Summary
胰腺导管输液是一种重要的技术，可用于谱系追踪、基因导入和细胞系特定靶向。这里介绍了用于药物和病毒输送到胰腺细胞的胰腺导管输液技术。
Abstract
胰腺是一种双功能器官，具有内分泌和外分泌成分。许多病理学可能折磨胰腺，包括糖尿病、胰腺炎和胰腺癌。这三种疾病都标志着活跃的研究领域，不仅是为了开发即时疗法，而且是为了更好地了解它们的病理生理学。很少有工具可以进一步研究这些领域。胰腺导管输液是一种重要的技术，可用于谱系追踪、基因导入和细胞系特定靶向。该技术需要对十二指肠和安普拉的第二部分进行复杂的解剖，然后是胆管的闭塞和胰腺导管的闭合。虽然这项技术在技术上起初具有挑战性，但应用却不尽人格。各组之间程序细节的模糊性突出了制定标准协议的必要性。本工作描述了在胰腺内的绿色荧光蛋白 （GFP） 的表达后，胰腺内的病毒载体注入病毒载体，表达 GFP 与虚假手术。输液和因此表达是特定于胰腺，没有表达存在于任何其他组织类型。
Introduction
胰腺是一种双功能器官，具有内分泌和外分泌成分。许多病理学可能折磨胰腺，包括糖尿病、胰腺炎和胰腺癌。这三种疾病都标志着活跃的研究领域，不仅是为了开发即时疗法，而且是为了更好地了解它们的病理生理学。
有针对性的治疗交付方法将是有益的。我们开发了胰腺导管输液技术，这是药物和病毒输送到胰腺细胞的有效选择性方法。在这个模型中，胰腺导管有选择地被封装，普通胆管被遮盖，允许专门输送到胰腺。
该技术可以使特定细胞类型的血统追踪进一步阐明对胰腺发育和病理学重要的发育路径2，3。病毒载体中的不同促进者允许细胞系的特定靶向，并允许将基因引入这些细胞系4、5。这项工作展示了在胰腺内的绿色荧光蛋白（GFP）的表达后，胰腺内的胰腺管道注入病毒载体表达GFP与虚假手术。
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Protocol
所有动物实验都得到了匹兹堡儿童医院动物研究和护理委员会和匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 术前准备
- 通过鼻锥将吸入的异黄酮（1 - 3% 用于维护，最高 5% 用于感应）管理到适当的麻醉水平。用钳子用脚趾捏监测麻醉的充分性。缺乏反应被认为是足够的，并确保不要过度医疗，因为呼吸抑郁症可能发生。
- 将动物放在解剖显微镜台上，腹部以目标为中心。用手术带固定动物。将眼科软膏涂抹在动物的眼睛上，以防止麻醉时干燥。
- 涂抹光滑、厚实的脱毛霜，并放置3分钟。检查小区域以去除头发。用 70% 乙醇浸泡纱布轻轻擦去奶油和头发。
- 用70%的乙醇浸泡纱布擦拭动物腹部，然后用贝塔丁浸泡纱布清洗和消毒。在整个外科手术过程中保持无菌状态。
2. 适当的曝光
- 使用手术刀在皮肤上做一个中线切口，从木磷化过程到阴道。用 Adson 钳子抬起腹膜，用剪刀在中线打个小洞。
- 将腹膜切口延长至皮肤切口的长度，注意保持在中线（线性阿尔巴）。
注意：这将产生上中线腹部腹腔切除术。 - 用钝缩回器提升肝脏，以暴露常见的胆管。用弯曲的斗牛犬血管夹夹夹住普通的胆管。
注意：此策略可防止不受欢迎的输注到肝脏中。
3. 胰腺巴皮拉和双核切除术的鉴定
- 识别十二指肠，并用阿鲁加钳子，收回它刻薄地显示。
注：瘤是十二指肠第二部分前表面的白点。 - 以凹槽方式收回十二指肠，以便识别胰腺导管的路线。用301×2口径的针头，将十二指肠的墙壁切成切线，直接在对面。
注：针头在进入十二指肠时应遵循与导管相同的角度。
4. 输液。
- 通过导管通过第 3.2 步创建的十二指肠切除术，直到导管内可见导管。将导管推进到导管中不超过 1 厘米，以防止小导管支流旁路。
- 用第二个弯曲的斗牛犬血管夹紧导管。打开泵并注入选定的音量。注入的体积范围可能为 25 - 250 μL，理想体积约为 150 μL。
- 管理约1.5兆瓦盐水的腹内注射，以抵消损失。用湿润的纱布盖住暴露的肠道，以防止干燥。
- 输液结束时，取出将导管保持到位的斗牛犬夹。使用斗牛犬夹轻轻地从胰腺导管中取出导管。从普通胆管中释放夹子。
- 使用运行的缝合线将腹膜和皮肤关闭一到两层。
注：没有必要关闭十二指肠切除术，因为它将自行密封。 - 作为术后镇痛，在手术过程中以5毫克/千克的剂量施用酮芬，第二天服用一剂酮芬。
- 将鼠标放回热灯下的笼子，直到它恢复。为鼠标提供食物和水。
- 在动物恢复足够的意识以保持胸骨再部之前，不要让动物无人看管。在动物完全康复之前，不要将接受过手术的动物送回其他动物的陪伴下。
5. 样品制备
- 将动物放在二氧化碳室或进行颈椎错位。
- 收获胰腺，脾脏，肝脏和十二指肠作为对照。在 4 °C 下将组织在半甲醛中修复过夜。 冷冻保护样品在30%蔗糖过夜，如前所述6。
- 捕捉冻结样品。使用微原子将组织切成厚度为 6 μm 的组织。如前所述，在显微镜上用荧光成像进行成像。
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Representative Results
通过实践和细致的手术技术，这些小鼠的成活率应在95%以上。输液一周后，预期效果应在胰腺中明显。10至12周大的小鼠被用于胰腺管输液。在这里，我们使用腺相关病毒血清类型8（AAV8）与CMV促进剂来表达绿色荧光蛋白（GFP），相比之下，一个虚假的手术。小鼠胰腺在输液7天后被收获。胰腺、脾脏和十二指肠部分沾有胰岛素抗体和霍施特。 图1 显示，在接受AAV8胰腺管输液的小鼠中，整个胰腺中广泛表达GFP，而不是那些接受假手术的小鼠。这些小鼠的肝脏、脾脏或十二指肠没有表情，从而记录了输液的选择性。这些数据可以通过其他几种方法得到确认，包括DNA和RNA表达特征。
图1。胰腺管输液后GFP的表达。（a）与（b）胰腺管输液与 AAV8 表达 GFP 相比， 沙姆手术。刻度条表示 50 μm。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
本研究详细描述了胰腺导管输注背后的方法，这是一种有效的小鼠模型，用于将基因和其他分子具体而有效地输送到胰腺。各组之间程序细节的模糊性突出了标准化协议8、9、10的必要性。
有几个关键步骤的程序，从选择年轻，健康的老鼠开始。十二指肠穿孔，无论多么小和可控，是鼠标中的创伤性事件，无疑会导致炎症细胞因子的招募和其他尚未完全特征的因素。因此，精密的解剖至关重要，因为创建最小的十二指肠切除术可能引入导管。整个过程最重要的一步是胰腺导管与输送系统的罐装。
胰腺的过度中断可能会产生困难，导致压倒性的全身炎症反应。胰腺是一种细腻的器官：在外科社区，它被口语描述为一个器官不"混乱"。成功率只会与从业者技能水平略有不同。只要胆管被正确遮挡，输液将100%只针对胰腺。
程序的学习曲线相当陡峭，主要局限性是通过实践来克服的。如前所述，过度操纵十二指肠和胰腺可导致压倒性的炎症反应，必须避免。
该程序在许多不同的学科中具有广泛的适用性。它可以通过使用特定的病毒载体11作为靶向基因传递的方法。该程序还允许分子的特定输注，有助于阐明胰腺细胞功能。某些分子的具体输送是改变小岛内信号通路以产生增殖12的一种有吸引力的方法。该系统还可以通过直接在胰腺内产生所需的基因型和表型来避免转基因育种的需要。申请是无数的。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者没有承认。浙江省卫生与计划生育委员会基金会（20146242赠款）和温州市科技局基金会（赠款Y20140248）提供了资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice (25 - 30g, 8-12 weeks old) | Jackson Laboratory | ||
| Ketofen | Henry Schein Inc. | 5487 | |
| Ethanol (70%) | Sigma-Aldrich | 34923 | |
| Sterile Saline Solution | Baxter Healthcare Corp. | 2B-13-00 | |
| Protective Equipment | |||
| Hair Removal Product | Nair or trimmer | ||
| Gauze Pads 2in x 2in | Fisher Healthcare | 22-362-178 | |
| Needles (30.5G and 25G) | Becton Dicksinson and Co. | 305106 and 305122 | |
| Syringe for Ketofen and Saline | Becton Dicksinson and Co. | 309657 | |
| Syringe for Pump | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Infusion Pump | Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Infusion Catheter | World Precision Instruments | CMF31G | |
| Curved Bulldog Clamps (2) | Roboz | RS-7439 | |
| Arruga Forceps | Roboz | RS-5163 | |
| Adson Forcep | Roboz | RS-5234 | |
| Needle Holder | Roboz | RS-7882 | |
| Scissor | Roboz | RS-5982 | |
| Cotton Tip Applicators | Physician Sales and Services | 22-9988 | |
| Dissecting Microscope | |||
| Suture | Owens and Minor | SXMD1B402 |
References
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