Protocol
El protocolo tiene que ser llevado a cabo en estricta conformidad con las legislaciones nacionales e internacionales y reglamentos locales. La sangre de donantes sanos que dieron su consentimiento para donar sangre con fines de investigación se ha obtenido a partir de los centros de transfusión de sangre con la que las instituciones han firmado un acuerdo. protecciones especiales se deben tomar cuando se utiliza la sangre humana. Los experimentos con VIH-1 deberán efectuarse en un nivel de bioseguridad 3 o 2 (BSL-3 o 2) de laboratorio de acuerdo con la legislación local.
1. Preparación de macrófagos derivados de monocitos humanos (hMDMs) por centrifugación en gradiente de densidad y selección por adherencia
- Comience con la sangre fresca de donantes sanos (9 ml). Diluir todo el volumen de la sangre fresca con 1x estéril salina tamponada con fosfato (PBS) sin Ca2 + y Mg2 + para obtener un volumen final de 70 ml y añadir suavemente la sangre diluida en dos tubos de 50 ml cónicos (35 ml por tubo) , en la parte superior de 15 ml de unaeutral, muy ramificado, de gran masa, polisacárido hidrófilo en la solución ya está en cada tubo.
- Centrifugar los dos tubos de sangre en 537 xg durante 20 min a 20 ° C sin freno. Luego recoger las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) contenidos en el anillo de células nublado en la interfase y transferirlos a un nuevo tubo de 50 ml que contiene 15 ml de 1x PBS sin Ca2 + y Mg2 +.
- Centrifugar las células a 218 xg durante 5 min a 20 ° C y resuspender el precipitado en 45 ml de 1x PBS sin Ca2 + y Mg2 +.
- Centrifugar las células a 218 xg durante 5 min a 20 ° C, resuspender el precipitado en 10 ml de 1x PBS sin Ca2 + y Mg2 +, y recuento de las células mediante la dilución a una dilución final de 1/200 en Trypan Blue.
- Centrifugar las células a 218 xg durante 5 min a 20 ° C y resuspender el sedimento en medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 suplementado con 2 mM L-glutamina y 100 mg / ml Penicillin-estreptomicina tener 7 x 10 6 PBMCs por pocillo en 2 ml de medio en cada pocillo de una placa de pocillos 6.
- Incubar las placas a 37 ° C con 5% de CO2 durante 2 hr. Después de 2 horas los monocitos se han adherido al plástico.
- Para permitir aislados recién monocitos de diferenciarse en hMDMs, aspirar el medio y lo reemplazan con 2 ml HMDM medio (RPMI 1640, 10% descomplementado suero de ternera fetal (FCS), 2 mM de L-glutamina y 1% de penicilina-estreptomicina) suplementado con colonias de macrófagos factor estimulante (RHM-CSF) a una concentración final de 10 ng / ml.
- Se incuban las células a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 11 días (Figura 1).
- En el día 11 se elimina el medio y se lava 2 veces con 2 ml de medio HMDM frío por pocillo. A continuación lavar cada pocillo 2 veces con 1 ml de PBS 1x frío.
- Para separar hMDMs completamente diferenciadas, lavar cada vez que el pozo 1 con 1 ml de PBS frío 1x con ácido ethylenediaminetetraacetatic 2 mM (EDTA) e incubar las células en 2 ml de PBS frío 1x con EDTA 2 mM por pocillo durante 15 a 60 min a 4 ° C.
NOTA: Los métodos alternativos para desprender las células existen (por ejemplo, tripsina o actividades similares a la tripsina) que podrían dar buenos resultados 11. - Después de la separación (terminado pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo en el pozo), recoger las células y los puso en un tubo de 50 ml en hielo que contiene 10 ml de medio HMDM frío.
- Centrifugar las células a 218 xg durante 5 min a 20 ° C, resuspender el precipitado en 10 ml de medio HMDM frío y el recuento de las células mediante la dilución de 1/20 en Trypan Blue.
- Sembrar las células a 1 x 10 6 hMDMs por microscopía de cristal del grado 35 mm placa de fondo y se incuban las placas a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 1 día.
2. Producción y cuantificación de VIH-1 reservas virales
NOTA: NLR4.3 VIH-1 Gag-IGFP (proteína verde fluorescente) que lleva un sobre R5-trópico, obsequio de M. Schindler 10 se usa para infectar a los macrófagos y para ver las células infectadas en tiempo real.
- Producir reservas virales mediante la transfección de las células humanas embrionarias de riñón 293T (2 x 10 6 en 100 mm de plato) con 6 g de ADN proviral correspondiente usando un reactivo de transfección comercial.
- Cuantificar la infectividad de las reservas de virus usando las células indicadoras HeLa TZM-bl (que llevan el gen de ß-galactosidasa bajo el control del VIH-1 LTR) utilizando diluciones seriadas de las reservas de virus, seguido de una coloración ß-galactosidasa de las células y contando de células azules 12.
3. La infección de hMDMs con VIH-1
- Añadir el virus a una multiplicidad de infección (MOI) 0,02 a 0,03 en 1 ml de medio de HMDM a hMDMs (células en placas en 1,13). Para los pocillos de control sólo añadir 1 ml de medio de HMDM e incubar los platos a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 2 días (Figura 1).
- En el día 2 se lavan las células con HMDM medIUM 3 veces y se añade 1 ml de medio fresco HMDM por plato. Se incuban las células a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 6 días (Figura 1).
4. La opsonización de ovejas Glóbulos rojos
- Para la preparación de 7 x 10 6 SRBCs por placa, lavar los SRBC dos veces en 100 l de solución que contenía 0,1% albúmina de suero bovino (BSA) en PBS 1x con centrifugación a 600 xg durante 4 min.
- Resuspender las SRBC lavadas en 500 l de 1x PBS / BSA 0,1% con IgG de conejo anti-SRBC a una concentración sub-aglutinantes por 5 l de SRBC y se incuba con la rotación a TA durante 30 min.
NOTA: Para determinar la concentración sub-aglutinantes de IgG anti-SRBC, se preparan diluciones seriadas de la IgG (concentración de reserva a 13,1 mg / ml) a partir de 1/50 a 1 / 25.600 en 20 l en una placa de 96 pocillos. Añadir 2 x 10 6 SRBCs en 20 l en cada pocillo y colocar la placa en una habitación oscura durante varias horas. La concentración sub-aglutinante es ladilución de la bien justo antes de la aglutinación bien con (+ SRBCs IgG formación de una red). - Después de la rotación, centrifugar los eritrocitos de cordero-opsonized-IgG a 600 xg durante 4 minutos y se lava con 100 l de 1x PBS / BSA 0,1% con centrifugación a 600 g durante 4 min.
- Resuspender las-SRBC opsonizadas-IgG en un medio de pre-calentado libre de rojo fenol RPMI suplementado con 2 mM L-glutamina y 1% de penicilina-estreptomicina (1 ml / placa).
5. Ensayo en vivo de la célula microscopía de vídeo fagocitosis
- Utilice un sistema de imagen confocal, tal como un sistema de disco giratorio equipado con una cámara de calentamiento a 37 ° C con CO 2 pasa a través de una botella con agua para la humidificación.
- Encienda la cámara de calentamiento antes del experimento para tener la platina del microscopio a 37 ° C antes del comienzo del ensayo de fagocitosis. Encienda el microscopio y el ordenador, y cargar el software de imágenes.
- Optimizar los ajustes de imagen como la velocidad de exploración, magnífication, la resolución, etc. para tener al menos una célula por campo y a la imagen un fotograma cada minuto entre 60 a 120 min.
NOTA: En este caso, la muestra se forma la imagen de un marco de cada minuto durante 60 min con 63x lente. - Coloque el recipiente de formación de imágenes en la platina del microscopio. Ajustar el enfoque y la ubicación para encontrar sólo un conjunto de VIH-1 de macrófagos infectados en el campo. Use la configuración de excitación / emisión apropiados basados en el sistema de imagen utilizado y la sonda. Incluir un canal brillante campo (BF) para observar los fagosomas (Figura 1II). Optimizar la aparición de las diferentes imágenes del canal ajustando el porcentaje de tiempo de la luz y la exposición transmitida.
NOTA: En este caso, NLR4.3 VIH-1 Gag-IGFP estaba excitada usando un láser de 491 nm con 50 ms de tiempo de exposición con 20% de láser (Figura 1i). - Retirar la cápsula de imágenes y añadir 1 ml de suspensión de SRBC en 7 x 10 6 / ml a SRBC el plato (Figura 1).
- Centrifugar a 500 xg durante2 min a TA para sincronizar la fagocitosis, registrar el tiempo al final de esta centrifugación y devolver el plato a la etapa.
- Optimizar la GFP enfoque y la captura y las imágenes BF en Z-pilas (en todo el espesor de la celda con un paso a la distancia de 0,3 m - por lo general 20 aviones) cada minuto durante al menos 1 hr. Guardar el vídeo de lapso de tiempo en el formato de archivo nativo del sistema de imagen utilizado.
NOTA: En este caso, las películas a intervalos fueron salvados en el formato nativo, archivos * .stk.
6. Análisis de las películas a intervalos
- Para la edición de vídeo, haga clic en el menú desplegable "Aplicaciones" y en la ficha "Revisión multidimensional de datos" en el software de edición de vídeo.
- Para abrir el archivo, haga clic en "Seleccionar archivo de la base", luego en "Seleccionar directorio". En el "conjuntos de datos", seleccione la adquisición de analizar (en formato .nd) y haga clic en "Ver". Los datos se representan en una tabla con el tiempo en una columnad Z de planta en la línea.
- Representar a la infección en un Z-proyección (Figura 2, paneles de la izquierda), seleccione 491 nm de longitud de onda en el cuadro de "Las longitudes de onda" y haga clic en la pestaña "proyección Z" con "todos los planos".
- Para analizar una secuencia de tiempo, seleccione la longitud de onda de BF en el cuadro de "Las longitudes de onda" y seleccione el plano óptima en el eje Z para distinguir los eritrocitos de cordero externos (Figura 2, punta de flecha roja), SRBC internos (Figura 2, círculo rojo) y el núcleo ( La figura 2, círculo azul).
- Para guardar los montajes de vídeo, haga clic en la pestaña "Selección [X]" y después en "Load Image (s)". Por último, guardar las imágenes cargadas en formato tif y abrirlos al lado en el software ImageJ.
- Utilizar el plugin "Tracking Manual" en el software ImageJ para medir la posición del núcleo y las diferentes fagosomas observados en el canal BF (Figura 3).
- Download el plugin "Manual de seguimiento" en la página web ImageJ. En ImageJ, abren el plugin y la secuencia de imágenes a analizar (figura 3, paso 1 y 2).
- Introduzca los ajustes tales como "Intervalo de tiempo", que representa la cantidad de tiempo entre tramas adyacentes, y la "x / y de calibración", que representa la distancia por píxel (figura 3, paso 3).
NOTA: Aquí, guardar la secuencia de imágenes con un intervalo de tiempo de 1 min entre cada fotograma y x / y de calibración de 0,205 micras porque se utilizan el zoom 63X y una cámara con tamaño de píxel de 6,45 x 6,45 m 2. - Para iniciar el seguimiento, haga clic en "Añadir pista" (figura 3, paso 4) y hacer clic en un centro de SRBC en el primer momento en que se internaliza. La siguiente trama aparece automáticamente.
- Continúe haciendo clic en el centro de SRBC en todos los marcos que tienen diferentes posiciones durante el tiempo (figura 3, paso 6 en el cuadro rojo).
- Comenzará a realizar el seguimiento del núcleo que su posición en todos los marcos haciendo clic en su centro. Tema siguiente los fagosomas (haciendo clic en su centro), uno por uno en el momento (marco) de su internalización, diferentes en función de los eritrocitos de cordero. Para una mayor comodidad para ver SRBC en el canal BF, utilice la ventana de "Brillo y contraste" durante el seguimiento (figura 3, paso 5).
- Entre cada SRBC de seguimiento, haga clic en "Añadir pista" (figura 3, paso 4) para tener una nueva pista. El número de seguimiento será cambiado en la segunda columna, "Pista n °" de la tabla de resultados (figura 3, paso 6).
- Guardar los datos en una hoja de cálculo para continuar con el siguiente paso del análisis.
- Utilice el software de hoja de cálculo para calcular la distancia recorrida de los fagosomas que contienen SRBCs hacia el núcleo y la velocidad de los fagosomas durante los primeros 5 minutos después de la internalización de los eritrocitos de cordero (Fifigura 4).
- Abra la tabla de hoja de cálculo y un nuevo archivo de hoja de cálculo. Transferencia en este nuevo archivo sólo los siguientes parámetros, el tiempo, la X e Y de coordenadas del núcleo y todos los SRBC (figura 4A).
- Para calcular la distancia entre SRBC y el núcleo con sólo sus coordenadas, considere el núcleo y un SRBC en un plano de coordenadas xy (Figura 4B).
NOTA: La distancia entre dos puntos es la longitud de la trayectoria de conectarlos. En el plano, la distancia entre SRBC y el núcleo está dado por el teorema de Pitágoras.- Si c (la distancia entre el núcleo y el SRBC) denota la longitud de la hipotenusa y a y b indican las longitudes de los otros dos lados, expresar el teorema de Pitágoras como la ecuación de Pitágoras:
NOTA: Al mismo tiempo, en la ortonormal, la distancia horizontala es (x -x núcleo SRBC) y la distancia vertical b es (y núcleo -y SRBC). - Por lo tanto, calcular la distancia entre el núcleo y el SRBC (Figura 4A, caja púrpura) por:
NOTA: Multiplicar el valor de la distancia obtenida (en píxeles) por x / y de calibración para tener la distancia en micras. Aquí, el x / y de calibración es 0,205 m. - En cada tiempo, se resta la distancia entre el núcleo y el SRBC a la distancia inicial (Figura 4C).
- Trazar la medición en función del tiempo para los primeros 5 minutos. Aplique una línea de tendencia lineal (Figura 5A) a la trama y determinar la pendiente de la línea de tendencia lineal que representa la velocidad fagosoma hacia el núcleo durante los primeros 5 minutos después de la internalización SRBC.
- Cotejar los datos para calcular el error medio y estadístico delos valores de velocidad y representarlos en una forma apropiada con el software adecuado (Figura 5B).
- Si c (la distancia entre el núcleo y el SRBC) denota la longitud de la hipotenusa y a y b indican las longitudes de los otros dos lados, expresar el teorema de Pitágoras como la ecuación de Pitágoras:
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Representative Results
Fagocitosis mediada por FcR hMDMs infectados por el VIH-1 y no infectados se describe aquí usando SRBCs opsonized-IgG como objetivos modelo (Figura 1). Los pasos críticos de este protocolo son la preparación de hMDMs y la infección con el VIH-1. De hecho, el rendimiento y la calidad de macrófagos diferenciados varía entre los donantes, así como la tasa de infección con eficiencias en el rango de 10-40%. Además, la preparación de IgG-opsonizado-SRBC también es importante para evitar daños en los eritrocitos, porque esto podría inducir su reconocimiento y captación como los desechos en lugar de por fagocitosis mediada por FcR. opsonización óptima se asegurará de fagocitosis eficaz.
movimiento fagosoma en vivir los macrófagos infectados por el VIH se analiza en tiempo real con el canal de BF en un microscopio confocal de disco giratorio en el laboratorio BSL-3. Los ajustes del canal BF son t críticoo ver el núcleo (Figura 2, círculo azul) y para discriminar el exterior (Figura 2, las puntas de flecha rojos) a partir de los SRBC internalizadas (figura 2, círculos rojos). La microscopía de BF se considera como la técnica de iluminación microscopía óptica simple suficiente para ver los fagosomas, que son menos refringente de los SRBC externos.
El primer paso después de la adquisición de secuencias de imágenes es el seguimiento manual del software ImageJ (Figura 3). Este punto puede ser particularmente largo y tedioso, ya que es preferible realizar un seguimiento de cada fagosoma, uno por uno para todas las secuencias de imágenes y se considera que los experimentos necesitan ser repetidas con al menos 3 donantes por condición para llegar a un tamaño de la muestra lo suficientemente grande para análisis estadístico (por lo menos 30 fagosomas con 3 donantes diferentes).
El segundo paso es el análisisen una hoja de cálculo para calcular la velocidad fagosoma durante los primeros 5 minutos después de la internalización por cada SRBCs internalizados (Figura 4). Para ello, se traza para cada fagosoma la distancia recorrida durante los primeros 5 minutos para el tiempo. Un ejemplo representativo se muestra en hMDMs no infectados en la figura 5A. Siguiente se obtiene la velocidad del fagosoma, que es la pendiente de la curva de regresión lineal. Se encontró una velocidad de 0,5384 m / min para este fagosoma.
Es de destacar que es posible analizar la velocidad fagosoma durante los primeros minutos después de la internalización, tal como se describe aquí o en Dumas et al. 8, o más tarde mediante el análisis de la velocidad en escalas de tiempo más largos. En nuestro estudio, se observó que la velocidad fagosoma durante los primeros 5 minutos después de la internalización en hMDMs infectados por el VIH es menor en comparación con hMDMs no infectadas (Figura 5B).
Figura 1. Preparación de control y hMDMs infectados por el VIH para formación de imágenes fagocitosis. Los monocitos se purifican por adhesión (1) y diferenciado en macrófagos durante 11 días con M-CSF (2). A continuación, hMDMs están infectadas con VIH-NLR4.3 1Gag-IGFP i) a una MOI entre 0,02 y 0,03 durante 8 días con el lavado en el día 2 (3). (4) SRBCs opsonized-IgG se añaden a hMDMs para la fagocitosis durante 1 hora. Los fagosomas que contienen los eritrocitos de cordero son detectables en las imágenes BF (círculo rojo, ii). Las imágenes son de la base de datos de imágenes Servier. Bar = 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. adquisición en tiempo real durantefagocitosis por el control representativo y hMDMs infectados por el VIH. hMDMs se preparan y se infectaron como se describe en la Figura 1. Se detectan las células NLR4.3 VIH-1Gag-IGFP infectadas con el láser de 491 nm. Z-pilas de disco giratorio confocal de imágenes se adquieren y se analizaron mediante el software de adquisición de microscopio y ImageJ (paneles de la izquierda). Galerías de imágenes BF representan un (paneles superiores correspondientes a la película 1) no infectadas y un NLR4.3 VIH-1Gag-IGFP infectados (paneles inferiores correspondientes a la película 2) celular durante una adquisición de 45 min (46 imágenes con el tiempo indicados como hh : mm). La membrana celular (línea de puntos negro), el núcleo (círculo azul), los eritrocitos de cordero externos (algunos de ellos indican con flechas rojas) y los eritrocitos de cordero internos (algunos de ellos indican con círculos rojos) son detectables en las imágenes BF. Bar = 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Los pasos de manejo para el análisis de imágenes con el plugin Seguimiento manual en ImageJ. Después de abrir el plugin "Manual de Seguimiento" (1) y cargar el video de lapso de tiempo en el canal de BF (2), entran en los parámetros de la adquisición (3). Haga clic en "Añadir pista" (4) e inicie la medición del seguimiento haciendo clic en uno fagosoma (5) para obtener una nueva ventana con las posiciones X e Y del fagosoma elegido (6, caja roja). Para seguir el fagosoma en la secuencia de tiempo por conveniencia, variar el brillo y el contraste (5 '). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Los pasos de manejo para el análisis de datos de velocidad de migración fagosoma en el software de hoja de cálculo. (A) Montar la posición X e Y del núcleo y cada fagosoma (cuadro rojo) en una tabla de hoja de cálculo. En otra columna (caja púrpura), calcular la distancia entre el fagosoma y el núcleo con el teorema de Pitágoras, donde c representa la longitud entre el núcleo y la SRBC y a y b de las longitudes de los otros dos lados de un triángulo rectángulo ( B). (C) Finalmente, se calcula la distancia recorrida por los fagosomas en cada momento (caja verde) restando la distancia entre el SRBC y el núcleo en un momento dado de la distancia inicial en el momento 0. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 5. La cuantificación de la velocidad de migración fagosoma en el control y hMDMs infectados por el VIH. (A) Para cada SRBC y justo después de la internalización SRBC, la distancia recorrida hacia el núcleo se mide y se representa frente al tiempo. Su velocidad durante los primeros 5 minutos se calcula mediante regresión lineal en el software de hoja de cálculo. Un experimento representativo se muestra (la SRBC interna de la figura 3-4). (B) Todas las velocidades durante los primeros 5 minutos se miden durante 66 fagosomas en (5) donantes no infectados y 60 fagosomas en las células infectadas por el VIH (4 donantes). Los datos representan la media ± SEM (t de Student no pareada con corrección de Welch; **, P <0,01). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película 1: movimiento Fagosoma en un macrófago infectado no representativa. . (Haga clic derecho para descargar) se detectó el movimiento de las células rojas de la sangre en el canal opsonized BF durante 45 min de la fagocitosis con una imagen por minuto (46 imágenes con el tiempo indicados como hh: mm). Bar = 10 micras.
Película 2: movimiento Fagosoma en un macrófago infectado por el VIH representativa. (Haga clic derecho para descargar). VIH-1 (VIH-1 NLR4.3 Gag IGFP) infectados por macrófagos fueron identificados después de la iluminación con el láser 491. Se detectó el movimiento de las células rojas de la sangre en el canal opsonizadas BF durante 45min de la fagocitosis con una imagen por minuto (46 imágenes con el tiempo indicados como hh: mm). Bar = 10 micras.
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Discussion
Esta técnica tiene varios pasos críticos. En primer lugar, la preparación de hMDMs y su infección por el VIH-1 es muy importante ya que el porcentaje de infección depende de los donantes. Es de destacar, que hemos decidido utilizar los macrófagos que no están polarizados in vitro antes de la infección, debido a que el estado de los macrófagos potencialmente encontradas por el virus in vivo no ha sido bien caracterizado hasta ahora. Se verificó la expresión de varios marcadores de la superficie, lo que indica que los macrófagos son ni M1 ni M2, y verificado la expresión de CD4 y CCR5. Las tasas de infección son variables y van desde 10 a 40%, y algunas veces inferior. Esta tasa de infección variable es por eso que puede ser difícil encontrar una persona VIH-1 HMDM fluorescente infectado con el microscopio. Además, el tiempo necesario para encontrar una célula infectada por VIH-1 inmediatamente después de la etapa de centrifugación también puede conducir a un retraso en el inicio de la adquisición. La fagocitosis se podría iniciar sin el synchronization de la unión y la absorción generada por centrifugación. Sin embargo, esta opción no fue seleccionado para SRBCs que flotan antes de llegar a las células. Podría ser una buena opción con los granos. Para reducir al mínimo el tiempo necesario para encontrar las células infectadas, platos con fondo de cristal cuadriculada podrían ser utilizados para identificar el VIH-1 hMDMs infectadas antes de proceder a iniciar el ensayo de fagocitosis. Las células infectadas con el VIH seleccionados que tienen un número "razonable" de los eritrocitos de cordero alrededor de ellos entonces serán elegidos de forma rápida para iniciar las adquisiciones. "Cantidad SRBC razonable" significa lo suficiente para tener por lo menos 10 SRBCs por célula y no demasiados para evitar que los eritrocitos de cordero externos de enmascarar los fagosomas.
Además, es importante para optimizar las condiciones de opsonización para asegurar que no habrá reconocimiento y captación eficaz por las células. La fagocitosis mediada por FcR es constitutiva y hMDMs son habitualmente muy eficiente en la captación mediada por FcR. Además, para la fagocitosis correcta, las condiciones tienen que be óptima con la cámara de calentamiento a 37 ° C y 5% de CO2. Es necesario comprobar el gas y la temperatura antes de iniciar el ensayo de fagocitosis.
Por último, la discriminación de SRBCs externos de los fagosomas internos y la identificación del núcleo en el canal de BF son importantes para el análisis en el software ImageJ. Esta es la razón por la configuración de este canal son importantes. Dado que el foco se puede perder durante la adquisición, se recomienda adquirir pilas de imágenes en el eje Z para estar seguro de tener el plano óptimo para analizar la velocidad del fagosoma. Es preferible tener una sola célula en un campo a analizar todos SRBCs internalizados para cada celda. Es por ello que la elección de la lente es importante y aquí hemos utilizado 2 lentes en función del tamaño de la celda. Era más fácil para nosotros encontrar fagosomas con una lente 100X, pero a veces las células eran demasiado grandes, así que tuvimos que cambiar a una lente de 63X. La elección de la lente también es fundamental cuando se piensa imanálisis de la antigüedad utilizando ImageJ y una tabla de hoja de cálculo, porque ambas lentes implican diferentes calibraciones x / y.
La primera limitación de esta técnica es el número de muestras que deben ser adquiridos a tener resultados estadísticamente significativos. Podemos registrar varias películas por donante, pero por lo general no más de 2 células por condición, por plato. Las soluciones a esta limitación para aumentar el número de muestras son para repetir los experimentos con más donantes o hacer imágenes XY de múltiples puntos en función del microscopio. El inconveniente del último método es la pérdida potencial de enfoque durante la exploración XYZ motorizado. Otra limitación es que la cuantificación de la velocidad manual de es largo y tedioso en comparación con un análisis automatizado. Para el análisis automatizado completo, es necesario el uso de las partículas marcadas con fluorescencia, como se informó en estudios pioneros 4 con perlas de látex acoplado a la gelatina de piel de pescado que se siguieron con un algoritmo de seguimiento en software MatLab. Marcada con fluorescencia opsonizantes anticuerpos o perlas podría ser una alternativa, pero están sujetos a la decoloración, que es un problema cuando se graba la fagocitosis por 1 hr. Otros estudios reportan el uso de perlas de látex 13,14. Sin embargo, nos dimos cuenta de que la internalización de las perlas de látex se detecta con menos facilidad que la absorción de los eritrocitos de cordero. De hecho, el punto de partida de la cinética de la migración intracelular es importante saber para detectar los primeros defectos en movimiento phagosomal.
La principal ventaja del método descrito aquí es su simplicidad y el uso de un software libre. Para realizar el seguimiento manual utilizando el software ImageJ, tenemos que utilizar la posición del fagosoma y el núcleo, por lo tanto, tenemos que usar el teorema de Pitágoras para calcular la distancia entre el fagosoma y el núcleo, y de tener la velocidad después de una regresión lineal en el software de hoja de cálculo. Este análisis 3 pasos se puede reducir a un solo paso, el seguimiento, el software de ICY con el & #34;. Tracking Manual "plug-in Los datos de salida son entonces directamente a la velocidad de la partícula a seguir, y más particularmente la velocidad relativa entre los 2 grupos (como los fagosomas y núcleo) Por último, el cálculo nos permite medir la velocidad relativa de. una partícula en comparación con otra partícula, que también puede estar en movimiento.
La posible aplicación futura de este salón un análisis cronológico puede ser de partículas visibles en campo claro, como bacterias, hongos o restos celulares. Los diferentes tratamientos o condiciones de infección suficientes para modificar la maduración phagosomal y las propiedades de activación de los macrófagos se beneficiaría de un análisis tan refinada de movimiento phagosomal hacia el centro de la celda.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | For viral production |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | For acquisition |
| Falcon Tissue Culture Plates 6-well | Thermo Fischer Scientific | Corning. Inc. 353934 | For human monocyte-derived macrophages |
| Ficoll-Plaque PLUS | Dominique Dutscher | 17-1440-03 | a neutral, highly branched, high-mass, hydrophilic polysaccharide in solution for density centrifugation |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | RT |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x, liquid (High Glucose) | GIBCO, Molecular probes | 31966-021 | Conserved at 4 °C ; for HEK cells culture |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | Conserved at 4 °C; for hMDMs culture |
| Fœtal Calf Serum (FCS) | Eurobio | CVFSVF0001 | Conserved at -20 °C ; decomplemented |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fischer Scientific | 15140-122 | Conserved at -20 °C ; for hMDMs culture |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10x 500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37 °C water bath before use ; for phagocytosis assay |
| FuGENE6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Conserved at 4 °C ; for viral production |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4 °C before use |
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | Conserved at 4 °C |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | Conserved at -20 °C |
| Inverted microscope DMI600 | Leica | ||
| Confocal Spinning Disk Unit CSU-X1M1 | Yokogawa | ||
| 491 nm 50 mW laser | COBOLT CALYPSO | ||
| HCX PL APO CS Objectif | Leica | Objective lens ; Magnification 100X ; Numerical aperture 1.40 ; Immersion oil | |
| CoolSnap HQ2 (FireWire) Camera | Photometrics | Pixel size 6.45 µm x 6.45 µm ; Definition 1,392 x 1,040 ; Encoding the image in 14 Bit | |
| Metamorph 7.7.5 software | Molecular Devices | For the control of the microscope | |
| GraphPad Prism software | For the statistics analysis |
References
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