Protocol
Het protocol heeft uitgevoerd in strikte overeenstemming met de nationale en internationale wetgeving en de plaatselijke voorschriften worden uitgevoerd. Bloed van gezonde donoren die hun toestemming om bloed te doneren voor onderzoeksdoeleinden gaf is verkregen van Bloedtransfusie Centers waarmee de instellingen overeenkomst hebben ondertekend. Speciale bescherming moeten worden genomen bij het gebruik van menselijk bloed. Experimenten met HIV-1 moet worden uitgevoerd in een bioveiligheid niveau 3 of 2 (BSL-3 of 2) laboratorium volgens de plaatselijke wetgeving.
1. Bereiding van Human monocyt-afgeleide macrofagen (hMDMs) door dichtheidsgradiëntcentrifugatie en selectie door Adhesie
- Begin met vers bloed van gezonde donoren (9 ml). Verdun het hele volume vers bloed met steriele 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder Ca2 + en Mg2 + om een eindvolume van 70 ml te verkrijgen en voorzichtig het verdunde bloed toe in twee 50 ml conische buizen (35 ml per buis) bovenop 15 ml van eeneutral, sterk vertakte, zwaardere hydrofiele polysaccharide in oplossing reeds in elke buis.
- Centrifuge twee buisjes bloed bij 537 xg gedurende 20 min bij 20 ° C zonder rem. Laat dan het perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) in de bewolkte cel ring aan de interface en overbrengen naar een nieuwe 50 ml buis met 15 ml 1x PBS zonder Ca2 + en Mg2 +.
- Centrifugeer de cellen bij 218 g gedurende 5 min bij 20 ° C en resuspendeer de pellet in 45 ml 1x PBS zonder Ca2 + en Mg2 +.
- Centrifugeer de cellen bij 218 g gedurende 5 min bij 20 ° C, resuspendeer de pellet in 10 ml 1x PBS zonder Ca2 + en Mg2 +, en tel de cellen door verdunnen tot een eindverdunning van 1/200 in trypan blauw.
- Centrifugeer de cellen bij 218 g gedurende 5 min bij 20 ° C en resuspendeer de pellet in RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 medium aangevuld met 2 mM L-glutamine en 100 ug / ml Penicillin-streptomycine tot 7 x 10 6 PBMC per putje hebben in 2 ml medium in elk putje van een 6 wells-plaat.
- Incubeer de platen bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 2 uur. Na 2 uur wordt de monocyten gehecht zijn aan de kunststof.
- Om vers geïsoleerde monocyten te differentiëren in hMDMs, zuig het medium en vervangen door 2 ml hMDM medium (RPMI 1640, 10% gedecomplementeerd foetaal kalfsserum (FCS), 2 mM L-glutamine en 1% penicilline-streptomycine), aangevuld met recombinant humaan macrofaag kolonie stimulerende factor (RHM-CSF) tot een eindconcentratie van 10 ng / ml.
- Incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 11 dagen (Figuur 1).
- Op dag 11 Verwijder het medium en was 2 keer met 2 ml koude hMDM medium per well. Was dan elk putje 2 maal met 1 ml koude 1x PBS.
- Om volledig gedifferentieerde hMDMs los te maken, wassen elk putje 1 keer met 1 ml koud 1x PBS met 2 mM ethylenediaminetetraacetatic zuur (EDTA) en incubeer de cellen in 2 ml koude 1x PBS met 2 mM EDTA per putje gedurende 15-60 min bij 4 ° C.
LET OP: Alternatieve methoden om los te maken van de cellen bestaan (bijvoorbeeld trypsine of trypsine-achtige activiteiten) die goede resultaten 11 kunnen geven. - Na onthechting (ingevuld door pipetteren voorzichtig op en neer in de put), het verzamelen van de cellen en zet ze in een 50 ml buis op ijs met 10 ml koud hMDM medium.
- Centrifugeer de cellen bij 218 g gedurende 5 min bij 20 ° C, resuspendeer de pellet in 10 ml koude hMDM medium en tel de cellen door verdunning van 1/20 in Trypan Blue.
- Zaad de cellen bij 1 x 10 6 hMDMs per 35 mm microscopie rangglas onderste schaal en incubeer de platen bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 1 dag.
2. Productie en kwantificatie van HIV-1 virale voorraden
LET OP: NLR4.3 HIV-1-Gag iGFP (Green Fluorescent Protein) het uitvoeren van een R5-troop envelop, gift van M. Schindler 10 wordt gebruikt om macrofagen te infecteren en de geïnfecteerde cellen in real time te zien.
- Produceren virale voorraden door transfectie van humane embryonale nier 293T-cellen (2 x 10 6 in 100 mm schaal) met 6 ug van het overeenkomstige provirale DNA onder toepassing van een commercieel transfectiereagens.
- Kwantificeren van de infectiviteit van het virus voorraden met de indicatorcellen HeLa TZM-bl (voorzien van de ß-galactosidase-gen onder de controle van HIV-1-LTR) via seriële verdunningen van de virale voorraden gevolgd door een ß-galactosidase kleuring van de cellen en telling van blauwe cellen 12.
3. Infectie van hMDMs met HIV-1
- Voeg het virus bij een multipliciteit van infectie (MOI) 0,02-0,03 in 1 ml medium hMDM tot hMDMs (cellen uitgeplaat in 1,13). Om controleputjes alleen toevoegen 1 ml hMDM medium en incubeer de schaaltjes 37 ° C met 5% CO2 gedurende 2 dagen (figuur 1).
- Op dag 2 was de cellen met hMDM medIUM 3 keer en voeg 1 ml vers hMDM medium per gerecht. Incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 6 dagen (figuur 1).
4. opsonisatie van rode bloedcellen van schapen
- Voor de bereiding van 7 x 10 6 SRBC's per schaal, twee maal wassen SRBC in 100 pl oplossing die 0,1% runderserumalbumine (BSA) in 1x PBS met centrifugeren bij 600 g gedurende 4 min.
- Resuspendeer de gewassen SRBC in 500 pl 1x PBS / BSA 0,1% met konijn IgG anti-SRBC een sub agglutinerende concentratie per 5 pl SRBC en incubeer met rotatie bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
Opmerking: Om de verder agglutinerende concentratie van anti-SRBC IgG bepalen bereiden seriële verdunningen van IgG (stock concentratie 13,1 mg / ml) van 1/50 tot 1 / 25.600 in 20 pi in een 96-wells plaat. Voeg 2 x 10 6 SRBC in 20 pl in elk putje gebracht en de plaat in een donkere kamer gedurende meerdere uren. De sub-agglutinerende concentratie deverdunning van de put net voor de put met agglutinatie (IgG + SRBC vormen een netwerk). - Na rotatie gecentrifugeerd IgG-opsonized-SRBC bij 600 g gedurende 4 minuten en wassen met 100 pl 1x PBS / BSA 0,1% van centrifugatie bij 600 g gedurende 4 min.
- Resuspendeer de IgG-opsonized-SRBC in voorverwarmde fenolrood-vrij RPMI medium aangevuld met 2 mM L-glutamine en 1% penicilline-streptomycine (1 ml / schaal).
5. Live-Cell Video Microscopie Phagocytosis Assay
- Gebruik een confocale beeldvormingssysteem zoals een draaiende schijf systeem voorzien van een verwarmingskamer bij 37 ° C met CO 2 die door een fles met water voor bevochtiging.
- Schakel de verhittingskamer voorafgaand aan het experiment om de microscoop podium bij 37 ° C voor het begin van de fagocytose assay. Zet de microscoop en de computer en laad de imaging software.
- Optimaliseer de imaging-instellingen, zoals scansnelheid, magnification, resolutie, etc. ten minste één cel per veld en beeld één frame per minuut 60 tot 120 min.
LET OP: Hier wordt het monster afgebeeld één frame per minuut gedurende 60 min met 63x lens. - Plaats de beeldvorming schotel op de microscoop podium. Pas de scherpstelling en de locatie tot één geheel HIV-1 geïnfecteerde macrofaag in het veld te vinden. Gebruik de juiste excitatie / emissie-instellingen op basis van de gebruikte imaging-systeem en sonde. Inclusief een heldere veld (BF) kanaal phagosomes observeren (Figuur 1ii). Optimaliseer het uiterlijk van de verschillende kanalen beelden door het aanpassen van het percentage doorgelaten licht en blootstellingstijd.
LET OP: Hier, NLR4.3 HIV-1-Gag-iGFP was enthousiast met behulp van een 491 nm laser met 50 msec tijd blootstelling met 20% van de laser (figuur 1i). - Verwijder de imaging schaal en voeg 1 ml SRBC suspensie bij 7 x 10 6 SRBC / ml van de schaal (figuur 1).
- Centrifugeer bij 500 xg gedurende2 min bij RT om fagocytose te synchroniseren, de tijd op te nemen aan het einde van het centrifugeren en de terugkeer van de schotel naar het podium.
- Optimaliseren van de scherpstelling en opname GFP en BF beelden in Z-stacks (gehele dikte van de cel met een stap-afstand van 0,3 pm - meestal 20 vlakken) per minuut gedurende ten minste 1 uur. Sla de time-lapse video in de oorspronkelijke file-formaat van de gebruikte imaging-systeem.
LET OP: Hier werden time-lapse filmpjes opgeslagen in het eigen formaat, * .stk bestanden.
6. Analyse van de Time-lapse filmpjes
- Voor videobewerking, klikt u op het drop down menu 'Apps' en op de tab "Review Multi Dimensional Data" in de video-editing software.
- Om het bestand te openen, klikt u op "Select Base File" en vervolgens op "Select Directory". In de "Data sets" selecteert u de overname (in .nd formaat) te analyseren en klik op "View". De gegevens worden weergegeven in een tabel met de tijd in de kolom eend Z-plan de lijn.
- Om de infectie in een Z-projectie (figuur 2, links panelen) vertegenwoordigen, selecteert u 491 nm golflengte in het vak "Golflengten" en klik op het tabblad "Z projectie" met "alle vliegtuigen".
- Om een tijdreeks, analyseren en BF golflengte in het vak "Golflengten" en kies de optimale vliegtuig op de Z-as naar externe SRBC's (figuur 2, rode pijlpunt), interne SRBC's (figuur 2, rode cirkel) en de nucleus te onderscheiden ( Figuur 2, blauwe cirkel).
- Om de video montages te slaan, klik op "Selectie [X]" tab en vervolgens op "Load Image (s)". Tot slot, sparen de geladen beelden in tif-formaat en open ze vervolgens op ImageJ software.
- Met de plugin "Manual Tracking" op de ImageJ software om de positie van de kern en de verschillende phagosomes waargenomen bij BF kanaal (figuur 3) te meten.
- Download de "Manual Tracking" plug-in op de ImageJ website. Op ImageJ, open de plugin en de afbeelding die moet worden geanalyseerd (figuur 3, stap 1 en 2).
- Voer de instellingen zoals "Time Interval" die hoeveelheid tussen naburige frames vertegenwoordigt, en de "x / y calibration" waarbij de afstand per pixel vertegenwoordigt (figuur 3, stap 3).
LET OP: Hier slaat u de afbeelding sequentie met een tijdsinterval van 1 min tussen elk frame en x / y ijking van 0,205 micrometer, omdat de 63x zoom en een camera met een pixelgrootte van 6,45 x 6,45 micrometer 2 worden gebruikt. - Om de tracking te starten, klikt u op "track Voeg" (figuur 3, stap 4) en klik op de SRBC center bij de eerste keer wanneer het wordt geïnternaliseerd. Het volgende frame verschijnt automatisch.
- Ga verder te klikken op de SRBC center in alle frames op verschillende posities in de loop van de tijd (figuur 3, stap 6 in rode doos) hebben.
- Start om de kern te volgen om haar positie in alle frames hebben door te klikken op het midden. Volgende volgen de phagosomes (door te klikken op het midden) één voor één op het moment (frame) van hun internalisatie, verschillend in functie van SRBC's. Voor het gemak om SRBC bekijk op BF kanaal, gebruikt u het venster "Helderheid en contrast" tijdens het volgen (figuur 3, stap 5).
- Tussen elke SRBC volgen, klik op "track Voeg" (figuur 3, stap 4) om een nieuwe baan te hebben. Het aantal van het volgen zal worden gewijzigd in de tweede kolom, "Order nr" van de resultatentabel (figuur 3, stap 6).
- Sla de gegevens in een spreadsheet om door te gaan naar de volgende stap van de analyse.
- Gebruik spreadsheetsoftware van de afgelegde afstand phagosomes met SRBC's naar de kern en de snelheid van de phagosomes gedurende de eerste 5 minuten na internalisatie van SRBC berekenen (Figuur 4).
- Open de spreadsheet tafel en een nieuwe spreadsheet-bestand. Transfer naar het nieuwe bestand de volgende parameters enige tijd, de x- en y-coördinaat van de kern en alle SRBC's (Figuur 4A).
- Om de afstand tussen de kern en SRBC berekenen alleen hun coördinaten, beschouwen de kern en een SRBC in een XY-coördinatenvlak (figuur 4B).
OPMERKING: De afstand tussen twee punten is de lengte van het pad te verbinden. In het vliegtuig, is de afstand tussen SRBC en de nucleus gegeven door de stelling van Pythagoras.- Als c (de afstand tussen de kern en de SRBC) staat voor de lengte van de hypotenusa en a en b duiden de lengten van de beide andere zijden, drukken stelling van Pythagoras als Pythagoras vergelijking:
OPMERKING: Tegelijkertijd op orthonormale, de horizontale afstanda (x nucleus -x SRBC) en de verticale afstand b (y kern -y SRBC). - Aldus berekent de afstand tussen de kern en de SRBC (Figuur 4A, paarse doos) van:
OPMERKING: Vermenigvuldig de verkregen afstandswaarde (in pixels) van x / y kalibratie de afstand urn. Hier, de x / y kalibratie is 0,205 micrometer. - Op elk tijdstip, trek de afstand tussen de kern en de SRBC de beginafstand (Figuur 4C).
- Zet de meting tegen de tijd voor de eerste 5 minuten. Breng een lineaire trendlijn (figuur 5A) om het diagram en bepaal de helling van de lineaire trend-lijn die de phagosome snelheid naar de nucleus gedurende de eerste 5 minuten na SRBC internalisatie vertegenwoordigt.
- Verzamelen van de gegevens voor de gemiddelde en de statistische fout van berekenende snelheid waarden en plot ze in een passende vorm met behulp van de juiste software (Figuur 5B).
- Als c (de afstand tussen de kern en de SRBC) staat voor de lengte van de hypotenusa en a en b duiden de lengten van de beide andere zijden, drukken stelling van Pythagoras als Pythagoras vergelijking:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FcR bemiddelde fagocytose door HIV-1-geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde hMDMs wordt beschreven gebruikt IgG-opsonized SRBC als model targets (figuur 1). De kritische stappen van dit protocol zijn de voorbereiding van hMDMs en de infectie met HIV-1. Inderdaad, de opbrengst en kwaliteit van gedifferentieerde macrofagen varieert tussen donoren en de infectie met rendementen in het traject van 10-40%. Bovendien is de bereiding van IgG-opsonized-SRBC is ook belangrijk om beschadiging van de erytrocyten, omdat hun herkenning kunnen induceren en opname zoals puin in plaats van FcR bemiddelde fagocytose. Optimale opsonisatie zal zorgen voor een efficiënte fagocytose.
Phagosome beweging in levende HIV-geïnfecteerde macrofagen geanalyseerd in real-time de BF kanaal op een draaiende schijf confocale microscoop in de BSL-3 laboratorium. De instellingen van de BF kanaal zijn kritisch to zie de nucleus (figuur 2, blauwe cirkel) en voor het onderscheiden van de externe (figuur 2, rood pijlpunten) uit de geïnternaliseerde SRBC's (figuur 2, rode cirkels). BF microscopie wordt beschouwd als de meest eenvoudige optische microscopie Beluchtingtechniek voldoende om de fagosomen, die minder refringent dan extern SRBC's zijn te zien.
De eerste stap na overname van beeldsequenties gebeurt manueel tracking op de ImageJ software (figuur 3). Dit punt kan bijzonder lang en vervelend, omdat het de voorkeur om elke phagosome één spoor voor één voor beeldreeksen en wordt geoordeeld dat proeven moeten worden herhaald met minstens 3 donoren per toestand een groot genoeg grootte monster bereikt statistische analyse (minimaal 30 phagosomes met 3 verschillende donoren).
De tweede stap is het analyserenspreadsheet software om de snelheid te berekenen phagosome gedurende de eerste 5 minuten na internalisatie per geïnternaliseerd SRBC's (Figuur 4). Hiervoor plotten we voor elke phagosome de afgelegde afstand gedurende de eerste 5 min tegen de tijd. Een representatief voorbeeld wordt weergegeven in niet-geïnfecteerde hMDMs in figuur 5A. Volgende krijgen we de snelheid van de phagosome, dat de helling van de lineaire regressie kromme. Een snelheid van 0,5384 pm / min gevonden voor deze phagosome.
Van belang is het mogelijk om de snelheid phagosome geanalyseerd tijdens de eerste minuten na internalisatie, zoals hier en in Dumas et al. 8 is beschreven, of later door analyse van de snelheid over langere tijdschalen. In onze studie hebben we vastgesteld dat de phagosome snelheid gedurende de eerste 5 minuten na internalisatie in HIV-geïnfecteerde hMDMs lager is in vergelijking met niet-geïnfecteerde hMDMs (Figuur 5B).
Figuur 1. Bereiding van controle en HIV-geïnfecteerde hMDMs voor fagocytose beeldvorming. Monocyten worden gezuiverd door adhesie (1) en gedifferentieerd tot macrofagen gedurende 11 dagen met M-CSF (2). Vervolgens worden hMDMs geïnfecteerd met HIV-NLR4.3 1Gag-iGFP i) bij een MOI tussen 0,02 en 0,03 gedurende 8 dagen met was op dag 2 (3). (4) IgG-opsonized SRBC's worden toegevoegd aan hMDMs voor fagocytose gedurende 1 uur. De phagosomes met SRBC's detecteerbaar zijn op BF beelden (rode cirkel, ii). Beelden zijn van de Servier beelden database. Bar = 10 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Real-time acquisitie tijdensfagocytose door representatieve controle en HIV-geïnfecteerde hMDMs. hMDMs bereid en geïnfecteerd zoals beschreven in figuur 1. De NLR4.3 HIV-1Gag-iGFP geïnfecteerde cellen worden gedetecteerd met de 491 nm laser. Z-stacks van de draaiende schijf confocale beelden worden verkregen en geanalyseerd met behulp van zowel de microscoop acquisitie software en ImageJ (links panelen). Galleries of BF beelden vormen een niet-geïnfecteerde (top panelen die overeenkomt met Movie 1) en een NLR4.3 HIV-1Gag-iGFP geïnfecteerde (onderste panelen die overeenkomt met Movie 2) cel tijdens een 45 min overname (46 beelden met de tijd aangeduid als hh : mm). De celmembraan (gestippelde zwarte lijn), de kern (blauwe cirkel), de externe SRBC's (sommige van hen aangegeven met rode pijlen) en de interne SRBC's (sommige van hen aangegeven met rode cirkels) detecteerbaar zijn op BF beelden. Bar = 10 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Instructie stappen voor beeldanalyse met Manual Tracking plugin op ImageJ. Na het openen van de "Manual Tracking" plugin (1) en het laden van de time-lapse video in BF kanaal (2), voert u de parameters van de overname (3). Klik op "track Voeg" (4) en start de meting van de tracking door te klikken op één phagosome (5) om een nieuw venster te verkrijgen met X- en Y-posities van de gekozen phagosome (6, rode doos). Om de phagosome op de tijdreeks voor het gemak volgen, variëren de helderheid en het contrast (5 '). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Instructie stappen voor data-analyse van phagosome migratie snelheid in spreadsheet-software. (A) Monteer de X- en Y-positie van de kern en elk phagosome (rode doos) in een spreadsheet tabel. In een andere kolom (paarse doos) Bereken de afstand tussen de phagosome en de kern met de stelling van Pythagoras waarin C de lengte tussen de kern en de SRBC en a en b de lengten van de beide andere zijden van een rechthoekige driehoek ( B). (C) ten slotte, het berekenen van de afstand die het phagosomes op elk tijdstip (groene doos) door het aftrekken van de afstand tussen de SRBC en de kern op een gegeven moment van de eerste afstand op tijdstip 0. Klik hier om een grotere versie te bekijken dit figuur.
p_upload / 54568 / 54568fig5.jpg "/>
Figuur 5. Kwantificering van phagosome migratie snelheid in controle en HIV-geïnfecteerde hMDMs. (A) voor elk SRBC en net na SRBC internalisatie, wordt de afgelegde afstand naar de kern gemeten en uitgezet tegen de tijd. De snelheid gedurende de eerste 5 min wordt berekend met lineaire regressie spreadsheet software. Een representatief experiment wordt getoond (de interne SRBC van figuur 3-4). (B) alle snelheden gedurende de eerste 5 min worden gemeten 66 phagosomes in niet-geïnfecteerde (5 donoren) en 60 phagosomes in HIV-geïnfecteerde cellen (4 donors). Gegevens stellen het gemiddelde ± SEM (t-test Unpaired Student met correctie Welch's; **, P <0,01). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Film 1: phagosome beweging in een representatieve niet-geïnfecteerde macrofagen. . (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden) De beweging van opsonized rode bloedcellen werd gedetecteerd in BF kanaal gedurende 45 min van fagocytose met één afbeelding per minuut (46 beelden met de tijd aangeduid als uu: mm). Bar = 10 urn.
Movie 2: phagosome beweging in een representatieve HIV-geïnfecteerde macrofagen. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden). HIV-1 (NLR4.3 HIV-1 Gag iGFP) geïnfecteerde macrofagen werden geïdentificeerd na belichting met de 491 laser. De beweging van opsonized rode bloedcellen werd gedetecteerd in BF kanaal tijdens 45min van fagocytose met één afbeelding per minuut (46 beelden met de tijd aangeduid als uu: mm). Bar = 10 urn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze techniek heeft een aantal kritische stappen. Ten eerste de bereiding van hMDMs en de infectie door HIV-1 is essentieel omdat het percentage infectie donor afhankelijk. Van de nota, hebben we besloten om macrofagen die niet in vitro worden gepolariseerd voorafgaand aan de infectie te gebruiken, omdat de status van macrofagen mogelijk ondervonden door het virus in vivo is nog niet goed tot nu toe gekenmerkt. We controleerden de expressie van verschillende oppervlakte markers, wat aangeeft dat de macrofagen noch M1 of M2, en gecontroleerd de expressie van CD4 en CCR5. De infecties zijn variabel en varieert van 10 tot 40%, en soms lager. Deze variabele infectiegraad Daarom kan het moeilijk zijn om een HIV-1 geïnfecteerde fluorescerende hMDM onder de microscoop te vinden. Bovendien kan de tijd die nodig is om een HIV-1 geïnfecteerde cel direct vinden na de centrifugatiestap ook leiden tot een vertraging in het starten van de overname. Fagocytose kan worden gestart zonder de synchronization van binding en opname gegenereerd door centrifugeren. Echter is deze mogelijkheid niet te SRBC's die zweven alvorens de cellen geselecteerd. Het zou een goede optie met kralen zijn. Om de tijd die nodig is om geïnfecteerde cellen te minimaliseren, kon gerasterde glazen bodem gerechten worden gebruikt om HIV-1 geïnfecteerde hMDMs identificeren voordat wordt overgegaan tot de fagocytose test te starten. De geselecteerde HIV-geïnfecteerde cellen die een "redelijk" aantal SRBC rond hen wordt dan snel worden gekozen om de acquisities starten. "Redelijk SRBC hoeveelheid" voldoende om ten minste 10 SRBC's per cel en niet te veel te voorkomen dat de externe SRBC van maskeren phagosomes hebben.
Bovendien is het belangrijk de opsonisatie te optimaliseren om ervoor te zorgen er efficiënte herkenning en opname door de cellen zijn. De FcR bemiddelde fagocytose constitutief en hMDMs zijn routinematig zeer efficiënt in FcR-gemedieerde opname. Daarnaast juiste fagocytose, de voorwaarden moeten be optimaal met de verwarmingskamer bij 37 ° C en 5% CO2. Het is noodzakelijk om het gas en de temperatuur te controleren voordat de fagocytose assay.
Tenslotte is de discriminatie externe SRBC inwendige phagosomes en de identificatie van de kern in het kanaal BF zijn belangrijk voor de analyse van ImageJ software. Dit is de reden waarom de instellingen van dit kanaal zijn belangrijk. Gezien het feit dat de focus kan worden verloren tijdens acquisitie, raden wij aan om stapels van beelden in de Z-as te verwerven om zeker te zijn van de optimale vliegtuig naar phagosome snelheid te analyseren. Het de voorkeur om een enkele cel in een veld om alle geïnternaliseerd SRBC voor elke cel analyse. Daarom is de lens keuze is belangrijk en hier we hebben gebruikt 2 lenzen als functie van de celgrootte. Het was makkelijker voor ons om phagosomes met een 100X lens te volgen, maar soms de cellen waren te groot, dus we hadden om over te schakelen naar een 63x lens. De keuze van de lens is ook kritisch wanneer het denken over imleeftijd analyse met behulp van ImageJ en een spreadsheet tafel omdat beide lenzen betrekken verschillende x / y kalibraties.
De eerste beperking van deze techniek is het aantal monsters dat moet worden verworven om statistisch significante resultaten. We kunnen verschillende films per donor maar meestal niet meer dan 2 cellen per staat, per gerecht te registreren. De oplossingen voor deze beperking aan het aantal te verhogen monsters moeten experimenten herhaald met meer donoren of meerdere punten XY imaging doen afhankelijk van de microscoop. Het ongemak van de laatste methode is het potentiële verlies van de focus tijdens gemotoriseerde XYZ scannen. Een andere beperking is dat de handmatige kwantificering van de snelheid is lang en vervelend vergeleken met een geautomatiseerde analyse. Voor volledige geautomatiseerde analyse moet worden fluorescerend gemerkte deeltjes bevatten, zoals vermeld in baanbrekende studies 4 met latex bolletjes gekoppeld met vissenhuid gelatine die werden gevolgd met een tracking algoritme Matlab software. Fluorescent gelabelde opsoniserende antilichamen of korrels alternatief kunnen zijn, maar ze zijn onderworpen aan bleken, hetgeen een probleem is bij het opnemen fagocytose voor 1 uur. Andere studies blijkt het gebruik van latex bolletjes 13,14. We merkten echter op dat internalisering van latex bolletjes minder gemakkelijk wordt gedetecteerd dan de opname van SRBC's. Inderdaad het uitgangspunt van de kinetiek van intracellulaire migratie is het belangrijk om te weten om vroeg defecten in phagosomal beweging detecteren.
Het belangrijkste voordeel van de hier beschreven werkwijze is de eenvoud en het gebruik van een vrije software. Om de handmatige bijhouden uitvoeren met het ImageJ software, moeten we de positie van de phagosome en de kern gebruiken, dus moeten we de stelling van Pythagoras gebruiken om de afstand tussen de phagosome en de kern te berekenen, en om de snelheid na hebben lineaire regressie in spreadsheet-software. Dit 3 stappen analyse kan worden teruggebracht tot één stap, de tracking op ijzige software met de & #34,. Manual Tracking "plugin De uitgangsdata worden dan direct de snelheid van het deeltje te volgen, en in het bijzonder de relatieve snelheid tussen de 2 groepen (zoals phagosomes en nucleus) tenslotte de berekening kunnen we de relatieve snelheid van meten. een deeltje ten opzichte van een ander deeltje die ook kan bewegen.
De mogelijke toekomstige toepassing van deze levende time-lapse analyse kan worden voor deeltjes zichtbaar in heldere gebied, zoals bacteriën, schimmels of celresten. Verschillende behandelingen of infectie voldoende zijn om phagosomal rijping en activering van macrofagen eigenschappen modificeren zouden profiteren van een dergelijke verfijnde analyse van phagosomal beweging naar celcentrum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | For viral production |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | For acquisition |
| Falcon Tissue Culture Plates 6-well | Thermo Fischer Scientific | Corning. Inc. 353934 | For human monocyte-derived macrophages |
| Ficoll-Plaque PLUS | Dominique Dutscher | 17-1440-03 | a neutral, highly branched, high-mass, hydrophilic polysaccharide in solution for density centrifugation |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | RT |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x, liquid (High Glucose) | GIBCO, Molecular probes | 31966-021 | Conserved at 4 °C ; for HEK cells culture |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | Conserved at 4 °C; for hMDMs culture |
| Fœtal Calf Serum (FCS) | Eurobio | CVFSVF0001 | Conserved at -20 °C ; decomplemented |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fischer Scientific | 15140-122 | Conserved at -20 °C ; for hMDMs culture |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10x 500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37 °C water bath before use ; for phagocytosis assay |
| FuGENE6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Conserved at 4 °C ; for viral production |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4 °C before use |
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | Conserved at 4 °C |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | Conserved at -20 °C |
| Inverted microscope DMI600 | Leica | ||
| Confocal Spinning Disk Unit CSU-X1M1 | Yokogawa | ||
| 491 nm 50 mW laser | COBOLT CALYPSO | ||
| HCX PL APO CS Objectif | Leica | Objective lens ; Magnification 100X ; Numerical aperture 1.40 ; Immersion oil | |
| CoolSnap HQ2 (FireWire) Camera | Photometrics | Pixel size 6.45 µm x 6.45 µm ; Definition 1,392 x 1,040 ; Encoding the image in 14 Bit | |
| Metamorph 7.7.5 software | Molecular Devices | For the control of the microscope | |
| GraphPad Prism software | For the statistics analysis |
References
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Niedergang, F. Encyclopedia of Cell Biology. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).
- Blocker, A., Griffiths, G., Olivo, J. C., Hyman, A. A., Severin, F. F. A role for microtubule dynamics in phagosome movement. J Cell Sci. 111 (Pt 3), 303-312 (1998).
- Blocker, A., et al. Molecular requirements for bi-directional movement of phagosomes along microtubules. J Cell Biol. 137, 113-129 (1997).
- Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).
- Feasey, N. A., Dougan, G., Kingsley, R. A., Heyderman, R. S., Gordon, M. A. Invasive non-typhoidal salmonella disease: an emerging and neglected tropical disease in Africa. Lancet. 379, 2489-2499 (2012).
- Mazzolini, J., et al. Inhibition of phagocytosis in HIV-1-infected macrophages relies on Nef-dependent alteration of focal delivery of recycling compartments. Blood. 115, 4226-4236 (2010).
- Dumas, A., et al. The HIV-1 protein Vpr impairs phagosome maturation by controlling microtubule-dependent trafficking. J Cell Biol. 211, 359-372 (2015).
- Greenberg, S., el Khoury, J., Kaplan, E., Silverstein, S. C. A fluorescence technique to distinguish attached from ingested erythrocytes and zymosan particles in phagocytosing macrophages. J. Immunol. Methods. 139, 115-122 (1991).
- Koppensteiner, H., Banning, C., Schneider, C., Hohenberg, H., Schindler, M. Macrophage internal HIV-1 is protected from neutralizing antibodies. J Virol. 86, 2826-2836 (2012).
- Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. 1087, 207-220 (2014).
- Wei, X., et al. Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20) monotherapy. Antimicrob Agents Chemother. 46, 1896-1905 (2002).
- Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP. Mol Cell Biol. 23, 6494-6506 (2003).
- Toyohara, A., Inaba, K. Transport of phagosomes in mouse peritoneal macrophages. J Cell Sci. 94 (Pt 1), 143-153 (1989).
