Protocol
Das Protokoll muss in strikter Übereinstimmung mit nationalen und internationalen Gesetzen und örtlichen Vorschriften durchgeführt. Blut von gesunden Spendern, die ihre Zustimmung Blut für Forschungszwecke zu spenden gab wurde von Bluttransfusionszentren erhalten, mit denen die Institutionen Vereinbarung unterzeichnet haben. Besondere Schutzmaßnahmen getroffen werden müssen, wenn menschliches Blut verwendet wird. Experimente mit HIV-1 muss in einem Biosicherheitsstufe 3 oder 2 (BSL-3 oder 2) Labor nach den örtlichen Vorschriften durchgeführt werden.
1. Herstellung von Human-Monozyten abgeleiteten Makrophagen (hMDMs) durch Dichtegradientenzentrifugation und Auswahl durch Adhesion
- Beginnen Sie mit frischem Blut von gesunden Spendern (9 ml). Verdünne das gesamte Volumen von frischem Blut mit sterilem 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne Ca 2+ und Mg 2+ ein Endvolumen von 70 ml zu erhalten , und sanft das verdünnte Blut in zwei 50 ml konische Röhrchen (35 ml pro Röhrchen) hinzuzufügen , oben auf 15 ml eineutral, stark verzweigten, hoher Masse, hydrophile Polysaccharid in Lösung bereits in jedem Röhrchen.
- Zentrifuge beide Rohre von Blut bei 537 xg für 20 min bei 20 ° C ohne Bremse. Dann sammeln Sie die peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) in den bewölkten Zelle Ring an der Schnittstelle enthalten sind, und übertragen sie in eine neue 50 - ml - Röhrchen mit 15 ml 1x PBS ohne Ca 2+ und Mg 2+.
- Zentrifuge die Zellen bei 218 · g für 5 min bei 20 ° C und das Pellet in 45 ml 1x PBS ohne Ca 2+ und Mg 2+.
- Zentrifuge die Zellen bei 218 · g für 5 min bei 20 ° C, Resuspendieren des Pellets in 10 ml 1x PBS ohne Ca 2+ und Mg 2+ und die Zellen zählen , indem zu einer Endverdünnung von 1/200 in Trypan Blau verdünnt.
- Zentrifugieren der Zellen bei 218 xg für 5 min bei 20 ° C und das Pellet in RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640-Medium, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin und 100 ug / ml Penicillin-Streptomycin 7 x 10 6 PBMCs in 2 ml Medium in jeder Vertiefung einer 6 - Well-Platte pro Vertiefung zu haben.
- Inkubiere die Platten bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 2 Std. Nach 2 Stunden wird die Monozyten an den Kunststoff eingehalten.
- Damit frisch isolierten Monozyten in hMDMs zu unterscheiden, aspirieren das Medium und ersetzen Sie es mit 2 ml hMDM Medium (RPMI 1640, 10% decomplemented Fetale Kälberserum (FCS), 2 mM L-Glutamin und 1% Penicillin-Streptomycin), ergänzt mit rekombinantes humanes M-CSF (RHM-CSF) in einer Endkonzentration von 10 ng / ml.
- Inkubieren der Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 11 Tage (Abbildung 1).
- Am Tag 11 das Medium abgenommen und gewaschen werden 2 mal mit 2 ml kaltem hMDM Medium pro Vertiefung. Weiter waschen jeder Vertiefung 2 mal mit 1 ml kaltem 1x PBS.
- Zum Abnehmen ausdifferenzierten hMDMs, waschen Sie sich gut 1 mal mit 1 ml kaltem 1x PBS mit 2 mM ethylenediaminetetraacetatic Säure (EDTA) und die Zellen in 2 ml kaltem 1x PBS mit 2 mM EDTA pro Vertiefung für 15-60 min bei 4 ° C inkubieren.
HINWEIS: Alternative Methoden die Zellen existieren (zB Trypsin oder Trypsin-ähnliche Aktivitäten) zu lösen , die gute Ergebnisse 11 geben könnte. - Nach Ablösung (wird von sanft bis Pipettieren und nach unten in das Bohrloch), um die Zellen zu sammeln und sie in einem 50-ml-Röhrchen auf Eis 10 ml kaltem hMDM Medium enthält.
- Zentrifuge die Zellen bei 218 · g für 5 min bei 20 ° C, das Pellet in 10 ml kaltem hMDM Medium und die Zellen zählen, indem 1/20 in Trypan Blau verdünnt.
- Seed die Zellen bei 1 x 10 6 hMDMs pro 35 mm Mikroskopie Glasbodenschale und Inkubation der Platten bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 1 Tag.
2. Herstellung und Quantifizierung von HIV-1-Virus Stocks
HINWEIS: NLR4.3 HIV-1 Gag-iGFP (Green Fluorescent Protein) trägt eine R5-trop Umschlag, Geschenk von M. Schindler 10 wird verwendet , Makrophagen zu infizieren und infizierte Zellen in Echtzeit zu sehen.
- Produzieren viralen Bestände durch Transfektion von humanen embryonalen Nieren 293T Zellen (2 x 10 6 in 100 - mm - Schale) mit 6 ug des entsprechenden provirale DNA Kommerzielle Transfektionsreagenz verwenden.
- Quantifizierung der Infektiosität der Virusstämme mit den Indikatorzellen HeLa TZM-bl (das ß-Galactosidase-Gen unter der Kontrolle des HIV-1 LTR trägt) unter Verwendung von seriellen Verdünnungen der viralen durch eine ß-Galactosidase Färbung der Zellen und das Zählen gefolgt Bestände der blauen Zellen 12.
3. Die Infektion von hMDMs mit HIV-1
- Füge das Virus bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,02 bis 0,03 in 1 ml Medium zu hMDM hMDMs (plattierten Zellen in 1,13). Um zu steuern , Brunnen hinzufügen nur 1 ml hMDM Medium und Inkubation das Geschirr bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 2 Tage (Abbildung 1).
- Am Tag 2 waschen Sie die Zellen mit hMDM medium 3 Mal und 1 ml frisches hMDM Medium pro Schale. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 6 Tage (Abbildung 1).
4. Opsonisierung von roten Blutkörperchen vom Schaf
- Zur Herstellung von 7 x 10 6 pro Schale SRBCs, wäscht den SRBCs zweimal in 100 ul Lösung , die 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) in 1x PBS mit Zentrifugation bei 600 xg für 4 min enthält.
- Resuspendieren der gewaschenen SRBCs in 500 ul 1x PBS / BSA 0,1% mit Kaninchen-IgG anti-SRBCs bei einer sub-agglutinierende Konzentration pro 5 ul SRBCs und Inkubation für 30 min mit Rotation bei RT.
HINWEIS: Um die Unter agglutinierend Konzentration von anti-SRBCs IgG, bereiten serielle Verdünnungen von IgG (Stammkonzentration bei 13,1 mg / ml) von 1/50 bis 1 / 25.600 in 20 & mgr; l in einer 96-Well-Platte bestimmen. In 2 x 10 6 SRBCs in 20 & mgr; l in jede Vertiefung und stellte den Teller in einem dunklen Raum während mehrerer Stunden. Der Teil agglutinierende Konzentration ist dieVerdünnung der gut, kurz bevor die gut mit Agglutination (IgG + SRBCs ein Netzwerk bilden). - Nach der Drehung Zentrifugation der IgG-opsonisierter-SRBCs bei 600 × g für 4 min und Waschen mit 100 ul 1x PBS / BSA 0,1% mit Zentrifugation bei 600 × g für 4 min.
- Resuspendieren der IgG-opsonisiertes-SRBCs in vorgewärmten Phenolrot-freiem RPMI-Medium mit 2 mM L-Glutamin und 1% Penicillin-Streptomycin (1 ml / Schale).
5. Live Cell Videomikroskopie Phagozytose Assay
- Verwenden eines konfokalen Abbildungssystems , wie beispielsweise einem Spinnplattensystem mit einer Heizkammer ausgerüstet bei 37 ° C mit CO 2 mit Wasser für die Befeuchtung durch eine Flasche vorbei.
- Schalten Sie die Heizkammer vor dem Experiment das Mikroskoptisch zu haben, bei 37 ° C vor dem Beginn des Phagocytose-Assay. Schalten Sie das Mikroskop und Computer, und laden Sie die Bildbearbeitungssoftware.
- Optimieren Sie die Imaging-Einstellungen wie Scangeschwindigkeit, magnificatIon, Auflösung usw. mindestens eine Zelle pro Feld zu haben und Bild eine jede Minute zwischen 60 bis 120 min - Rahmen.
HINWEIS: Hier wird die Probe ein Rahmen jede Minute während 60 min mit 63X Objektiv abgebildet wird. - Setzen Sie die Druckschale auf dem Mikroskoptisch. Stellen Sie den Fokus und die Lage zu finden, nur eine ganze HIV-1-infizierten Makrophagen in das Feld ein. Verwenden Sie geeignete Anregungs- / Emissions-Einstellungen auf der Basis des verwendeten Abbildungssystems und der Sonde. Fügen Sie ein helles Feld (BF) Kanal phagosomes (Abbildung 1II) zu beobachten. Optimieren das Aussehen der verschiedenen Kanalbilder, indem der Prozentsatz von durchgelassenem Licht und die Belichtungszeit eingestellt wird.
HINWEIS: Hier NLR4.3 HIV-1 Gag-iGFP war begeistert , eine 491 - nm - Laser mit 50 ms Zeitbelichtung mit 20% der Laser (Abbildung 1 i) verwendet wird . - Nehmen Sie die Bildschale und 1 ml SRBC - Suspension bei 7 x 10 6 SRBCs / ml in die Schale (Abbildung 1).
- Zentrifuge bei 500 × g für2 min bei RT Phagozytose, notieren Sie die Zeit am Ende dieser Zentrifugation und Rück die Schale auf die Bühne zu synchronisieren.
- Optimierung des Fokus und capture GFP und BF Bilder in Z-Stapel (über die Dicke der Zelle mit einem Schritt-Abstand von 0,3 um - in der Regel 20-Ebenen) mindestens 1 Stunde jede Minute für. Speichern Sie die Zeitraffer-Video im nativen Dateiformat des verwendeten Abbildungssystems.
HINWEIS: Hier Zeitraffer-Filme im nativen Format gespeichert wurden, * .STK Dateien.
6. Die Analyse der Zeitraffer-Filme
- Für Videobearbeitung, klicken Sie auf das Dropdown-Menü "Apps" und auf der Registerkarte "Bewertungs Multi Dimensional Data" in der Video-Editing-Software.
- Um die Datei zu öffnen, klicken Sie auf "Select Base-Datei" und dann auf "Select Directory". In der "Datensätze" Feld, wählen Sie den Erwerb (in .ND-Format) zu analysieren, und klicken Sie auf "Ansicht". Die Daten werden in einer Tabelle mit der Zeit in der Spalte ein repräsentiertd Z-Plan in der Leitung.
- Um die Infektion in einer Z-Projektion darstellen (Abbildung 2, links Platten), wählen Sie 491 nm Wellenlänge im "Wavelengths" und klicken Sie auf den "Z Projektion" Tab mit "allen Ebenen".
- Um eine zeitliche Abfolge analysieren, BF Wellenlänge im "Wavelengths" ein und wählen Sie die optimale Ebene , auf der Z-Achse wählen zu externen SRBCs unterscheiden (Abbildung 2, roten Pfeilspitze), interne SRBCs (Abbildung 2, roter Kreis) und den Kern ( Abbildung 2, blauer Kreis).
- Um die Videomontagen speichern, klicken Sie auf "Auswahl [X]" und dann auf "Load Image (s)". Schließlich die geladenen Bilder in .tif-Format speichern und Software als nächstes auf ImageJ öffnen.
- Verwenden Sie das Plugin "Manuelle Spur" auf der ImageJ Software die Position des Kerns und die verschiedenen phagosomes in BF Kanal (Abbildung 3) beobachtet zu messen.
- Download das "Manual-Tracking" Plugin auf der ImageJ Website. Auf ImageJ, öffnen Sie das Plugin und die Bildfolge analysiert werden (Abbildung 3, Schritt 1 und 2).
- Geben Sie die Einstellungen wie "Time Interval" , die zwischen benachbarten Rahmen Höhe der Zeit darstellt und die "x / y - Kalibrierung" , die den Abstand pro Pixel darstellt (Abbildung 3, Schritt 3).
HINWEIS: Hier speichern Sie die Bildfolge mit einem Zeitintervall von 1 Minute zwischen jedem Rahmen und x / y Kalibrierung von 0,205 & mgr; m , da die 63X - Zoom und eine Kamera mit Pixelgröße von 6,45 x 6,45 & mgr; m 2 verwendet werden. - Um die Verfolgung zu starten, klicken Sie auf "Add Track" (Abbildung 3, Schritt 4) und klicken Sie auf ein SRBC Zentrum beim ersten Mal , wenn er internalisiert wird. Das nächste Bild erscheint automatisch.
- Weiter auf der SRBC - Center in allen Frames klicken verschiedenen Positionen während der Zeit zu haben (Abbildung 3, Schritt 6 im roten Kasten).
- Starten Sie den Kern zu verfolgen seine Position durch einen Klick auf das Zentrum in allen Frames zu haben. Spur folgen die phagosomes (durch seine Mitte zu klicken) nacheinander zu der Zeit (Rahmen) ihrer Verinnerlichung, unterscheidet sich in Abhängigkeit von SRBCs. Der Einfachheit halber SRBC auf BF - Kanal zu sehen, verwenden Sie die "Helligkeit und Kontrast" Fenster während der Tracking (Abbildung 3, Schritt 5).
- Zwischen jedem SRBC - Tracking, klicken Sie auf "Add Track" (Abbildung 3, Schritt 4) eine neue Spur zu haben. Die Anzahl der Tracking wird in der zweiten Spalte "Track n °" der Ergebnistabelle (Abbildung 3, Schritt 6) geändert werden.
- Speichern der Daten in einer Tabelle mit dem nächsten Schritt der Analyse fortzusetzen.
- Verwenden , Tabellenkalkulationssoftware , die zurückgelegte Strecke von Phagosomen enthält SRBCs Richtung Kern und der Geschwindigkeit der Phagosomen während der ersten 5 min nach der Internalisierung von SRBCs zu berechnen (FiAbbildung 4).
- Öffnen Sie die Tabelle Tabelle und eine neue Tabellenkalkulationsdatei. Transfer in diese neue Datei nur die folgenden Parameter, die Zeit, die x- und y- Koordinate des Kerns und alle SRBCs (4A).
- Um den Abstand zwischen SRBCs berechnen und den Kern nur mit ihren Koordinaten betrachten den Kern und einen SRBC in einem XY-Koordinatenebene (4B).
HINWEIS: Der Abstand zwischen zwei Punkten ist die Länge der Strecke, die sie verbinden. In der Ebene wird der Abstand zwischen SRBC und dem Kern durch den Satz des Pythagoras gegeben.- Wenn c (der Abstand zwischen dem Kern und dem SRBC) , um die Länge der Hypotenuse und A und b die Längen der beiden anderen Seiten bezeichnen exprimieren Pythagoras 'Theorem als pythagoreischen Gleichung:
HINWEIS: In der gleichen Zeit auf der orthonormal, der horizontale Abstanda (x - x Kern SRBC) und der vertikale Abstand b (y -y Kern SRBC). - So berechnen Sie den Abstand zwischen dem Kern und dem SRBC (4A, lila Box) von:
HINWEIS: Multiplizieren der Wert, der Abstand (in Pixeln) von x / y-Kalibrierung den Abstand in & mgr; m zu haben. Hier wird die x / y-Kalibrierung ist 0,205 & mgr; m. - Zu jedem Zeitpunkt, zu subtrahieren , den Abstand zwischen dem Kern und dem SRBC auf den Anfangsabstand (4C).
- Zeichnen Sie die Messung gegen die Zeit für den ersten 5 min. Tragen Sie eine lineare Trendlinie (5A) auf dem Grundstück und bestimmen die Steigung der linearen Trend-Linie, die die phagosome Geschwindigkeit in Richtung des Kerns während der ersten 5 Minuten nach der SRBC Internalisierung darstellt.
- Collate die Daten den Durchschnitt und die statistischen Fehler von zu berechnendie Geschwindigkeitswerte und sie in geeigneter Form zeichnen die entsprechende Software (5B) verwendet wird .
- Wenn c (der Abstand zwischen dem Kern und dem SRBC) , um die Länge der Hypotenuse und A und b die Längen der beiden anderen Seiten bezeichnen exprimieren Pythagoras 'Theorem als pythagoreischen Gleichung:
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Representative Results
FcR-vermittelte Phagozytose durch HIV-1-infizierten und nicht-infizierten hMDMs wird hier beschrieben unter Verwendung von IgG-opsonisiertes SRBCs als Modellzielen (Abbildung 1). Die kritischen Schritte dieses Protokolls sind die Herstellung von hMDMs und die Infektion mit HIV-1. Tatsächlich variiert die Ausbeute und die Qualität der differenzierten Makrophagen unter den Gebern sowie die Infektionsrate mit einem Wirkungsgrad im Bereich von 10-40%. Darüber hinaus ist die Herstellung von IgG-opsonisiertes-SRBCs auch wichtig, um die Erythrozyten nicht zu beschädigen, weil dies ihre Erkennung induzieren könnten und als Schutt statt durch FcR-vermittelte Phagozytose Aufnahme. Optimale opsonization wird effizient Phagozytose gewährleisten.
Phagosom Bewegung HIV-infizierten Makrophagen in lebenden in Echtzeit mit dem BF-Kanal auf einer sich drehenden Scheibe konfokalen Mikroskop in der BSL-3 Labor analysiert. Die Einstellungen des BF Kanals sind kritisch tsiehe o den Kern (Abbildung 2, blauer Kreis) und zur Unterscheidung der externen (Abbildung 2, rote Pfeile) von den internalisierten SRBCs (Abbildung 2, rote Kreise). Die BF-Mikroskopie ist als einfachste optische Mikroskopie Beleuchtungstechnik betrachtet die Phagosomen ausreichend, um zu sehen, die weniger refringent als die Außen SRBCs.
Der erste Schritt nach der Erfassung von Bildsequenzen ist die manuelle Abtastung auf der ImageJ Software (Abbildung 3). Dieser Punkt ist besonders lang und mühsam sein, da es bevorzugt ist, jeden phagosome zu verfolgen, nacheinander für alle Bildsequenzen und es wird angenommen, dass Versuche mit mindestens 3 Donoren wiederholt werden müssen pro Zustand eine ausreichend große Probengröße zu erreichen statistische Analyse (mindestens 30 Phagosomen mit 3 verschiedenen Spendern).
Der zweite Schritt ist die Analysein Tabellenkalkulationssoftware Phagosom Geschwindigkeit während der ersten 5 min nach der Internalisierung für jede internalisiert SRBCs (Figur 4) zu berechnen. Dafür haben wir für jeden phagosome plotten der Abstand während der ersten 5 Minuten gegen die Zeit gereist. Ein repräsentatives Beispiel ist in nicht infizierten hMDMs auf 5A gezeigt. Als nächstes erhält man die Geschwindigkeit des phagosome, die die Steigung der linearen Regressionskurve ist. Eine Geschwindigkeit von 0,5384 & mgr; m / min wurde für diesen phagosome gefunden.
Bemerkenswert ist es möglich , die phagosome Geschwindigkeit während der ersten paar Minuten nach der Internalisierung zu analysieren, wie hier oder in Dumas et al. 8 beschrieben, oder später durch die Geschwindigkeit über längere Zeiträume zu analysieren. In unserer Studie beobachteten wir , dass die phagosome Geschwindigkeit während der ersten 5 Minuten nach der Internalisierung bei HIV-infizierten hMDMs ist niedriger im Vergleich zu nicht-infizierten hMDMs (5B).
Figure 1. Herstellung von Kontroll- und HIV-infizierten hMDMs für Phagozytose Bildgebung. Monocyten durch Adhäsion gereinigt (1) und differenziert zu Makrophagen für 11 Tage mit M-CSF (2). Als nächstes werden hMDMs infiziert mit HIV-NLR4.3 1Gag-iGFP i) bei einer MOI von 0,02 und 0,03 für 8 Tage mit dem Waschen am Tag 2 (3). (4) IgG-opsonisiertes SRBCs werden auf hMDMs für Phagozytose während 1 h zugegeben. Die phagosomes enthält SRBCs nachweisbar sind auf BF Bilder (roter Kreis, ii). Die Bilder sind von der Servier Bilddatenbank. Bar = 10 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Echtzeit - Erfassung währendPhagozytose durch repräsentative Kontrolle und HIV-infizierten hMDMs. hMDMs hergestellt und infiziert wie in Figur 1 beschrieben. Die NLR4.3 HIV-1Gag-iGFP infizierten Zellen mit dem 491 - nm - Laser detektiert werden. Z-Stapel von Kreiselscheibenapplikators konfokalen Bildern erfasst und analysiert sowohl die Mikroskop-Erfassungssoftware und ImageJ (linke Felder) verwenden. Galerien von BF Bilder stellen eine nicht-infizierten (oben Platten Film 1 entspricht) und eine NLR4.3 HIV-1Gag-iGFP infiziert (Bodenplatten auf Movie 2 entspricht) Zelle während einer 45 min Akquisition (46 Bilder mit der Zeit als hh angegeben : mm). Die Zellmembran (gestrichelte schwarze Linie), der Kern (blauer Kreis), die externen SRBCs (einige von ihnen mit roten Pfeilen gekennzeichnet) und die internen SRBCs (einige von ihnen mit roten Kreisen gekennzeichnet) sind auf BF Bilder nachweisbar. Bar = 10 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Anweisungsschritte für die Bildanalyse mit manueller Tracking - Plugin auf ImageJ. Nach dem Öffnen des "Manual - Tracking" Plug -in (1) und das Laden der Zeitraffer-Video in BF Kanal (2), geben Sie die Parameter des Erwerbs (3). Klicken Sie auf "Add Track" (4) und die Messung der Verfolgung, indem Sie auf ein phagosome klicken (5) ein neues Fenster mit X- und Y-Positionen des gewählten phagosome (6, rotes Feld) zu erhalten. Um die phagosome auf die zeitliche Abfolge für die Bequemlichkeit folgen, variieren die Helligkeit und den Kontrast (5 '). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Zahl 4. Anweisungsschritte für die Datenanalyse von phagosome Migrationsgeschwindigkeit in Tabellenkalkulations - Software. (A) Montieren Sie die X- und Y - Position des Kerns und jedes phagosome (rotes Feld) in einem Tabellenkalkulationstabelle. In einer anderen Spalte (purple box), die Berechnung der Entfernung zwischen dem phagosome und dem Kern mit Pythagoras 'Theorem wobei c die Länge zwischen dem Kern und dem SRBC und a und b die Längen der anderen zwei Seiten eines rechtwinkligen Dreiecks darstellt ( B). (C) Schließlich berechnen Sie die Entfernung von den Phagosomen zu jeder Zeit gereist (green box) durch den Abstand zwischen dem SRBC subtrahieren und den Kern zu einem bestimmten Zeitpunkt von der Anfangsabstand zum Zeitpunkt 0 Bitte hier klicken , um eine größere Version zu sehen diese Figur.
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Abbildung 5 : Quantifizierung der phagosome Wanderungsgeschwindigkeit in Kontroll- und HIV-infizierten hMDMs. (A) Für jeden SRBC und kurz nach SRBC Internalisierung, die zurückgelegte Strecke in Richtung des Kerns wird gemessen und gegen die Zeit aufgetragen. Seine Geschwindigkeit während der ersten 5 min berechnet lineare Regression in Tabellenkalkulationssoftware. Ein repräsentatives Experiment ist gezeigt (die interne SRBC von Abbildung 3-4). (B) Alle Geschwindigkeiten während der ersten 5 Minuten für 66 phagosomes in nicht-infizierten (5 Spendern) gemessen und 60 phagosomes in HIV-infizierten Zellen (4 Spendern). Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM (ungepaarte Student t - Test mit Welch Korrektur; **, P <0,01). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Film 1: Phagosomen Bewegung in einer repräsentativen nicht-infizierter Makrophagen. . (Rechts zum Download klicken) Die Bewegung der opsonisierter roten Blutkörperchen wurde in BF Kanal während 45 min von Phagozytose mit einem Bild pro Minute (: mm 46 Bilder mit der Zeit angegeben als hh) nachgewiesen. Bar = 10 & mgr; m.
Film 2: Phagosomen Bewegung in einer repräsentativen HIV-infizierten Makrophagen. (Rechtsklick zum Herunterladen). HIV-1 (NLR4.3 HIV-1 Gag iGFP) infizierten Makrophagen nach der Beleuchtung mit dem 491 Laser identifiziert wurden. Die Bewegung der opsonisierter roten Blutkörperchen wurde in BF Kanal während 45 erfasstmin von Phagozytose mit einem Bild pro Minute (46 Bilder mit der Zeit angegeben als hh: mm). Bar = 10 & mgr; m.
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Discussion
Diese Technik hat mehrere wichtige Schritte. Zum einen ist die Herstellung von hMDMs und ihre Infektion durch HIV-1 wichtig, da der Prozentsatz der Infektion Spender abhängt. Bemerkenswert ist , haben wir beschlossen , Makrophagen zu verwenden , die in vitro vor der Infektion nicht polarisiert sind, weil der Status der Makrophagen durch das Virus in vivo angetroffen möglicherweise nicht gut , so weit charakterisiert. Wir überprüften die Expression verschiedener Oberflächenmarker, was darauf hinweist, dass die Makrophagen sind weder M1 noch M2, und überprüft die Expression von CD4 und CCR5. Die Infektionsraten sind variabel und liegen im Bereich von 10 bis 40%, und manchmal niedriger. Diese Variable Infektionsrate ist, warum es schwierig sein kann, einen HIV-1-infizierten fluoreszierenden hMDM unter dem Mikroskop zu finden. Darüber hinaus benötigt die Zeit, um eine HIV-1-infizierten Zelle unmittelbar nach dem Zentrifugationsschritt auch beim Starten der Erwerb zu einer Verzögerung führen kann, zu finden. Phagozytose konnte ohne synchronizatio eingeleitet werdenn der Bindung und Aufnahme durch Zentrifugation erzeugt. Allerdings wurde diese Option nicht für SRBCs ausgewählt, die vor dem Erreichen der Zellen schweben. Es könnte eine gute Option, mit Perlen sein. Um die Zeit zu minimieren benötigt, um infizierte Zellen zu finden, gridded Boden Glasschalen könnten verwendet werden, um HIV-1-infizierten hMDMs identifizieren, bevor Sie das Phagozytose Test zu starten. Die ausgewählten HIV-infizierten Zellen, die eine "vernünftige" Anzahl der SRBCs um sie herum wird dann schnell die Akquisitionen zu starten gewählt werden. "Angemessene SRBC Menge" genug, um mindestens 10 SRBCs pro Zelle zu haben und nicht zu viele der externen SRBCs zu verhindern, dass die phagosomes maskieren.
Darüber hinaus ist es wichtig, die Opsonisierung Bedingungen zu optimieren, um sicherzustellen, wird eine effiziente Erkennung und Aufnahme durch die Zellen. Die FcR-vermittelte Phagozytose ist konstitutiv und hMDMs sind routinemäßig sehr effizient bei der FcR-vermittelten Aufnahme. Darüber hinaus ist für korrekte Phagozytose, müssen die Bedingungen Be optimal mit der Heizkammer bei 37 ° C und 5% CO 2. Es ist notwendig, das Gas und die Temperatur vor dem Start der Phagocytose-Assay zu prüfen.
Schließlich wird die Diskriminierung der externen SRBCs aus internen Phagosomen und die Identifizierung des Kerns in der BF-Kanal sind wichtig für die Analyse auf der ImageJ Software. Deshalb ist die Einstellung dieses Kanals sind wichtig. Da sich der Fokus während der Aufnahme verloren gehen, empfehlen wir Stapel von Bildern in der Z-Achse zu erwerben, um sicherzustellen, um die optimale Ebene zu haben phagosome Geschwindigkeit zu analysieren. Es ist bevorzugt, eine einzelne Zelle in einem Bereich haben alle verinnerlicht SRBCs für jede Zelle zu analysieren. Deshalb ist die Linsen Wahl ist wichtig, und hier haben wir zwei Linsen als Funktion der Zellgröße eingesetzt. Es war für uns einfacher phagosomes mit einer 100X Objektiv zu verfolgen, aber manchmal sind die Zellen waren zu groß, so dass wir zu einem 63X Objektiv zu wechseln. Die Wahl des Objektivs ist auch entscheidend, wenn es um im DenkenAltersanalyse mit ImageJ und eine Tabelle Tabelle, da beide Linsen unterschiedliche x / y-Kalibrierungen verwickeln.
Die erste Einschränkung dieser Technik ist die Anzahl der Proben, die zu haben, um statistisch signifikante Ergebnisse erworben werden müssen. Wir können mehrere Filme pro Spender registrieren aber in der Regel nicht mehr als 2 Zellen pro Bedingung, pro Schale. Die Lösungen für diese Einschränkung die Anzahl zu erhöhen Proben sind Experimente mit mehreren anderen Gebern zu wiederholen oder Mehrpunkt-XY-Bildgebung in Abhängigkeit von dem Mikroskop zu tun. Die Unannehmlichkeiten der letzten Methode ist der mögliche Verlust der Fokus bei motorisierten XYZ-Scanning. Eine weitere Einschränkung ist, dass die manuelle Quantifizierung der Geschwindigkeit ist lang und mühsam im Vergleich zu einer automatischen Analyse. Für vollständige automatisierte Analyse ist es notwendig , fluoreszenzmarkierte Partikel zum Einsatz kommen , wie in pionierhaften Studien 4 mit Latexkügelchen gekoppelt Fischhautgelatine berichtet , die mit einem Tracking - Algorithmus auf Matlab - Software verfolgt wurden. Fluoreszenzmarkierten Antikörper oder Kügelchen Opsonisieren könnte eine Alternative sein, aber sie unterliegen Bleichen, was ein Problem ist, wenn für 1 h Phagozytose aufnehmen. Andere Studien berichten über die Verwendung von Latexkügelchen 13,14. Wir bemerkten jedoch, dass die Internalisierung von Latexkügelchen weniger leicht als die Aufnahme von SRBCs erkannt wird. Tatsächlich ist der Ausgangspunkt der Kinetik der intrazellulären Migration ist wichtig zu wissen, frühzeitig Defekte in phagosomalen Bewegung zu erkennen.
Der Hauptvorteil des hier beschriebenen Verfahrens ist seine Einfachheit und die Verwendung eines freie Software. Zur Durchführung der manuelle Verfolgung der ImageJ-Software, haben wir die Position des phagosome und den Kern zu verwenden, so müssen wir Satz des Pythagoras berechnet den Abstand zwischen dem phagosome und den Kern, und haben die Geschwindigkeit nach einer zu verwenden lineare Regression in Tabellenkalkulations-Software. Diese drei Schritte Analyse kann auf einen Schritt reduziert werden, die Tracking, auf ICY-Software mit der & #34;. Manuell-Tracking "Plugin Die Ausgangsdaten werden dann direkt die Geschwindigkeit des Teilchens zu folgen, und insbesondere die Relativgeschwindigkeit zwischen zwei Gruppen (wie Phagosomen und Nucleus) Schließlich wird die Berechnung ermöglicht es, die Relativgeschwindigkeit zu messen. ein Teilchen im Vergleich zu anderen Teilchen, das ebenfalls bewegt werden kann.
Die mögliche künftige Anwendung dieser Lebens Zeitraffer-Analyse kann für Partikel sichtbar im hellen Bereich sein, wie Bakterien, Pilzen oder Zelltrümmer. Verschiedene Behandlungen oder Infektionsbedingungen ausreichend phagosomalen Reifung und die Aktivierungseigenschaften von Makrophagen profitieren von solch einer genaueren Analyse der phagosomalen Bewegung in Richtung der Zellmitte würde zu ändern.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | For viral production |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | For acquisition |
| Falcon Tissue Culture Plates 6-well | Thermo Fischer Scientific | Corning. Inc. 353934 | For human monocyte-derived macrophages |
| Ficoll-Plaque PLUS | Dominique Dutscher | 17-1440-03 | a neutral, highly branched, high-mass, hydrophilic polysaccharide in solution for density centrifugation |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | RT |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x, liquid (High Glucose) | GIBCO, Molecular probes | 31966-021 | Conserved at 4 °C ; for HEK cells culture |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | Conserved at 4 °C; for hMDMs culture |
| Fœtal Calf Serum (FCS) | Eurobio | CVFSVF0001 | Conserved at -20 °C ; decomplemented |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fischer Scientific | 15140-122 | Conserved at -20 °C ; for hMDMs culture |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10x 500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37 °C water bath before use ; for phagocytosis assay |
| FuGENE6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Conserved at 4 °C ; for viral production |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4 °C before use |
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | Conserved at 4 °C |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | Conserved at -20 °C |
| Inverted microscope DMI600 | Leica | ||
| Confocal Spinning Disk Unit CSU-X1M1 | Yokogawa | ||
| 491 nm 50 mW laser | COBOLT CALYPSO | ||
| HCX PL APO CS Objectif | Leica | Objective lens ; Magnification 100X ; Numerical aperture 1.40 ; Immersion oil | |
| CoolSnap HQ2 (FireWire) Camera | Photometrics | Pixel size 6.45 µm x 6.45 µm ; Definition 1,392 x 1,040 ; Encoding the image in 14 Bit | |
| Metamorph 7.7.5 software | Molecular Devices | For the control of the microscope | |
| GraphPad Prism software | For the statistics analysis |
References
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Niedergang, F. Encyclopedia of Cell Biology. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).
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