Protocol
Le protocole doit être effectué en stricte conformité avec les législations nationales et internationales et les réglementations locales. Le sang provenant de donneurs sains qui ont donné leur consentement au don de sang à des fins de recherche a été obtenu à partir de transfusion sanguine centres avec lesquels les institutions ont signé un accord. protections spéciales doivent être prises lors de l'utilisation du sang humain. Les expériences avec le VIH-1 doivent être réalisés dans un niveau de biosécurité 3 ou 2 (BSL-3 ou 2) Laboratoire conformément à la législation locale.
1. Préparation de macrophages humains dérivés des monocytes (hMDMs) par gradient de densité Centrifugation et sélection par Adhesion
- Commencez avec du sang frais provenant de donneurs sains (9 ml). Diluer tout le volume de sang frais avec 1x stérile tamponnée au phosphate (PBS) sans Ca2 + et Mg2 + afin d' obtenir un volume final de 70 ml et ajouter doucement le sang dilué dans 50 ml de deux tubes coniques (35 ml par tube) , au-dessus de 15 ml d'uneeutral, très ramifié, de masse élevée, polysaccharide hydrophile en solution déjà dans chaque tube.
- Centrifuger les deux tubes de sang à 537 xg pendant 20 min à 20 ° C sans frein. Ramassez ensuite les cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP) contenus dans l'anneau cellulaire trouble à l'interface et de les transférer dans un nouveau tube de 50 ml contenant 15 ml de PBS 1x sans Ca 2+ et Mg 2+.
- Centrifuger les cellules à 218 xg pendant 5 min à 20 ° C et à remettre en suspension le culot dans 45 ml de PBS 1x sans Ca 2+ et Mg 2+.
- Centrifuger les cellules à 218 xg pendant 5 min à 20 ° C, de remettre en suspension le culot dans 10 ml de PBS 1x sans Ca 2+ et Mg 2+, et compter les cellules par dilution à une dilution finale de 1/200 dans le bleu Trypan.
- Centrifuger les cellules à 218 xg pendant 5 min à 20 ° C et remettre en suspension le culot dans RPMI (Roswell Park Institute Memorial) 1640 complété avec 2 mM de L-glutamine et 100 pg / ml penicIllin-streptomycine avoir 7 x 10 6 PBMC par puits dans 2 ml de milieu dans chaque puits d'une plaque 6.
- Incuber les plaques à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 2 heures. Après 2 heures les monocytes auront adhéré à la matière plastique.
- Pour permettre monocytes fraîchement isolés à se différencier en hMDMs, aspirer le moyen et le remplacer par un milieu de 2 ml (RPMI 1640, 10% décomplémenté sérum foetal de veau (FCS), 2 mM de L-glutamine et 1% de pénicilline-streptomycine) additionné de colonie recombinante humaine du facteur de stimulation des macrophages (rhM-CSF) à une concentration finale de 10 ng / ml.
- Incuber les cellules à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 11 jours (figure 1).
- Au jour 11 éliminer le milieu et laver 2 fois avec 2 ml de milieu de hMDM froid par puits. Laver ensuite chaque puits 2 fois avec 1 ml de froid 1x PBS.
- Pour détacher hMDMs complètement différenciées, lavez chaque puits 1 fois avec 1 ml de froid 1x PBS avec de l'acide ethylenediaminetetraacetatic 2 mM (EDTA) et incuber les cellules dans 2 ml de PBS froid 1x avec 2 mM d'EDTA par puits pendant 15 à 60 min à 4 ° C.
NOTE: Les méthodes alternatives pour détacher les cellules existent (par exemple, la trypsine ou les activités de trypsine) qui pourraient donner de bons résultats 11. - Après le détachement (complété par pipetage doucement monter et descendre dans le puits), recueillir les cellules et les mettre dans un tube de 50 ml sur de la glace contenant 10 ml de milieu de hMDM froid.
- Centrifuger les cellules à 218 xg pendant 5 min à 20 ° C, de remettre en suspension le culot dans 10 ml de milieu de hMDM froid, et compter les cellules par dilution au 1/20 dans du bleu Trypan.
- Ensemencer les cellules à 1 x 10 6 hMDMs par 35 mm de verre de qualité en microscopie plat fond et incuber les plaques à 37 ° C avec 5% de CO 2 pour 1 jour.
2. Production et Quantification du VIH-1 Stocks virales
NOTE: NLR4.3 HIV-1 Gag-IGFP (Green Fluorescent Protein) portant une enveloppe R5-tropique, don de M. Schindler 10 est utilisé pour infecter les macrophages et de voir les cellules infectées en temps réel.
- Produire des stocks viraux par transfection de cellules embryonnaires humaines de rein 293T (2 x 10 6 à 100 mm plat) avec 6 pg de l'ADN proviral correspondant en utilisant un réactif de transfection du commerce.
- Quantifier l'infectivité des stocks de virus en utilisant des cellules indicatrices HeLa TZM-BL (portant le gène de la ß-galactosidase sous le contrôle du VIH-1 LTR) en utilisant des dilutions en série des souches virales, suivie d'une coloration de ß-galactosidase des cellules et le comptage des cellules bleues 12.
3. L'infection de hMDMs avec le VIH-1
- Ajouter le virus à une multiplicité d'infection (MOI) de 0,02 à 0,03 dans 1 ml de milieu hMDM à hMDMs (cellules étalées à 1,13). Ajouter aux puits témoins seulement 1 ml de milieu hMDM et incuber les boîtes à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 2 jours (figure 1).
- Au jour 2 se laver les cellules avec hMDM medium 3 fois et ajouter 1 ml de milieu de hMDM frais par plat. Incuber les cellules à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 6 jours (figure 1).
4. Opsonisation de mouton Red Blood Cells
- Pour la préparation de 7 x 10 6 globules rouges par boîte, laver les globules rouges à deux reprises dans 100 pl de solution contenant 0,1% de sérum - albumine bovine (BSA) dans du PBS 1X avec une centrifugation à 600 x g pendant 4 minutes.
- Remettre en suspension les globules rouges lavées dans 500 ul de 1 x PBS / BSA 0,1%, avec une IgG de lapin anti-globules rouges à une concentration sous-agglutinante pour 5 pi de globules rouges et on incube avec une rotation à température ambiante pendant 30 min.
REMARQUE: Pour déterminer la concentration de sous-agglutination d'anti-GRM IgG, préparer des dilutions en série d'IgG (concentration des stocks à 13,1 mg / ml) de 1/50 à 1 / 25.600 dans 20 pl dans une plaque de 96 puits. Ajouter 2 x 10 6 GRM dans 20 pl dans chaque puits et mettre la plaque dans une pièce sombre pendant plusieurs heures. La concentration de sous-agglutinant est lala dilution du puits juste avant le puits avec agglutination (IgG + GRM formation d'un réseau). - Après rotation, centrifuger les-GRM IgG-opsonisées à 600 xg pendant 4 min et laver avec 100 pi de PBS 1x / BSA 0,1% avec centrifugation à 600 g pendant 4 min.
- Remettre en suspension les globules rouges-IgG opsonisées dans un milieu préchauffé Phénol anérythre RPMI supplémenté avec 2 mM de L-glutamine et 1% de pénicilline-streptomycine (1 ml / boîte).
5. Live Cell Video Microscopy phagocytose Assay
- Utiliser un système d'imagerie confocale tel qu'un système à disque tournant muni d'une chambre de chauffage à 37 ° C avec du CO 2 en passant par une bouteille d'eau pour l' humidification.
- Allumer la chambre de chauffage avant l'expérience pour avoir la platine du microscope à 37 ° C avant le début de l'essai de phagocytose. Allumez le microscope et l'ordinateur, et charger le logiciel d'imagerie.
- Optimiser les paramètres d'imagerie telles que la vitesse de balayage, magnification, résolution, etc. pour avoir au moins une cellule par champ et à l' image d' une image chaque minute entre 60 à 120 min.
NOTE: Ici, l'échantillon est imagée d'une image toutes les minutes pendant 60 min avec 63X lentille. - Placer le plat d'imagerie sur la platine du microscope. Réglez la mise au point et l'emplacement pour trouver un seul ensemble de VIH-1 macrophage infecté dans le domaine. Utiliser les paramètres d'excitation / d'émission appropriés basés sur le système d'imagerie utilisé et de la sonde. Inclure un canal lumineux champ (BF) pour observer phagosomes (Figure 1ii). Optimiser l'apparence des différentes images de canal en ajustant le pourcentage de lumière transmise et le temps d'exposition.
NOTE: Ici, NLR4.3 HIV-1 Gag-IGFP était excité à l' aide d' un laser 491 nm avec 50 msec de temps d' exposition avec 20% de laser (Figure 1i). - Retirer le plat d'imagerie et ajouter 1 ml de suspension de SRBC à 7 x 10 6 GRM / ml à plat (figure 1).
- Centrifuger à 500 xg pour2 min à température ambiante pour synchroniser la phagocytose, enregistrer le temps à la fin de cette centrifugation et retourner le plat de la scène.
- Optimiser la mise au point et la capture GFP et images BF dans Z-piles (toute l'épaisseur de la cellule avec une étape-distance de 0,3 um - habituellement 20 avions) chaque minute pendant au moins 1 h. Enregistrez la vidéo time-lapse dans le format de fichier natif du système d'imagerie utilisé.
NOTE: Ici, les films en accéléré ont été enregistrés dans le format natif, les fichiers * .stk.
6. Analyse des time-lapse Films
- Pour le montage vidéo, cliquez sur le menu déroulant "Apps" et dans l'onglet «Revue multi dimensionnelle de données" dans le logiciel de montage vidéo.
- Pour ouvrir le fichier, cliquez sur "Fichier de base Sélectionnez" puis sur "Sélectionner le répertoire". Dans le «ensembles de données», sélectionnez l'acquisition à analyser (en format .ND) et cliquez sur "View". Les données sont représentées sous forme de tableau dans le temps en une colonne ded Z-plan de la ligne.
- Pour représenter l'infection dans un Z-projection (Figure 2, panneaux de gauche), sélectionnez 491 nm de longueur d' onde dans la zone "Longueurs d' onde" et cliquez sur l'onglet "Z de projection" avec "tous les plans".
- Pour analyser une séquence de temps, sélectionnez BF longueur d' onde dans la zone "Longueurs d' onde" et choisissez le plan optimal sur l'axe Z pour distinguer GRM externes (figure 2, flèche rouge), GRM internes (figure 2, cercle rouge) et le noyau ( Figure 2, cercle bleu).
- Pour enregistrer les montages vidéo, cliquez sur l'onglet "Sélection de [X]" puis sur "Image (s) de charge". Enfin, enregistrez les images chargées en format .tif et les ouvrir à côté sur le logiciel ImageJ.
- Utilisez le plug - in "Tracking Manuel" sur le logiciel ImageJ pour mesurer la position du noyau et les différentes phagosomes observées dans le canal BF (figure 3).
- Download le "suivi manuel" plug-in sur le site ImageJ. Sur ImageJ, ouvrez le plugin et la séquence d'images à analyser (figure 3, étape 1 et 2).
- Entrez les paramètres tels que "Intervalle de temps" qui représente quantité de temps entre les images adjacentes, et le "x / y calibration" qui représente la distance par pixel (Figure 3, étape 3).
NOTE: Ici, enregistrer la séquence d'images avec un intervalle de temps de 1 min entre chaque trame et x / y calibration de 0,205 pm parce que le zoom 63X et un appareil photo avec une taille de pixel de 6,45 x 6,45 um 2 sont utilisés. - Pour démarrer le suivi, cliquez sur "Ajouter piste" (figure 3, étape 4) et cliquez sur un centre SRBC à la première fois quand il est internalisé. L'image suivante apparaît automatiquement.
- Continuez à cliquer sur le centre SRBC dans tous les cadres d'avoir des positions différentes pendant le temps (figure 3, étape 6 dans la case rouge).
- Commencer à suivre le noyau pour avoir sa position dans tous les cadres en cliquant sur son centre. suivre ensuite les phagosomes (en cliquant sur son centre), un par un à l'époque (cadre) de leur intériorisation, différente en fonction GRM. Pour plus de commodité pour voir SRBC sur le canal BF, utilisez la fenêtre "Luminosité et contraste" pendant le suivi (figure 3, étape 5).
- Entre chaque suivi SRBC, cliquez sur "Ajouter piste" (figure 3, étape 4) d'avoir une nouvelle piste. Le numéro du suivi sera changé dans la deuxième colonne, "Track n °" de la table des résultats (figure 3, étape 6).
- Sauvegardez les données dans un tableur pour passer à l'étape suivante de l'analyse.
- Utilisez un logiciel de feuille de calcul pour calculer la distance parcourue de phagosomes contenant GRM vers le noyau et la vitesse des phagosomes pendant les 5 premières minutes après intériorisation de GRM (Figurer 4).
- Ouvrez la table de feuille de calcul et un nouveau fichier de feuille de calcul. Transfert dans ce nouveau fichier les paramètres suivants seulement, le temps, la x- et y- coordonnées du noyau et tous les GRM (figure 4A).
- Pour calculer la distance entre GRM et le noyau avec seulement leurs coordonnées, considérons le noyau et un SRBC dans un plan XY de coordonnées (figure 4B).
REMARQUE: La distance entre deux points est la longueur du chemin qui les relie. Dans le plan, la distance entre le noyau et GRM est donnée par le théorème de Pythagore.- Si c (la distance entre le noyau et le SRBC) désigne la longueur de l'hypoténuse et a et b désignent les longueurs des deux autres côtés, d' exprimer le théorème de Pythagore que l'équation de Pythagore:
REMARQUE: Dans le même temps, au repère orthonormé, la distance horizontalea est (x -x noyau SRBC) et la distance b est verticale (y -y noyau SRBC). - Ainsi, calculer la distance entre le noyau et le GRM (figure 4A, boîte violette) par:
NOTE: Multiplier la valeur de distance obtenue (en pixels) par étalonnage x / y pour avoir la distance en um. Ici, le calibrage x / y est de 0,205 um. - À chaque fois, on soustrait la distance entre le noyau et le SRBC à la distance initiale (figure 4C).
- Tracer la mesure contre le temps pour les 5 premières minutes. Appliquer une ligne de tendance linéaire (Figure 5A) à la parcelle et de déterminer la pente de la ligne de tendance linéaire qui représente la vitesse de phagosome vers le noyau pendant les 5 premières minutes après intériorisation SRBC.
- Regroupez les données pour calculer l'erreur moyenne et statistique desles valeurs de vitesse et de tracer les sous une forme appropriée à l' aide du logiciel approprié (figure 5B).
- Si c (la distance entre le noyau et le SRBC) désigne la longueur de l'hypoténuse et a et b désignent les longueurs des deux autres côtés, d' exprimer le théorème de Pythagore que l'équation de Pythagore:
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Representative Results
Phagocytose FcR-médiée par hMDMs VIH-1-infectés et non infectés est décrite ici en utilisant GRM IgG-opsonisées comme cibles de modèle (figure 1). Les étapes essentielles de ce protocole sont la préparation de hMDMs et l'infection par le VIH-1. En effet, le rendement et la qualité des macrophages différenciés varie entre les donateurs, ainsi que le taux d'infection avec des rendements de l'ordre de 10-40%. En outre, la préparation d'IgG opsonisé-globules rouges est également important d'éviter d'endommager les globules rouges, car cela pourrait provoquer la reconnaissance et l'absorption que des débris et non par phagocytose à médiation par FcR. opsonisation Optimal assurera la phagocytose efficace.
mouvement Phagosome dans la vie des macrophages infectés par le VIH est analysé en temps réel avec le canal BF sur un disque rotatif microscope confocal dans le laboratoire BSL-3. Les réglages du canal BF sont critiques to voir le noyau (Figure 2, cercle bleu) et pour discriminer le externe (Figure 2, pointes de flèches rouges) des GRM intériorisées (figure 2, cercles rouges). La microscopie BF est considérée comme la plus simple microscopie optique technique d'éclairage suffisant pour voir les phagosomes, qui sont moins réfringent que les GRM externes.
La première étape après l' acquisition de séquences d'images est suivi manuel sur le logiciel ImageJ (Figure 3). Ce point peut être particulièrement long et fastidieux, car il est préférable de suivre chaque phagosome, un par un pour toutes les séquences d'images et il est considéré que les expériences doivent être répétées avec au moins 3 donneurs par condition d'atteindre une grande taille d'échantillon suffisant pour analyse statistique (au moins 30 phagosomes avec 3 donneurs différents).
La deuxième étape est l'analysedans le logiciel de feuille de calcul pour calculer la vitesse de phagosome pendant les 5 premières minutes après intériorisation pour chaque GRM intériorisées (figure 4). Pour cela, nous avons tracé pour chaque phagosome la distance parcourue pendant les 5 premières minutes contre le temps. Un exemple représentatif est montré dans hMDMs non-infectés sur la figure 5A. Ensuite, nous obtenons la vitesse du phagosome, qui est la pente de la courbe de régression linéaire. Une vitesse de 0,5384 um / min a été trouvé pour cette phagosome.
Il convient de noter qu'il est possible d'analyser la vitesse du phagosome pendant les quelques premières minutes après intériorisation, tel que décrit ici ou dans Dumas et al. , 8, ou plus tard , en analysant la vitesse en fonction des échelles de temps plus longues. Dans notre étude, nous avons observé que la vitesse de phagosome pendant les 5 premières minutes après une internalisation dans le hMDMs infectés par le VIH est plus faible par rapport à hMDMs non-infectées (figure 5B).
Figure 1. Préparation de contrôle et hMDMs infectés par le VIH pour l' imagerie par phagocytose. Les monocytes sont purifiés par adhérence (1) et différenciées en macrophages pendant 11 jours avec du M-CSF (2). Ensuite, hMDMs sont infectés par le VIH-NLR4.3 1Gag-IGFP i) à une MOI entre 0,02 et 0,03 pour 8 jours avec lave le jour 2 (3). (4) GRM IgG-opsonisées sont ajoutés sur hMDMs pour phagocytose pendant 1 h. Les phagosomes contenant GRM sont détectables sur les images de BF (cercle rouge, ii). Les images sont de la base de données d'images Servier. Bar = 10 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. acquisition en temps réel au coursphagocytose par le contrôle représentatif et hMDMs infectés par le VIH. hMDMs sont préparés et infectés comme décrit dans la figure 1. Les cellules NLR4.3 VIH-1Gag-IGFP infectés sont détectés avec le laser 491 nm. Z-piles de filature disque images confocales sont acquises et analysées en utilisant le logiciel d'acquisition de microscope et ImageJ (panels de gauche). Galeries d'images BF représentent un (panneaux supérieurs correspondant à Film 1) non infectés et un NLR4.3 VIH-1Gag-IGFP infectés (panneaux de fond correspondant à Movie 2) cellule lors d'une acquisition de 45 min (46 images avec le temps indiqué que hh : mm). La membrane cellulaire (ligne noire pointillée), le noyau (cercle bleu), les GRM externes (certains d'entre eux ont indiqué avec des flèches rouges) et les globules rouges internes (certains d'entre eux ont indiqué avec des cercles rouges) sont détectables sur les images de BF. Bar = 10 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Des mesures d'instruction pour l' analyse d'image avec Manuel de suivi plugin sur ImageJ. Après avoir ouvert le plugin "Suivi manuel" (1) et le chargement de la vidéo time-lapse dans BF canal (2), saisissez les paramètres de l'acquisition (3). Cliquez sur "Ajouter piste" (4) et commencer la mesure du suivi en cliquant sur un phagosome (5) pour obtenir une nouvelle fenêtre avec les positions X et Y du phagosome choisi (6, boîte rouge). Pour suivre le phagosome sur la séquence de temps pour plus de commodité, varier la luminosité et le contraste (5 '). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. étapes d'instructions pour l' analyse des données de vitesse de migration de phagosome dans le logiciel de feuille de calcul. (A) Assembler les positions X et Y du noyau et chaque (encadré rouge) phagosome dans une table de feuille de calcul. Dans une autre colonne (boîte violette), calculer la distance entre le phagosome et le noyau avec le théorème de Pythagore , où c représente la longueur entre le noyau et le SRBC et a et b des longueurs des deux autres côtés d'un triangle rectangle ( B). (C) Enfin, calculer la distance parcourue par les phagosomes à chaque fois (boîte verte) en soustrayant la distance entre le GRM et le noyau à un moment donné de la distance initiale au temps 0. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande cette figure.
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La quantification de la figure 5. La vitesse de migration du phagosome dans le contrôle et hMDMs infectés par le VIH. (A) Pour chaque SRBC et juste après intériorisation SRBC, la distance parcourue en direction du noyau est mesurée et tracée en fonction du temps. Sa vitesse pendant les 5 premières minutes est calculée en utilisant la régression linéaire dans le logiciel de tableur. Une expérience représentative est présentée (SRBC interne de la figure 3-4). (B) Toutes les vitesses pendant les 5 premières minutes sont mesurées pour 66 phagosomes dans (5 donneurs) non infectés et 60 phagosomes dans les cellules infectées par le VIH (4 donateurs). Les données représentent la moyenne ± SEM (t test de Student non apparié avec correction de Welch; **, P <0,01). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Film 1: mouvement Phagosome dans un macrophage non infecté représentant. . (Clic pour télécharger) Le mouvement des globules rouges opsonisées a été détectée dans le canal BF pendant 45 min de la phagocytose avec une image par minute (46 images avec le temps indiqués comme hh: mm). Bar = 10 pm.
Film 2: mouvement Phagosome dans un macrophage représentant infecté par le VIH. (Clic droit pour télécharger). VIH-1 (NLR4.3 HIV-1 Gag IGFP) infectés par les macrophages ont été identifiés après l' illumination avec le laser 491. Le déplacement des globules rouges opsonisés a été détectée dans le canal BF pendant 45min de la phagocytose avec une image par minute (46 images avec le temps indiqués comme hh: mm). Bar = 10 pm.
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Discussion
Cette technique présente plusieurs étapes critiques. Tout d'abord, la préparation d'hMDMs et leur infection par le VIH-1 est critique parce que le pourcentage d'infection est dépendante donneur. Il convient de noter, nous avons décidé d'utiliser les macrophages qui ne sont pas polarisées in vitro avant l'infection, car le statut des macrophages potentiellement rencontrés par le virus in vivo n'a pas été bien caractérisé jusqu'à présent. Nous avons vérifié l'expression de plusieurs marqueurs de surface, ce qui indique que les macrophages sont ni M1 ni M2, et vérifié l'expression de CD4 et CCR5. Les taux d'infection sont variables et vont de 10 à 40%, et parfois plus faible. Ce taux d'infection variable est pourquoi il peut être difficile de trouver un VIH-1 hMDM fluorescent infecté sous le microscope. En outre, le temps nécessaire pour trouver une cellule infectée par le VIH-1 immédiatement après l'étape de centrifugation peut également conduire à un retard dans le démarrage de l'acquisition. Phagocytose pourrait être engagée sans l'synchronization de lier et de l'absorption produite par centrifugation. Cependant, cette option n'a pas été sélectionnée pour GRM qui flottent avant d'atteindre les cellules. Il pourrait être une bonne option avec des perles. Pour réduire au minimum le temps nécessaire pour trouver des cellules infectées, plats à fond de verre grillagé pourraient être utilisés pour identifier le VIH-1 hMDMs infectés avant de passer à commencer le test de phagocytose. Les cellules infectées par le VIH sélectionnés qui ont un nombre "raisonnable" de GRM autour d'eux seront alors rapidement choisis pour démarrer les acquisitions. «Montant SRBC raisonnable» assez pour avoir au moins 10 GRM par cellule et pas trop nombreux pour empêcher les GRM externes de masquer les phagosomes.
En outre, il est important d'optimiser les conditions d'opsonisation pour assurer qu'il y aura une reconnaissance efficace et l'absorption par les cellules. La phagocytose FcR-médiée est constitutive et hMDMs sont régulièrement très efficace dans l'absorption FcR-médiée. En outre, pour un bon phagocytose, les conditions ont à be optimale avec la chambre de chauffage à 37 ° C et 5% de CO 2. Il est nécessaire de vérifier le gaz et la température avant de commencer le test de phagocytose.
Enfin, la discrimination des globules rouges externes à partir phagosomes internes et l'identification du noyau dans le canal BF sont importants pour l'analyse du logiciel ImageJ. Ceci est la raison pour laquelle les paramètres de ce canal sont importants. Étant donné que la mise au point peut être perdue lors de l'acquisition, nous vous recommandons d'acquérir des piles d'images dans l'axe Z pour être sûr d'avoir le plan optimal pour analyser la vitesse de phagosome. Il est préférable d'avoir une seule cellule dans un champ à analyser tous les GRM intériorisées pour chaque cellule. Voilà pourquoi le choix de l'objectif est important et ici, nous avons utilisé 2 lentilles en fonction de la taille des cellules. Il était plus facile pour nous de suivre phagosomes avec un objectif 100X, mais parfois, les cellules étaient trop grands pour que nous devions passer à un objectif 63X. Le choix de la lentille est également critique en pensant à iml'analyse de l'âge en utilisant ImageJ et une table de feuille de calcul parce que les deux lentilles impliquent différents x / étalonnages y.
La première limitation de cette technique est le nombre d'échantillons qui doivent être acquises pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Nous pouvons enregistrer plusieurs films par donneur, mais généralement pas plus de 2 cellules par condition, par boîte. Les solutions à cette limitation pour augmenter le nombre d'échantillons sont à répéter des expériences avec d'autres bailleurs de fonds ou de faire multi-point XY imagerie selon le microscope. L'inconvénient de la dernière méthode est la perte potentielle de mise au point lors de la numérisation XYZ motorisé. Une autre limitation est que la quantification de la vitesse manuelle est longue et fastidieuse, comparativement à une analyse automatisée. Pour une analyse complète automatisée, il est nécessaire d'utiliser des particules marquées par fluorescence, tel que rapporté dans les études pionnières 4 avec des billes de latex couplées à la gélatine de peau de poisson qui ont été suivies avec un algorithme de suivi sur le logiciel MatLab. Opsonisation des anticorps marqués par fluorescence ou des billes pourrait être une alternative, mais elles sont soumises à un blanchiment, ce qui est un problème lors de l'enregistrement de la phagocytose pendant 1 heure. D' autres études rapportent l'utilisation de billes de latex 13,14. Nous avons remarqué cependant que l'intériorisation de billes de latex est moins facilement détecté que l'absorption de GRM. En effet, le point de la cinétique de la migration intracellulaire de départ est important de savoir à détecter les premiers défauts de mouvement phagosome.
Le principal avantage de la méthode décrite ici est sa simplicité et l'utilisation d'un logiciel libre. Pour effectuer le suivi manuel en utilisant le logiciel ImageJ, nous devons utiliser la position du phagosome et le noyau, par conséquent, nous avons besoin d'utiliser le théorème de Pythagore pour calculer la distance entre le phagosome et le noyau, et d'avoir la vitesse après une régression linéaire dans le logiciel de tableur. Cette analyse en 3 étapes peut être réduite à une seule étape, le suivi, le logiciel de ICY avec le & #34;. Tracking Manuel "plug-in Les données de sortie sont alors directement la vitesse de la particule à suivre, et plus particulièrement la vitesse relative entre 2 groupes (tels que phagosomes et noyau) Enfin, le calcul nous permet de mesurer la vitesse relative de. une particule par rapport à une autre particule qui peut également être en mouvement.
L'application potentielle future de cette analyse time-lapse vie peut être pour les particules visibles dans le champ lumineux, comme les bactéries, les champignons, ou les débris cellulaires. Différents traitements ou des conditions d'infection suffisantes pour modifier phagosome maturation et les propriétés d'activation des macrophages bénéficieraient d'une telle analyse fine des mouvements phagosomale vers le centre de la cellule.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | For viral production |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | For acquisition |
| Falcon Tissue Culture Plates 6-well | Thermo Fischer Scientific | Corning. Inc. 353934 | For human monocyte-derived macrophages |
| Ficoll-Plaque PLUS | Dominique Dutscher | 17-1440-03 | a neutral, highly branched, high-mass, hydrophilic polysaccharide in solution for density centrifugation |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | RT |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x, liquid (High Glucose) | GIBCO, Molecular probes | 31966-021 | Conserved at 4 °C ; for HEK cells culture |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | Conserved at 4 °C; for hMDMs culture |
| Fœtal Calf Serum (FCS) | Eurobio | CVFSVF0001 | Conserved at -20 °C ; decomplemented |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fischer Scientific | 15140-122 | Conserved at -20 °C ; for hMDMs culture |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10x 500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37 °C water bath before use ; for phagocytosis assay |
| FuGENE6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Conserved at 4 °C ; for viral production |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4 °C before use |
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | Conserved at 4 °C |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | Conserved at -20 °C |
| Inverted microscope DMI600 | Leica | ||
| Confocal Spinning Disk Unit CSU-X1M1 | Yokogawa | ||
| 491 nm 50 mW laser | COBOLT CALYPSO | ||
| HCX PL APO CS Objectif | Leica | Objective lens ; Magnification 100X ; Numerical aperture 1.40 ; Immersion oil | |
| CoolSnap HQ2 (FireWire) Camera | Photometrics | Pixel size 6.45 µm x 6.45 µm ; Definition 1,392 x 1,040 ; Encoding the image in 14 Bit | |
| Metamorph 7.7.5 software | Molecular Devices | For the control of the microscope | |
| GraphPad Prism software | For the statistics analysis |
References
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
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