Protocol
Protokollet måste genomföras i strikt enlighet med nationella och internationella lagar och lokala föreskrifter. Blod från friska donatorer som gav sitt samtycke till att donera blod för forskningsändamål har erhållits från blodtransfusion Centers som institutionerna har undertecknat avtalet. Särskilda skydd måste iakttas vid användning av humanblod. Experiment med HIV-1 måste utföras i en skyddsnivå 3 eller 2 (BSL-3 eller 2) laboratorium enligt lokal lagstiftning.
1. Framställning av humant monocyt-härledda makrofager (hMDMs) genom densitetsgradientcentrifugering och Välj efter Vidhäftning
- Börja med färskt blod från friska donatorer (9 ml). Späd hela volymen av färskt blod med sterilt 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) utan Ca2 + och Mg2 + för att erhålla en slutlig volym av 70 ml och försiktigt lägga det utspädda blodet i två 50 ml koniska rör (35 ml per rör) , på toppen av 15 ml av eneutral, i hög grad grenade, hög massa, hydrofil polysackarid i lösning redan i varje rör.
- Centrifugera båda rören av blod vid 537 xg under 20 min vid 20 ° C utan broms. Samla sedan de perifera mononukleära blodceller (PBMC) som ingår i det grumliga cellringen vid gränsytan och överföra dem till en ny 50 ml rör innehållande 15 ml 1 x PBS utan Ca 2 + och Mg 2 +.
- Centrifugera cellerna vid 218 xg under 5 min vid 20 ° C och återsuspendera pelleten i 45 ml 1 x PBS utan Ca2 + och Mg2 +.
- Centrifugera cellerna vid 218 xg under 5 min vid 20 ° C, återsuspendera pelleten i 10 ml av 1 x PBS utan Ca2 + och Mg2 +, och räkna cellerna genom att späda till en slutlig spädning av 1/200 i trypanblått.
- Centrifugera cellerna vid 218 xg under 5 min vid 20 ° C och återsuspendera pelleten i RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640-medium kompletterat med 2 mM L-glutamin och 100 | ig / ml PenicIllin-streptomycin att ha 7 x 10 6 PBMC per brunn i 2 ml medium i varje brunn i en 6-brunnars-plattan.
- Inkubera plattorna vid 37 ° C med 5% CO2 under 2 h. Efter 2 h monocyterna kommer att ha anslutit sig till plasten.
- För att möjliggöra färska isolerade monocyter att differentiera till hMDMs, aspirera mediet och ersätta det med 2 ml hMDM medium (RPMI 1640, 10% decomplemented fetalt kalvserum (FCS), 2 mM L-glutamin och 1% penicillin-streptomycin) kompletterat med rekombinant humant makrofagkolonistimulerande faktor (RHM-CSF) vid en slutkoncentration av 10 ng / ml.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C med 5% CO2 under 11 dagar (Figur 1).
- Vid dag 11 avlägsna mediet och tvätta 2 gånger med 2 ml kall hMDM medium per brunn. Nästa tvätta varje brunn 2 gånger med 1 ml kall 1 x PBS.
- För att ta bort helt differentierade hMDMs, tvätta varje brunn en gång med 1 ml kall 1x PBS med 2 mM ethylenediaminetetraacetatic syra (EDTA) och inkubera cellerna i 2 ml kall 1 x PBS med 2 mM EDTA per brunn under 15-60 min vid 4 ° C.
OBS: Alternativa metoder för att lösgöra cellerna existerar (t.ex. trypsin eller trypsinliknande aktiviteter) som kan ge goda resultat 11. - Efter lösgörande (färdig genom att pipettera försiktigt upp och ned i brunnen), samla upp cellerna och lägg dem i en 50 ml rör på is innehållande 10 ml kall hMDM medium.
- Centrifugera cellerna vid 218 xg under 5 min vid 20 ° C, återsuspendera pelleten i 10 ml kall hMDM medium och räkna cellerna genom att späda 20/01 i trypanblått.
- Seed cellerna vid 1 x 10 6 hMDMs per 35 mm mikroskopi glas nedre skålen och inkubera plattorna vid 37 ° C med 5% CO2 under en dag.
2. Produktion och kvantifiering av HIV-1 virala stam
OBS: NLR4.3 HIV-1 Gag-iGFP (grönt fluorescerande protein) som bär en R5-tropism kuvert, gåva från M. Schindler 10 används för att infektera makrofager och visa infekterade celler i realtid.
- Producera virala lager genom transfektion av humana embryonala njur 293T celler (2 x 10 6 i 100 mm skål) med 6 mikrogram av motsvarande proviralt DNA med en kommersiell transfektionsreagens.
- Kvantifiera infektiviteten av de viruslagren genom att använda indikatorcellerna HeLa TZM-BL (som bär beta-galaktosidas-genen under kontroll av HIV-1-LTR) med användning av serieutspädningar av de virala stam följt av en ß-galaktosidas färgning av cellerna och att räkna av blå celler 12.
3. Infektion av hMDMs med HIV-1
- Lägga viruset vid en multiplicitet av infektion (MOI) 0,02-0,03 i en ml av hMDM medium till hMDMs (celler utstrukna i 1,13). Till kontrollbrunnar till bara ett ml hMDM medium och inkubera skålarna vid 37 ° C med 5% CO2 i 2 dagar (Figur 1).
- Vid dag två tvätta cellerna med hMDM Medium 3 gånger och tillsätt 1 ml färskt hMDM medium per skål. Inkubera cellerna vid 37 ° C med 5% CO2 under 6 dagar (Figur 1).
4. opsonisering av röda blodkroppar
- För framställningen av 7 x 10 6 SRBC per skål, tvätta SRBC två gånger i 100 pl lösning innehållande 0,1% bovint serumalbumin (BSA) i 1 x PBS med centrifugering vid 600 xg under 4 minuter.
- Resuspendera de tvättade SRBC i 500 ^ il 1 x PBS / BSA 0,1% med kanin-IgG-anti-SRBC vid en sub-agglutinerande koncentration per 5 ul av SRBC och inkubera med rotation vid RT i 30 min.
OBS: För att bestämma under agglutinerande koncentration av anti-SRBC-IgG, förbereda serieutspädningar av IgG (stamkoncentration på 13,1 mg / ml) från 1/50 till 1 / 25,600 i 20 ul i en 96-brunnar. Tillsätt 2 x 10 6 SRBC i 20 pl i varje brunn och placera plattan i ett mörkt rum under flera timmar. Under agglutinerande koncentration ärutspädning av brunnen strax före brunnen med agglutination (IgG + SRBC bildar ett nätverk). - Efter rotation, centrifugera IgG-opsoniserade-SRBC vid 600 xg under 4 minuter och tvätta med 100 pl 1 x PBS / BSA 0,1% med centrifugering vid 600 xg under 4 minuter.
- Resuspendera IgG-opsoniserad-SRBC i förvärmda Fenolrött fritt RPMI-medium kompletterat med 2 mM L-glutamin och 1% penicillin-streptomycin (1 ml / skål).
5. Levande cell Video Mikroskopi Fagocytos analys
- Använda ett konfokalt avbildningssystem, såsom en roterande skiva-system utrustat med en värmekammare vid 37 ° C med CO2 som passerar genom en flaska med vatten för befuktning.
- Slå på värmekammaren före experimentet att ha mikroskopställningen vid 37 ° C före början av fagocytos analysen. Slå på mikroskop och datorn och ladda bildbehandlingsprogram.
- Optimera bildinställningar såsom skanningshastighet, magnification, upplösning, etc. för att ha åtminstone en cell per fält och för att avbilda en ram varje minut mellan 60 till 120 min.
OBS: Här provet avbildas en ram varje minut under 60 minuter med 63x objektiv. - Placera bild skålen på mikroskop scenen. Justera fokus och platsen att hitta just en hel HIV-1-infekterade makrofager inom området. Använd lämpliga inställningar excitation / emissions baserat på den använda bildsystem och sond. Inkludera ett ljust fält (BF) kanal för att observera fagosomer (Figur 1ii). Optimera utseendet hos de olika kanal bilder genom att variera den procentuella andelen av transmitterat ljus och exponeringstid.
OBS: Här NLR4.3 HIV-1 Gag-iGFP var glada med hjälp av en 491 nm laser med 50 msek av exponeringstiden med 20% av laser (Figur 1i). - Ta bort bild skålen och tillsätt 1 ml SRBC suspension på 7 x 10 6 SRBC / ml till skålen (Figur 1).
- Centrifugera vid 500 x g under2 min vid RT för att synkronisera fagocytos, registrera den tid vid slutet av denna centrifugering och återföra skålen till scenen.
- Optimera fokus och fånga GFP och BF bilder i Z-stackar (hela tjockleken av cellen med ett steg-avstånd av 0,3 pm - vanligtvis 20 plan) varje minut under minst en timme. Spara time-lapse video i det ursprungliga fil-format för det använda bildsystem.
OBS: Här var tidsförlopp filmer sparas i ursprungligt format, * .stk filer.
6. Analys av time-lapse filmer
- För videoredigering, klicka på rullgardinsmenyn "Apps" och på fliken "Review Multi Dimensional Data" i videoredigeringsprogram.
- För att öppna filen, klicka på "Välj Basfilnamn" sedan på "Välj registret". I "Datauppsättningar" Markera förvärvet att analysera (i .nd format) och klicka på "Visa". De data representeras i en tabell med tiden i kolonnen end Z-planen i raden.
- Att representera infektionen i en Z-projektion (Figur 2, vänstra panelen), välj 491 nm våglängd i "våglängder" rutan och klicka på "Z projektion" fliken med "alla plan".
- För att analysera en tidssekvens, välj BF våglängd i "våglängder" rutan och välja den optimala plan på Z-axeln för att skilja externa SRBC (figur 2, röd pil), interna SRBC (figur 2, röd cirkel) och kärnan ( Figur 2, blå cirkel).
- Om du vill spara videomontage, klicka på "Selection [X]" -fliken och sedan på "Ladda bild (er)". Slutligen, spara inlästa bilder i TIF-format och öppna dem nästa på ImageJ programvara.
- Använd plugin "Manuell spårning" på ImageJ programvara för att mäta positionen av kärnan och de olika fagosomer observerats i BF kanal (Figur 3).
- download "Manual Spårning" plugin på ImageJ webbplats. På ImageJ, öppna plugin och bildsekvensen som skall analyseras (Figur 3, steg 1 och 2).
- Ange inställningar såsom "Time Interval", som representerar tid mellan intilliggande ramar, och "x / y kalibrering", som representerar avståndet per pixel (Figur 3, steg 3).
OBS: Här spara bildsekvensen med ett tidsintervall av en minut mellan varje ram och x / y kalibrering av 0,205 um eftersom 63x zoom och en kamera med pixelstorlek på 6,45 x 6,45 um 2 används. - För att starta spårning, klicka på "Lägg till spår" (Figur 3, steg 4) och klicka på en SRBC centrum vid första gången när det är internaliseras. Nästa ram visas automatiskt.
- Fortsätt att klicka på SRBC centrum i alla ramar för att ha olika positioner under den tid (Figur 3, steg 6 i röd ruta).
- Börja med att spåra kärnan att få sin uppfattning i alla ramar genom att klicka på dess centrum. Nästa spåra fagosomer (genom att klicka på dess centrum) en efter en på den tiden (ram) av deras internalisering, olika funktion av SRBC. För enkelhetens skull att se SRBC på BF kanal, använd "Ljusstyrka & kontrast" fönster under spårning (Figur 3, steg 5).
- Mellan varje SRBC spårning, klicka på "Lägg till spår" (Figur 3, steg 4) för att få ett nytt spår. Antalet spårnings kommer att ändras i den andra kolumnen, "Track n °" i tabellen resultaten (figur 3, steg 6).
- Spara data i ett kalkylblad för att fortsätta till nästa steg i analysen.
- Använd kalkylprogram för att beräkna rest avstånd fagosomer innehåller SRBC mot kärnan och hastigheten hos fagosomer under de första 5 min efter internalisering av SRBC (Figur 4).
- Öppna kalkyl bord och en ny kalkylbladsfil. Överför i den nya filen endast följande parametrar, tid, x- och y koordinat kärnan och alla SRBC (figur 4A).
- För att beräkna avståndet mellan SRBC och kärnan med bara sina koordinater, överväga kärnan och en SRBC i en XY-koordinatplanet (Figur 4B).
OBS: Avståndet mellan två punkter är längden av den bana som förbinder dem. I planet, är avståndet mellan SRBC och kärnan som ges av Pythagoras sats.- Om c (avståndet mellan kärnan och SRBC) betecknar längden på hypotenusan och a och b betecknar längderna av de två andra sidorna, uttrycka Pythagoras sats som Pythagoras ekvation:
OBS: Samtidigt, på ortonormala, det horisontella avståndeta är (x nucleus -x SRBC) och det vertikala avståndet b är (y nucleus -y SRBC). - Således, beräkna avståndet mellan kärnan och SRBC (figur 4A, lila rutan) efter:
OBS: Multiplicera erhållna distansvärdet (i pixlar) med x / y kalibrering för att ha avståndet i ^ m. Här är x / y kalibrering 0,205 um. - Vid varje tidpunkt, subtrahera avståndet mellan kärnan och SRBC till det initiala avståndet (figur 4C).
- Rita mätningen mot tiden för de första 5 min. Applicera en linjär trendlinje (figur 5A) till tomten och bestämma lutningen på den linjära trendlinje som representerar phagosome hastighet mot kärnan under de första 5 min efter SRBC interna.
- Sammanställa data för att beräkna den genomsnittliga och statistiska fel avhastighetsvärden och plotta dem i lämplig form med hjälp av lämplig mjukvara (Figur 5B).
- Om c (avståndet mellan kärnan och SRBC) betecknar längden på hypotenusan och a och b betecknar längderna av de två andra sidorna, uttrycka Pythagoras sats som Pythagoras ekvation:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FcR-medierad fagocytos av HIV-1-infekterade och icke-infekterade hMDMs beskrivs här med IgG-opsoniserad SRBC som modell mål (Figur 1). De kritiska stegen i protokollet är utarbetandet av hMDMs och infektionen med HIV-1. Faktum är att utbytet och kvaliteten på differentierade makrofager varierar mellan givare, samt infektionsfrekvensen med effektivitetsvinster i storleksordningen 10-40%. Dessutom är framställningen av IgG-opsoniserad-SRBC också viktigt att undvika skador på erytrocyter, eftersom detta kan ge upphov till deras erkännande och upptag som skräp i stället för FcR-medierad fagocytos. Optimal opsonisering kommer att säkerställa en effektiv fagocytos.
Phagosome rörelse i levande HIV-infekterade makrofager analyseras i realtid med BF kanal på en snurrande skiva konfokalmikroskop i BSL-3 laboratorium. Inställningarna för BF-kanalen är kritiska to se kärnan (Figur 2, blå cirkel) och för att särskilja den yttre (fig 2, röda pilspetsar), från de internaliserade SRBC (figur 2, röda cirklar). BF mikroskopi anses vara den enklaste optisk mikroskopi belysningsteknik är tillräcklig för att se fagosomer, som är mindre refringent än de externa SRBC.
Det första steget efter förvärvet av bildsekvenser är manuell spårning på ImageJ programvara (Figur 3). Denna punkt kan vara särskilt lång och omständlig, eftersom det är fördelaktigt att spåra varje phagosome, en efter en för alla bildsekvenser och det anses att experiment behöva upprepas med minst 3 donatorer per betingelse för att nå en tillräckligt stor provstorlek för statistisk analys (minst 30 fagosomer med 3 olika givare).
Det andra steget är analysi kalkylprogram för att beräkna phagosome hastighet under de första 5 min efter interna för varje internalis SRBC (Figur 4). För detta, vi ritar för varje phagosome den sträcka under den första 5 min mot tiden. Ett representativt exempel visas i icke-infekterade hMDMs på figur 5A. Nästa vi erhålla hastigheten hos phagosome, som är lutningen för den linjära regressionskurvan. En hastighet av 0,5384 pm / min konstaterades för detta phagosome.
Notera, är det möjligt att analysera phagosome hastighet under de första minuterna efter internalisering, som beskrivs här eller i Dumas et al. 8, eller senare genom att analysera hastigheten över längre tidsskalor. I vår studie observerade vi att phagosome hastighet under de första 5 min efter interna i HIV-infekterade hMDMs är lägre jämfört med icke-infekterade hMDMs (Figur 5B).
Figur 1. Beredning av kontroll- och HIV-infekterade hMDMs för fagocytos avbildning. Monocyter renas genom adhesion (1) och differentierade till makrofager under 11 dagar med M-CSF (2). Därefter hMDMs infekterade med NLR4.3 HIV-1Gag-iGFP i) vid ett MOI mellan 0,02 och 0,03 i 8 dagar med tvätt på dag 2 (3). (4) IgG-opsoniserad SRBC läggs på hMDMs för fagocytos under en timme. De fagosomer innehåller SRBC kan detekteras på BF bilder (röd cirkel, ii). Bilderna är från Servier bilder databasen. Bar = 10 pm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. realtid förvärv underfagocytos av representativ kontroll och HIV-infekterade hMDMs. hMDMs bereds och infekteras som beskrivs i figur 1. De NLR4.3 HIV-1Gag-iGFP infekterade celler detekteras med 491 nm laser. Z-stackar av spinning disk konfokala bilder förvärvas och analyseras med hjälp av både mikroskop förvärv programvara och ImageJ (vänster paneler). Gallerier BF bilder representerar en icke-infekterade (toppaneler motsvarande Movie 1) och en NLR4.3 HIV-1Gag-iGFP infekterade (bottenpaneler motsvarande Movie 2) cell under en 45 min förvärv (46 bilder med tiden anges som hh : mm). Cellmembranet (prickade svart linje), kärnan (blå cirkel), de externa SRBC (vissa av dem anges med röda pilspetsar) och de interna SRBC (vissa av dem anges med röda cirklar) kan detekteras på BF bilder. Bar = 10 pm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Instruktions steg för bildanalys med manuell spårning plugin på ImageJ. Efter att ha öppnat "Manuell spårning" plugin (1) och laddar time-lapse video i BF kanal (2), anger parametrarna för förvärv (3). Klicka på "Lägg till spår" (4) och starta mätningen av spårnings genom att klicka på en phagosome (5) för att erhålla ett nytt fönster med X- och Y-positioner för den valda phagosome (6, röd ruta). För att följa phagosome på tidssekvensen för enkelhetens skull, variera ljusstyrka och kontrast (5). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Instruktions steg för dataanalys av phagosome migrationshastighet i kalkylprogram. (A) Montera X- och Y-positionen av kärnan och varje phagosome (röd ruta) i ett kalkylblad tabell. I en annan kolumn (lila rutan), beräkna avståndet mellan phagosome och kärnan med Pythagoras sats där c representerar längden mellan kärnan och SRBC och a och b längderna av de två andra sidorna av en rätvinklig triangel ( B). (C) slutligen beräkna den sträcka som de fagosomer vid varje tidpunkt (green box) genom att subtrahera avståndet mellan SRBC och kärnan vid en given tidpunkt från den initiala avstånd vid tiden 0. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
p_upload / 54568 / 54568fig5.jpg "/>
Figur 5. Kvantifiering av phagosome migrationshastigheten i kontroll och HIV-infekterade hMDMs. (A) För varje SRBC och strax efter SRBC intemalisering, är den rest sträcka mot kärnan mäts och plottas mot tiden. Dess hastighet under den första 5 min beräknas med användning av linjär regression i kalkylprogram. Ett representativt experiment visas (den interna SRBC i Figur 3-4). (B) Alla hastigheter under de första 5 min mäts för 66 fagosomer i icke-infekterade (5 donatorer) och 60 fagosomer i HIV-infekterade celler (4 givare). Data representerar medelvärde ± SEM (oparat Students t-test med Welch korrigering, **, P <0,01). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1: Phagosome rörelse i en representativ icke-infekterade makrofager. . (Högerklicka för att ladda ner) rörelse opsoniserad röda blodkroppar påvisades i BF kanal under 45 min av fagocytos med en bild per minut (46 bilder med tiden anges som hh: mm). Bar = 10 ^ m.
Film 2: Phagosome rörelse i en representativ HIV-infekterade makrofager. (Högerklicka för att ladda ner). HIV-1 (NLR4.3 HIV-1 Gag iGFP) infekterade makrofager identifierades efter belysning med 491 laser. Förflyttningen av opsoniserad röda blodkroppar påvisades i BF kanalen under 45min av fagocytos med en bild per minut (46 bilder med tiden anges som hh: mm). Bar = 10 ^ m.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna teknik har flera viktiga steg. För det första är framställningen av hMDMs och deras infektion med HIV-1 kritisk, eftersom andelen infektion är donator beroende. Notera, har vi beslutat att använda makrofager som inte är polariserade in vitro före infektion, eftersom status av makrofager potentiellt stött av viruset in vivo inte har karakteriserats väl hittills. Vi kontrollerade uttrycket av flera ytmarkörer, vilket tyder på att makrofagerna varken M1 eller M2, och kontrollerade uttrycket av CD4 och CCR5. De smittade är variabel och sträcker sig från 10 till 40%, och ibland lägre. Denna variabel infektionsfrekvensen är därför det kan vara svårt att hitta en HIV-1 infekterade fluorescerande hMDM under mikroskop. Dessutom kan den tid som behövs för att hitta en HIV-1 infekterad cell omedelbart efter centrifugeringssteget också leda till en fördröjning vid start förvärvet. Fagocytos kan inledas utan synchronization bindning och upptag genereras genom centrifugering. Emellertid var detta alternativ inte ut för SRBC som flyter innan cellerna. Det kan vara ett bra alternativ med pärlor. För att minimera den tid som behövs för att hitta infekterade celler kan inrutade glas botten rätter användas för att identifiera HIV-1-infekterade hMDMs innan du fortsätter att starta fagocytos analysen. De utvalda HIV-infekterade celler som har en "rimlig" antal SRBC omkring dem kommer sedan att snabbt valt att starta förvärv. "Rimlig SRBC mängd" betyder nog att ha åtminstone 10 SRBC per cell och inte alltför många för att förhindra externa SRBC från maskera fagosomer.
Dessutom är det viktigt att optimera de opsonisering betingelser för att säkerställa att det inte kommer att vara effektiv igenkänning och upptag av cellerna. FCR-medierad fagocytos är konstitutiv och hMDMs är rutinmässigt mycket effektiva i FcR-medierat upptag. Dessutom, för korrekt fagocytos villkoren måste be optimalt med värmekammaren vid 37 ° C och 5% CO2. Det är nödvändigt att kontrollera gas och temperaturen innan fagocytos analysen.
Slutligen diskriminering av externa SRBC från interna fagosomer och identifiering av kärnan i BF-kanalen är viktiga för analys av ImageJ programvara. Detta är anledningen till att inställningarna för denna kanal är viktiga. Med tanke på att fokus kan förloras under förvärv, rekommenderar vi att få högar av bilder i Z-axeln för att vara säker på att ha en optimal plan för att analysera phagosome hastighet. Det är att föredra att ha en enda cell i ett fält för att analysera alla internaliserade SRBC för varje cell. Det är därför linsen val är viktigt och här har vi använt 2 linser som en funktion av cellstorleken. Det var lättare för oss att spåra fagosomer med 100X objektiv, men ibland cellerna var alltför stor så vi var tvungna att byta till en 63x lins. Valet av lins är också kritisk när man tänker på imåldersanalys med ImageJ och ett kalkylprogram bord eftersom båda linserna implicerade olika x / y kalibreringar.
Den första begränsningen med denna teknik är det antal prover som måste förvärvas för att ha statistiskt signifikanta resultat. Vi kan registrera flera filmer per givare men oftast inte mer än två celler per tillstånd, per fat. Lösningarna på denna begränsning för att öka antalet sampel är att upprepa experimenten med flera givare eller att göra med flera punkter XY avbildning beroende på mikroskopet. Olägenhet för sista metoden är den potentiella förlusten av fokus under motordrivna XYZ scanning. En annan begränsning är att den manuella kvantifiering av hastigheten är lång och omständlig jämfört med en automatiserad analys. För fullständig automatiserad analys, är det nödvändigt att använda fluorescerande partiklar, som rapporterats i banbrytande studier 4 med latexpärlor kopplade till fiskskinnsgelatin som följdes med en spårningsalgoritm på MatLab programvara. Fluorescerande opsoniserande antikroppar eller pärlor kan vara ett alternativ, men de är föremål för blekning, vilket är ett problem när du spelar in fagocytos för en timme. Andra studier rapporterar användningen av latexpärlor 13,14. Vi märkte dock att internaliseringen av latexpärlor är mindre lätt att upptäcka än upptaget av SRBC. Faktiskt startpunkten för kinetiken för intracellulär migration är viktigt att veta att upptäcka tidiga defekter i phagosomal rörelse.
Den största fördelen med den här beskrivna metoden är dess enkelhet och användning av en fri programvara. För att utföra manuell spårning med hjälp av ImageJ programvara, måste vi använda läget för phagosome och kärnan, därför måste vi använda Pythagoras sats för att beräkna avståndet mellan phagosome och kärnan, och att ha hastigheten efter en linjär regression i kalkylprogram. Detta 3 steg analys kan reduceras till ett steg, spårning, på isiga programvara med & #34;. Manuell spårning "plugin Utgångsdata är sedan direkt hastigheten för partikeln att följa, och närmare bestämt den relativa hastigheten mellan 2 grupper (såsom fagosomer och kärna) Slutligen tillåter oss beräkningen för att mäta den relativa hastigheten av. en partikel jämfört med en annan partikel som också kan röra sig.
Den potentiella framtida tillämpningen av denna levande tidsförlopp analys kan vara synliga partiklar i starkt fält, som bakterier, svampar eller cellrester. Olika behandlingar eller infektion betingelser tillräckliga för att ändra phagosomal mognad och aktiveringsegenskaperna hos makrofager skulle gynnas av en sådan förfinad analys av phagosomal rörelse mot cellens centrum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | For viral production |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | For acquisition |
| Falcon Tissue Culture Plates 6-well | Thermo Fischer Scientific | Corning. Inc. 353934 | For human monocyte-derived macrophages |
| Ficoll-Plaque PLUS | Dominique Dutscher | 17-1440-03 | a neutral, highly branched, high-mass, hydrophilic polysaccharide in solution for density centrifugation |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | RT |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x, liquid (High Glucose) | GIBCO, Molecular probes | 31966-021 | Conserved at 4 °C ; for HEK cells culture |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | Conserved at 4 °C; for hMDMs culture |
| Fœtal Calf Serum (FCS) | Eurobio | CVFSVF0001 | Conserved at -20 °C ; decomplemented |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fischer Scientific | 15140-122 | Conserved at -20 °C ; for hMDMs culture |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10x 500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37 °C water bath before use ; for phagocytosis assay |
| FuGENE6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Conserved at 4 °C ; for viral production |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4 °C before use |
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | Conserved at 4 °C |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | Conserved at -20 °C |
| Inverted microscope DMI600 | Leica | ||
| Confocal Spinning Disk Unit CSU-X1M1 | Yokogawa | ||
| 491 nm 50 mW laser | COBOLT CALYPSO | ||
| HCX PL APO CS Objectif | Leica | Objective lens ; Magnification 100X ; Numerical aperture 1.40 ; Immersion oil | |
| CoolSnap HQ2 (FireWire) Camera | Photometrics | Pixel size 6.45 µm x 6.45 µm ; Definition 1,392 x 1,040 ; Encoding the image in 14 Bit | |
| Metamorph 7.7.5 software | Molecular Devices | For the control of the microscope | |
| GraphPad Prism software | For the statistics analysis |
References
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Niedergang, F. Encyclopedia of Cell Biology. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).
- Blocker, A., Griffiths, G., Olivo, J. C., Hyman, A. A., Severin, F. F. A role for microtubule dynamics in phagosome movement. J Cell Sci. 111 (Pt 3), 303-312 (1998).
- Blocker, A., et al. Molecular requirements for bi-directional movement of phagosomes along microtubules. J Cell Biol. 137, 113-129 (1997).
- Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).
- Feasey, N. A., Dougan, G., Kingsley, R. A., Heyderman, R. S., Gordon, M. A. Invasive non-typhoidal salmonella disease: an emerging and neglected tropical disease in Africa. Lancet. 379, 2489-2499 (2012).
- Mazzolini, J., et al. Inhibition of phagocytosis in HIV-1-infected macrophages relies on Nef-dependent alteration of focal delivery of recycling compartments. Blood. 115, 4226-4236 (2010).
- Dumas, A., et al. The HIV-1 protein Vpr impairs phagosome maturation by controlling microtubule-dependent trafficking. J Cell Biol. 211, 359-372 (2015).
- Greenberg, S., el Khoury, J., Kaplan, E., Silverstein, S. C. A fluorescence technique to distinguish attached from ingested erythrocytes and zymosan particles in phagocytosing macrophages. J. Immunol. Methods. 139, 115-122 (1991).
- Koppensteiner, H., Banning, C., Schneider, C., Hohenberg, H., Schindler, M. Macrophage internal HIV-1 is protected from neutralizing antibodies. J Virol. 86, 2826-2836 (2012).
- Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. 1087, 207-220 (2014).
- Wei, X., et al. Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20) monotherapy. Antimicrob Agents Chemother. 46, 1896-1905 (2002).
- Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP. Mol Cell Biol. 23, 6494-6506 (2003).
- Toyohara, A., Inaba, K. Transport of phagosomes in mouse peritoneal macrophages. J Cell Sci. 94 (Pt 1), 143-153 (1989).
