتغير هو السبب في أنه يمكن أن يكون من الصعب العثور على HIV-1 hMDM الفلورسنت المصابين تحت المجهر. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن الوقت اللازم للعثور على الخلايا المصابة HIV-1 مباشرة بعد الخطوة الطرد المركزي يؤدي أيضا إلى تأخير في بدء عملية الاستحواذ. يمكن البدء البلعمة دون synchronizatioن الملزمة وامتصاص الناتجة عن الطرد المركزي. ومع ذلك، لم يتم تحديد هذا الخيار لSRBCs التي تطفو قبل الوصول إلى الخلايا. يمكن أن يكون خيارا جيدا مع الخرز. لتقليل الوقت اللازم للعثور على الخلايا المصابة، ويمكن استخدام أطباق أسفل الزجاج الشبكية لتحديد HIV-1 hMDMs المصابة قبل الشروع في بدء فحص البلعمة. وبعد ذلك الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية المختارة التي لديها عدد "معقول" من SRBCs حولهم يتم اختيار بسرعة للبدء في عمليات الاستحواذ. "كمية SRBC معقول" يعني يكفي أن يكون لا يقل عن 10 SRBCs لكل خلية وليس الكثير لمنع SRBCs الخارجية من اخفاء جسم بلعمي.
وبالإضافة إلى ذلك، فمن المهم لتحسين الظروف طهاية لضمان أن يكون هناك اعتراف بكفاءة وامتصاص الخلايا. البلعمة بوساطة FCR-هي التأسيسية وhMDMs بصورة روتينية فعالة جدا في امتصاص بوساطة FCR. وبالإضافة إلى ذلك، لالبلعمة الصحيحة، لديها شروط لبالبريد الأمثل مع غرفة التدفئة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. فمن الضروري للتحقق من الغاز ودرجة الحرارة قبل البدء في فحص البلعمة.
وأخيرا التمييز ضد SRBCs الخارجية من جسم بلعمي الداخلي وتحديد نواة في قناة BF مهمة للتحليل على برنامج ImageJ. هذا هو السبب في أن إعدادات هذه القناة مهمة. وبالنظر إلى أن التركيز يمكن أن تضيع خلال الاستحواذ، ونحن نوصي للحصول على رزمة من الصور في محور Z للتأكد من أن الطائرة المثلى لتحليل سرعة يبلوع. فمن الأفضل أن يكون خلية واحدة في حقل واحد لتحليل جميع SRBCs المنضوية لكل خلية. هذا هو السبب في اختيار عدسة مهم وهنا استخدمنا 2 العدسات بوصفها وظيفة من حجم الخلية. كان من الأسهل بالنسبة لنا لتتبع جسم بلعمي مع عدسة 100X، ولكن في بعض الأحيان خلايا كبيرة جدا لذلك كان علينا أن التحول إلى عدسة 63X. اختيار العدسة أمر بالغ الأهمية أيضا عند التفكير ايمالتحليل الزمني باستخدام يماغيج والجدول جدول لأن كلا العدسات توريط مختلفة س / المعايرة ذ.
الحد الأول من هذه التقنية هو عدد العينات التي تحتاج إلى الحصول عليها للحصول على نتائج ذات دلالة إحصائية. بإمكاننا تسجيل العديد من الأفلام في المانحة ولكن عادة ما لا يزيد عن 2 خلايا لكل حالة، لكل طبق. الحلول لهذا القيد لزيادة عدد العينات لتكرار التجارب مع المزيد من الجهات المانحة أو للقيام متعددة نقطة XY التصوير اعتمادا على المجهر. الإزعاج الأسلوب الأخير هو احتمال فقدان التركيز خلال الآلية المسح XYZ. الحد الآخر هو أن القياس الكمي اليدوي للسرعة طويلة ومملة مقارنة لتحليل الآلي. للتحليل الآلي الكامل، فمن الضروري استخدام جزيئات fluorescently المسمى، كما ورد في دراسات رائدة 4 مع حبات اللاتكس بالإضافة إلى الجيلاتين جلد السمك التي تم اتباعها مع خوارزمية التتبع في برنامج ماتلاب. fluorescently المسمى opsonizing الأجسام المضادة أو حبات يمكن أن تكون بديلا، لكنها تخضع لتبيض، والتي هي مشكلة عند تسجيل البلعمة لمدة 1 ساعة. وأشارت دراسات أخرى استخدام الخرز لاتكس 13،14. لاحظنا إلا أن استيعاب حبات اللاتكس تم الكشف بسهولة أقل من امتصاص SRBCs. والواقع أن نقطة الانطلاق لحركية الهجرة داخل الخلايا المهم أن نعرف لكشف العيوب في وقت مبكر في حركة phagosomal.
والميزة الرئيسية لطريقة وصفها هنا هو بساطته واستخدام البرمجيات الحرة. لإجراء التتبع اليدوي باستخدام برنامج ImageJ، لدينا لاستخدام موقف يبلوع والنواة، وبالتالي، نحن بحاجة إلى استخدام نظرية فيثاغورس "لحساب المسافة بين يبلوع والنواة، والحصول على سرعة بعد الانحدار الخطي في برنامج جداول البيانات. يمكن تخفيض هذا التحليل 3 خطوات لخطوة واحدة، والتتبع، على برامج الجليدية مع & #34؛ دليل تتبع "المساعد وإخراج البيانات ثم يتم مباشرة سرعة الجسيم لمتابعة، وعلى الأخص السرعة النسبية بين 2 مجموعات (مثل جسم بلعمي والنواة) وأخيرا، وحساب يسمح لنا لقياس السرعة النسبية لل. الجسيمات واحد بالمقارنة مع الجسيمات الأخرى التي يمكن أيضا أن تتحرك.
إمكانية تطبيق هذا التحليل الوقت الفاصل بين العيش المستقبل يمكن أن يكون للجسيمات واضحة في هذا المجال مشرق، مثل البكتيريا والفطريات، أو الحطام الخلية. العلاجات المختلفة أو الظروف العدوى الكافية لتعديل نضوج phagosomal وخصائص تفعيل الضامة ستستفيد من مثل هذا التحليل المكرر من حركة phagosomal نحو مركز الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | For viral production |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | For acquisition |
| Falcon Tissue Culture Plates 6-well | Thermo Fischer Scientific | Corning. Inc. 353934 | For human monocyte-derived macrophages |
| Ficoll-Plaque PLUS | Dominique Dutscher | 17-1440-03 | a neutral, highly branched, high-mass, hydrophilic polysaccharide in solution for density centrifugation |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | RT |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x, liquid (High Glucose) | GIBCO, Molecular probes | 31966-021 | Conserved at 4 °C ; for HEK cells culture |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | Conserved at 4 °C; for hMDMs culture |
| Fœtal Calf Serum (FCS) | Eurobio | CVFSVF0001 | Conserved at -20 °C ; decomplemented |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fischer Scientific | 15140-122 | Conserved at -20 °C ; for hMDMs culture |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10x 500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37 °C water bath before use ; for phagocytosis assay |
| FuGENE6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Conserved at 4 °C ; for viral production |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4 °C before use |
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | Conserved at 4 °C |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | Conserved at -20 °C |
| Inverted microscope DMI600 | Leica | ||
| Confocal Spinning Disk Unit CSU-X1M1 | Yokogawa | ||
| 491 nm 50 mW laser | COBOLT CALYPSO | ||
| HCX PL APO CS Objectif | Leica | Objective lens ; Magnification 100X ; Numerical aperture 1.40 ; Immersion oil | |
| CoolSnap HQ2 (FireWire) Camera | Photometrics | Pixel size 6.45 µm x 6.45 µm ; Definition 1,392 x 1,040 ; Encoding the image in 14 Bit | |
| Metamorph 7.7.5 software | Molecular Devices | For the control of the microscope | |
| GraphPad Prism software | For the statistics analysis |
References
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Niedergang, F. Encyclopedia of Cell Biology. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).
- Blocker, A., Griffiths, G., Olivo, J. C., Hyman, A. A., Severin, F. F. A role for microtubule dynamics in phagosome movement. J Cell Sci. 111 (Pt 3), 303-312 (1998).
- Blocker, A., et al. Molecular requirements for bi-directional movement of phagosomes along microtubules. J Cell Biol. 137, 113-129 (1997).
- Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).
- Feasey, N. A., Dougan, G., Kingsley, R. A., Heyderman, R. S., Gordon, M. A. Invasive non-typhoidal salmonella disease: an emerging and neglected tropical disease in Africa. Lancet. 379, 2489-2499 (2012).
- Mazzolini, J., et al. Inhibition of phagocytosis in HIV-1-infected macrophages relies on Nef-dependent alteration of focal delivery of recycling compartments. Blood. 115, 4226-4236 (2010).
- Dumas, A., et al. The HIV-1 protein Vpr impairs phagosome maturation by controlling microtubule-dependent trafficking. J Cell Biol. 211, 359-372 (2015).
- Greenberg, S., el Khoury, J., Kaplan, E., Silverstein, S. C. A fluorescence technique to distinguish attached from ingested erythrocytes and zymosan particles in phagocytosing macrophages. J. Immunol. Methods. 139, 115-122 (1991).
- Koppensteiner, H., Banning, C., Schneider, C., Hohenberg, H., Schindler, M. Macrophage internal HIV-1 is protected from neutralizing antibodies. J Virol. 86, 2826-2836 (2012).
- Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. 1087, 207-220 (2014).
- Wei, X., et al. Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20) monotherapy. Antimicrob Agents Chemother. 46, 1896-1905 (2002).
- Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP. Mol Cell Biol. 23, 6494-6506 (2003).
- Toyohara, A., Inaba, K. Transport of phagosomes in mouse peritoneal macrophages. J Cell Sci. 94 (Pt 1), 143-153 (1989).
