Summary
L'infusione del dotto pancreatico è una tecnica importante che può consentire il tracciamento del lignaggio, l'introduzione del gene e il targeting specifico della linea cellulare. Qui viene presentata una tecnica di infusione del dotto pancreatico per la somministrazione di farmaci e virali alle cellule pancreatiche.
Abstract
Il pancreas è un organo bifunzionale con componenti sia endocrini che esocrini. Un certo numero di patologie possono affliggere il pancreas, tra cui diabete, pancreatite e cancro al pancreas. Tutte e tre queste malattie segnano aree di studio attive, non solo per sviluppare una terapia immediata, ma anche per comprendere meglio la loro fisiopatologia. Ci sono pochi strumenti per promuovere queste aree di studio. L'infusione del dotto pancreatico è una tecnica importante che può consentire il tracciamento del lignaggio, l'introduzione del gene e il targeting specifico della linea cellulare. La tecnica richiede l'intricata dissezione della seconda porzione del duodeno e dell'ampolla, seguita dall'occlusione del dotto biliare e dalla cannolazione del dotto pancreatico. Sebbene la tecnica sia tecnicamente impegnativa all'inizio, le applicazioni sono miriadi. L'ambiguità nelle specifiche della procedura tra i gruppi ha evidenziato la necessità di un protocollo standard. Questo lavoro descrive l'espressione di una proteina fluorescente verde (GFP) all'interno del pancreas dopo l'infusione del dotto pancreatico di un vettore virale che esprime GFP rispetto a un intervento chirurgico fittizio. L'infusione e quindi l'espressione è specifica per il pancreas, senza espressione presente in nessun altro tipo di tessuto.
Introduction
Il pancreas è un organo bifunzionale, con componenti sia endocrini che esocrini. Un certo numero di patologie possono affliggere il pancreas, tra cui diabete, pancreatite e cancro al pancreas1. Tutte e tre queste malattie segnano aree di studio attive, non solo per sviluppare una terapia immediata, ma anche per comprendere meglio la loro fisiopatologia.
Un metodo di somministrazione terapeutica mirato sarebbe utile. Abbiamo sviluppato una tecnica di infusione del dotto pancreatico che è un metodo efficace e selettivo per la somministrazione di farmaci e virus alle cellule pancreatiche. In questo modello, il dotto pancreatico è selettivamente cannulato e il dotto biliare comune è occluso, consentendo la consegna esclusivamente al pancreas.
Questa tecnica può consentire il tracciamento del lignaggio di specifici tipi di cellule per chiarire ulteriormente le vie di sviluppo importanti per lo sviluppo pancreatico e la patologia2,3. Diversi promotori nei vettori virali consentono il targeting specifico delle linee cellulari e l'introduzione di geni in queste linee cellulari4,5. Questo lavoro dimostra l'espressione di una proteina fluorescente verde (GFP) all'interno del pancreas dopo l'infusione del dotto pancreatico di un vettore virale che esprime GFP rispetto a un intervento chirurgico fittizio.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato per la ricerca e la cura degli animali presso l'Ospedale pediatrico di Pittsburgh e dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Pittsburgh.
1. Preparazione preoperatoria
- Somministrare isoflurano per via inalatoria (1 - 3% per il mantenimento e fino al 5% per induzione) attraverso un cono nasale ad un livello anestetico appropriato. Monitorare l'adeguatezza dell'anestesia con il pizzico della dita con una pinza. La mancanza di una risposta è considerata adeguata e assicurarsi di non sovramedicare, poiché può verificarsi depressione respiratoria.
- Posiziona l'animale sulla schiena sullo stadio del microscopio di dissezione, con l'addome centrato in vista dell'obiettivo. Immobilizzare l'animale con nastro chirurgico. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi dell'animale per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
- Applicare uno strato liscio e spesso di crema deolazione e lasciarlo in posizione per 3 minuti. Controllare una piccola area per la depilazione. Pulire delicatamente la crema e i capelli con una garza imbevuta di etanolo al 70%.
- Pulire e disinfettare l'addome dell'animale pulendolo con una garza imbevuta di etanolo al 70% seguita da una garza imbevuta di betadine. Mantenere condizioni sterili durante la procedura chirurgica.
2. Esposizione corretta
- Fai un'incisione della linea mediana nella pelle dal processo xifoide all'ombelico usando un bisturi. Sollevare il peritoneo con pinza Adson e fare un piccolo foro nella linea mediana usando le forbici.
- Estendere l'incisione peritoneale fino alla lunghezza dell'incisione cutanea, avendo cura di rimanere sulla linea mediana (linea alba).
NOTA: Questo produrrà una laparotomia addominale della linea mediana superiore. - Elevare il fegato con riavvolgitori smussati per esporre il dotto biliare comune. Blocca il dotto biliare comune con un morsetto vascolare bulldog curvo.
NOTA: Questa manovra impedisce l'infusione indesiderata nel fegato.
3. Identificazione della Papilla Pancreatica e Della Duodenotomia
- Identificare il duodeno e, con la pinna di Arruga, ritrarlo caudalmente per visualizzare la papilla.
NOTA: La papilla è una macchia bianca sulla superficie anteriore della seconda porzione del duodeno. - Ritrarre il duodeno caudalmente, consentendo l'identificazione del decorso del dotto pancreatico. Con un ago calibro 301/2, perforare la parete del duodeno tangenzialmente, direttamente di fronte alla papilla.
NOTA: l'ago deve seguire lo stesso angolo del condotto quando entra nel duodeno.
4. Infusione.
- Passare il catetere attraverso la duodenotomia creata nel passaggio 3.2 fino a quando il catetere è visibile all'interno del condotto. Far avanzare il catetere nel condotto non più di 1 cm per evitare il bypass degli affluenti duttali minori.
- Bloccare il catetere in posizione con un secondo morsetto vascolare bulldog curvo. Accendere la pompa e infondere il volume selezionato. Il volume infuso può variare da 25 a 250 μL, con un volume ideale di circa 150 μL.
- Somministrare un'iniezione intraperitoneale di circa 1,5 ml di soluzione salina per compensare le perdite. Coprire l'intestino esposto con una garza umida per prevenire l'essiccazione.
- Al termine dell'infusione, rimuovere il morsetto del bulldog che teneva il catetere in posizione. Utilizzare il morsetto bulldog per rimuovere delicatamente il catetere dal dotto pancreatico. Rilasciare il morsetto dal dotto biliare comune.
- Chiudere il peritoneo e la pelle in uno o due strati usando una sutura in esecuzione.
NOTA: non è necessario chiudere la duodenotomia, poiché si sigilla da sola. - Come analgesia postoperatoria, somministrare una dose di ketofene a 5 mg/kg durante la procedura e una il giorno successivo.
- Riportare il mouse nella sua gabbia sotto una lampada di calore fino a quando non si riprende. Fornire al mouse cibo e acqua ad libitum.
- Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha riacquistato una coscienza sufficiente per mantenere la reclinata sternale. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico alla compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ripreso.
5. Preparazione del campione
- Posizionare l'animale in una camera di anidride carbonica o eseguire la lussazione cervicale.
- Raccogli il pancreas, con la milza, il fegato e il duodeno come controlli. Fissare i tessuti in paraformaldeide durante la notte a 4 °C. Crioproteggere il campione in saccarosio al 30% durante la notte, come descritto in precedenza6.
- Snap-freeze i campioni. Sezionare il tessuto ad uno spessore di 6 μm utilizzando un microtomo. Eseguire l'imaging su un microscopio con imaging a fluorescenza, come descritto in precedenza7.
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Representative Results
Con la pratica e un'attenta tecnica chirurgica, il tasso di sopravvivenza di questi topi dovrebbe essere superiore al 95%. Una settimana dopo l'infusione, l'effetto desiderato dovrebbe essere evidente nel pancreas. I topi a 10-12 settimane di età sono stati utilizzati per le infusioni del dotto pancreatico. Qui usiamo un sierotipo 8 del virus adeno-associato (AAV8) con un promotore CMV per esprimere la proteina fluorescente verde (GFP), rispetto a un intervento chirurgico fittizio. I pancreas dei topi sono stati raccolti 7 giorni dopo le infusioni. Sezioni di pancreas, milza e duodeno sono state colorate con anticorpi insulinici e Hoescht. La Figura 1 mostra che esiste un'ampia espressione di GFP in tutto il pancreas nei topi sottoposti a infusione del dotto pancreatico con AAV8, a differenza di quelli sottoposti a chirurgia fittizia. Non vi è espressione nel fegato, nella milza o nel duodeno in questi topi, documentando così la natura selettiva dell'infusione. Questi dati possono essere confermati con diversi altri metodi, compresi i profili di espressione del DNA e dell'RNA.
Figura 1. Espressione di GFP dopo infusione del dotto pancreatico. (a) Chirurgia fittizia rispetto a (b) infusione del dotto pancreatico con AAV8 che esprime GFP. La barra della scala rappresenta 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo lavoro descrive in dettaglio la metodologia alla base dell'infusione del dotto pancreatico, un modello murino efficace per la consegna di geni e altre molecole in modo specifico ed efficace al pancreas. L'ambiguità nelle specifiche della procedura tra i vari gruppi ha evidenziato la necessità di un protocollo standardizzato8,9,10.
Ci sono diversi passaggi critici della procedura, a partire dalla selezione di topi giovani e sani. La perforazione del duodeno, per quanto piccola e controllata, è un evento traumatico nel topo che porta senza dubbio al reclutamento di citochine infiammatorie e altri fattori che non sono stati completamente caratterizzati. Pertanto, una dissezione delicata è cruciale, così come la creazione della più piccola duodenotomia possibile per l'introduzione del catetere. Il passo più importante dell'intera procedura è la cannolazione del dotto pancreatico con il sistema di consegna.
Le difficoltà possono sorgere con un'eccessiva interruzione della papilla pancreatica, portando a una risposta infiammatoria sistemica travolgente. Il pancreas è un organo delicato; nella comunità chirurgica, è colloquialmente descritto come un organo con cui non "scherzare". Le percentuali di successo varieranno solo leggermente con il livello di abilità del praticante. Finché il dotto biliare è correttamente occluso, l'infusione sarà specifica al 100% per il solo pancreas.
La curva di apprendimento per la procedura è piuttosto ripida e la limitazione principale viene superata con la pratica. Come affermato in precedenza, un'eccessiva manipolazione del duodeno e del pancreas può portare a una risposta infiammatoria travolgente che deve essere evitata.
La procedura ha un'ampia applicabilità in molte discipline diverse. Può essere utilizzato come metodo per la consegna mirata di geni attraverso l'uso di specifici vettori virali11. La procedura può anche consentire l'infusione specifica di molecole che aiutano a chiarire la funzione delle cellule pancreatiche. La consegna specifica di alcune molecole è un metodo interessante per modificare le vie di segnalazione all'interno delle isole per produrre proliferazione12. Il sistema può anche ovviare alla necessità di allevamento transgenico producendo direttamente un genotipo e un fenotipo desiderati all'interno del pancreas. Le applicazioni sono miriadi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori non hanno riconoscimenti. I finanziamenti sono stati ricevuti dalla Foundation of Health and Family Planning Commission della provincia di Zhejiang (Grant 20146242) e dalla Foundation of Wenzhou Science & Technology Bureau (Grant Y20140248).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice (25 - 30g, 8-12 weeks old) | Jackson Laboratory | ||
| Ketofen | Henry Schein Inc. | 5487 | |
| Ethanol (70%) | Sigma-Aldrich | 34923 | |
| Sterile Saline Solution | Baxter Healthcare Corp. | 2B-13-00 | |
| Protective Equipment | |||
| Hair Removal Product | Nair or trimmer | ||
| Gauze Pads 2in x 2in | Fisher Healthcare | 22-362-178 | |
| Needles (30.5G and 25G) | Becton Dicksinson and Co. | 305106 and 305122 | |
| Syringe for Ketofen and Saline | Becton Dicksinson and Co. | 309657 | |
| Syringe for Pump | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Infusion Pump | Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Infusion Catheter | World Precision Instruments | CMF31G | |
| Curved Bulldog Clamps (2) | Roboz | RS-7439 | |
| Arruga Forceps | Roboz | RS-5163 | |
| Adson Forcep | Roboz | RS-5234 | |
| Needle Holder | Roboz | RS-7882 | |
| Scissor | Roboz | RS-5982 | |
| Cotton Tip Applicators | Physician Sales and Services | 22-9988 | |
| Dissecting Microscope | |||
| Suture | Owens and Minor | SXMD1B402 |
References
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