Summary
Pancreaskanaalinfusie is een belangrijke techniek die lineage tracing, genintroductie en cellijnspecifieke targeting mogelijk kan maken. Een pancreaskanaalinfusietechniek voor medicijn- en virale toediening aan pancreascellen wordt hier gepresenteerd.
Abstract
De alvleesklier is een bifunctioneel orgaan met zowel endocriene als exocriene componenten. Een aantal pathologieën kunnen de alvleesklier treffen, waaronder diabetes, pancreatitis en alvleesklierkanker. Alle drie deze ziekten markeren actieve studiegebieden, niet alleen om onmiddellijke therapie te ontwikkelen, maar ook om hun pathofysiologie beter te begrijpen. Er zijn weinig instrumenten om deze studiegebieden te bevorderen. Pancreaskanaalinfusie is een belangrijke techniek die lineage tracing, genintroductie en cellijnspecifieke targeting mogelijk kan maken. De techniek vereist de ingewikkelde dissectie van het tweede deel van de twaalfvingerige darm en ampulla, gevolgd door de occlusie van het galkanaal en de cannulatie van het pancreaskanaal. Hoewel de techniek in het begin technisch uitdagend is, zijn de toepassingen ontelbare. Onduidelijkheid in de specifieke kenmerken van de procedure tussen groepen benadrukte de noodzaak van een standaardprotocol. Dit werk beschrijft de expressie van een groen fluorescerend eiwit (GFP) in de alvleesklier na de infusie van een virale vector die GFP uitdrukt versus een schijnoperatie. De infusie en dus expressie is specifiek voor de alvleesklier, zonder expressie aanwezig in een ander weefseltype.
Introduction
De alvleesklier is een bifunctioneel orgaan, met zowel endocriene als exocriene componenten. Een aantal pathologieën kan de alvleesklier treffen, waaronder diabetes, pancreatitis en alvleesklierkanker1. Alle drie deze ziekten markeren actieve studiegebieden, niet alleen om onmiddellijke therapie te ontwikkelen, maar ook om hun pathofysiologie beter te begrijpen.
Een gerichte therapeutische toedieningsmethode zou nuttig zijn. We hebben een pancreaskanaalinfusietechniek ontwikkeld die een effectieve en selectieve methode is voor medicijn- en virale toediening aan pancreascellen. In dit model wordt het pancreaskanaal selectief gekanuleerd en wordt het gemeenschappelijke galkanaal afgesloten, waardoor de alvleesklier uitsluitend kan worden geleverd.
Deze techniek kan het mogelijk maken om specifieke celtypen af te sporen om de ontwikkelingsroutes die belangrijk zijn voor de ontwikkeling van de pancreas en pathologie verder te verduidelijken2,3. Verschillende promotors in virale vectoren maken de specifieke targeting van cellijnen mogelijk en voor de introductie van genen in deze cellijnen4,5. Dit werk toont de expressie van een groen fluorescerend eiwit (GFP) in de alvleesklier na de infusie van een virale vector die GFP uitdrukt versus een schijnoperatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden goedgekeurd door het Animal Research and Care Committee van het Children's Hospital of Pittsburgh en het University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Preoperatieve voorbereiding
- Toedien ingeademde isofluraan (1 - 3% voor onderhoud en tot 5% voor inductie) via een neuskegel tot een geschikt verdovingsniveau. Controleer de geschiktheid van anesthesie door teenknijpen met een tang. Het ontbreken van een reactie wordt als adequaat beschouwd en zorg ervoor dat u niet te veel medicijnen geeft, omdat ademhalingsdepressie kan optreden.
- Plaats het dier op zijn rug op het stadium van de ontledingsmicroscoop, met de buik gecentreerd met het oog op het doel. Immobiliseer het dier met chirurgische tape. Breng oogzalf aan op de ogen van het dier om uitdroging te voorkomen onder narcose.
- Breng een gladde, dikke laag ontharingscrème aan en laat deze 3 minuten op zijn plaats zitten. Controleer een klein gebied voor ontharing. Veeg de crème en het haar voorzichtig af met 70% met ethanol doordrenkt gaas.
- Reinig en desinfecteer de buik van het dier door het af te vegen met een met 70% ethanol doordrenkt gaas gevolgd door een met betadine doordrenkt gaas. Behoud steriele omstandigheden tijdens de chirurgische ingreep.
2. Juiste blootstelling
- Maak een middellijnincisie in de huid van het xyphoid-proces naar de umbilicus met behulp van een scalpel. Til het peritoneum op met adson tang en maak een klein gaatje in de middellijn met een schaar.
- Verleng de peritoneale incisie tot de lengte van de huidincisie en zorg ervoor dat deze op de middellijn blijft (linea alba).
OPMERKING: Dit zal een bovenste midline abdominale laparotomie produceren. - Verhef de lever met stompe oprolmechanismen om de gemeenschappelijke galwegen bloot te leggen. Klem het gemeenschappelijke galkanaal met een gebogen bulldog vasculaire klem.
OPMERKING: Deze manoeuvre voorkomt ongewenste infusie in de lever.
3. Identificatie van de pancreas papilla en duodenotomie
- Identificeer de twaalfvingerige darm en trek deze met Arruga-tang caudale in om de papilla weer te geven.
OPMERKING: De papilla is een witte vlek op het voorste oppervlak van het tweede deel van de twaalfvingerige darm. - Trek de twaalfvingerige darm cauaudaal in, zodat het verloop van het pancreaskanaal kan worden geïdentificeerd. Prik met een 301/2-gauge naald de wand van de twaalfvingerige darm tangentially, direct tegenover de papilla.
OPMERKING: De naald moet dezelfde hoek volgen als het kanaal wanneer deze in de twaalfvingerige darm komt.
4. Infusie.
- Doorloop de katheter door de duodenotomie die in stap 3.2 is gemaakt totdat de katheter zichtbaar is in het kanaal. Schuif de katheter niet meer dan 1 cm in het kanaal om te voorkomen dat kleine zijrivieren van de kanaalgang worden omzeild.
- Klem de katheter op zijn plaats met een tweede gebogen bulldog vasculaire klem. Schakel de pomp in en geef het geselecteerde volume door. Het geïnfundeerde volume kan variëren van 25 - 250 μL, met een ideaal volume van ongeveer 150 μL.
- Dien een intraperitoneale injectie van ongeveer 1,5 ml zoutoplossing toe om verliezen te compenseren. Bedek de blootgestelde darm met een vochtig gaas om uitdroging te voorkomen.
- Verwijder aan het einde van de infusie de bulldogklem die de katheter op zijn plaats hield. Gebruik de bulldogklem om de katheter voorzichtig uit het pancreaskanaal te verwijderen. Maak de klem los van het gemeenschappelijke galkanaal.
- Sluit het peritoneum en de huid in een of twee lagen met behulp van een lopende hechtdraad.
OPMERKING: Het is niet nodig om de duodenotomie te sluiten, omdat deze vanzelf zal verzegelen. - Als postoperatieve analgesie dient u een dosis ketofen toe te dienen bij 5 mg/kg tijdens de procedure en één op de volgende dag.
- Breng de muis terug naar zijn kooi onder een hittelamp totdat hij herstelt. Voorzie de muis van voedsel en water ad libitum.
- Laat het dier niet onbeheerd achter totdat het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om de sternale ligfiets te behouden. Breng een dier dat een operatie heeft ondergaan niet terug naar het gezelschap van andere dieren totdat het volledig is hersteld.
5. Monstervoorbereiding
- Plaats het dier in een kooldioxidekamer of voer cervicale dislocatie uit.
- Oogst de alvleesklier, met de milt, lever en twaalfvingerige darm als controles. Bevestig de weefsels in paraformaldehyde 's nachts bij 4 °C. Cryoprotect het monster in 30% sucrose 's nachts, zoals eerder beschreven6.
- Bevries de monsters. Doorsnede van het weefsel met een dikte van 6 μm met behulp van een microtome. Beeldvorming uitvoeren op een microscoop met fluorescentiebeeldvorming, zoals eerder beschreven7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met oefening en zorgvuldige chirurgische techniek moet de overlevingskans van deze muizen groter zijn dan 95%. Een week na infusie moet het gewenste effect duidelijk zijn in de alvleesklier. Muizen van 10 tot 12 weken oud werden gebruikt voor infusies van pancreaskanalen. Hier gebruiken we een adeno-geassocieerd virus serotype 8 (AAV8) met een CMV promotor om groen fluorescerend eiwit (GFP) uit te drukken, in vergelijking met een schijnoperatie. Muizen alvleesklier werden geoogst 7 dagen na de infusies. Delen van alvleesklier, milt en twaalfvingerige darm waren bevlekt met insulineantilichaam en Hoescht. Figuur 1 laat zien dat er een uitgebreide expressie van GFP in de hele alvleesklier is bij de muizen die pancreaskanaalinfusie met AAV8 ondergingen, in tegenstelling tot muizen die een schijnoperatie ondergingen. Er is geen expressie in de lever, milt of twaalfvingerige darm bij deze muizen, waardoor de selectieve aard van de infusie wordt documenteerd. Deze gegevens kunnen worden bevestigd met verschillende andere methoden, waaronder DNA- en RNA-expressieprofielen.
Figuur 1. Expressie van GFP na pancreaskanaalinfusie. a) Schijnchirurgie in vergelijking met b) infusie van pancreaskanalen met AAV8 die GFP uitdrukt. De schaalbalk vertegenwoordigt 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit werk beschrijft in detail de methodologie achter pancreaskanaalinfusie, een effectief muismodel voor de levering van genen en andere moleculen specifiek en effectief aan de alvleesklier. Onduidelijkheid in de bijzonderheden van de procedure tussen verschillende groepen benadrukte de noodzaak van een gestandaardiseerd protocol8,9,10.
Er zijn verschillende kritieke stappen van de procedure, te beginnen met de selectie van jonge, gezonde muizen. Perforatie van de twaalfvingerige darm, hoe klein en gecontroleerd ook, is een traumatische gebeurtenis in de muis die ongetwijfeld leidt tot de rekrutering van inflammatoire cytokinen en andere factoren die niet volledig zijn gekarakteriseerd. Daarom is een delicate dissectie cruciaal, net als het creëren van de kleinste duodenotomie die mogelijk is voor de introductie van de katheter. De belangrijkste stap van de hele procedure is de cannulatie van het pancreaskanaal met het toedieningssysteem.
Problemen kunnen optreden met overmatige verstoring van de pancreaspapillen, wat leidt tot een overweldigende systemische ontstekingsreactie. De alvleesklier is een delicaat orgaan; in de chirurgische gemeenschap wordt het in de volksmond beschreven als een orgaan om niet mee te "rommelen". Slagingspercentages zullen slechts enigszins variëren met het vaardigheidsniveau van de beoefenaar. Zolang de galwegen goed zijn afgesloten, is de infusie alleen al 100% specifiek voor de alvleesklier.
De leercurve voor de procedure is vrij steil en de belangrijkste beperking wordt overwonnen met de praktijk. Zoals eerder vermeld, kan overmatige manipulatie van de twaalfvingerige darm en alvleesklier leiden tot een overweldigende ontstekingsreactie die moet worden vermeden.
De procedure heeft een brede toepasbaarheid in veel verschillende disciplines. Het kan worden gebruikt als een methode voor gerichte genafgifte door het gebruik van specifieke virale vectoren11. De procedure kan ook de specifieke infusie van moleculen mogelijk maken die helpen bij het ophelderen van de pancreascelfunctie. De specifieke levering van bepaalde moleculen is een aantrekkelijke methode om de signaleringsroutes binnen de eilandjes aan te passen om proliferatie te produceren12. Het systeem kan ook de noodzaak van transgene veredeling weglaten door direct een gewenst genotype en fenotype in de alvleesklier te produceren. De toepassingen zijn ontelbare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
De auteurs hebben geen erkenningen. De financiering werd ontvangen van de Foundation of Health and Family Planning Commission van de provincie Zhejiang (Grant 20146242) en de Foundation of Wenzhou Science &Technology Bureau (Grant Y20140248).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice (25 - 30g, 8-12 weeks old) | Jackson Laboratory | ||
| Ketofen | Henry Schein Inc. | 5487 | |
| Ethanol (70%) | Sigma-Aldrich | 34923 | |
| Sterile Saline Solution | Baxter Healthcare Corp. | 2B-13-00 | |
| Protective Equipment | |||
| Hair Removal Product | Nair or trimmer | ||
| Gauze Pads 2in x 2in | Fisher Healthcare | 22-362-178 | |
| Needles (30.5G and 25G) | Becton Dicksinson and Co. | 305106 and 305122 | |
| Syringe for Ketofen and Saline | Becton Dicksinson and Co. | 309657 | |
| Syringe for Pump | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Infusion Pump | Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Infusion Catheter | World Precision Instruments | CMF31G | |
| Curved Bulldog Clamps (2) | Roboz | RS-7439 | |
| Arruga Forceps | Roboz | RS-5163 | |
| Adson Forcep | Roboz | RS-5234 | |
| Needle Holder | Roboz | RS-7882 | |
| Scissor | Roboz | RS-5982 | |
| Cotton Tip Applicators | Physician Sales and Services | 22-9988 | |
| Dissecting Microscope | |||
| Suture | Owens and Minor | SXMD1B402 |
References
- Gittes, G. K. Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review. Dev Biol. 326 (1), 4-35 (2009).
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
- Weinberg, N., Ouziel-Yahalom, L., Knoller, S., Efrat, S., Dor, Y. Lineage tracing evidence for in vitro dedifferentiation but rare proliferation of mouse pancreatic beta-cells. Diabetes. 56 (5), 1299-1304 (2007).
- Raper, S. E., DeMatteo, R. P. Adenovirus-mediated in vivo gene transfer and expression in normal rat pancreas. Pancreas. 12 (4), 401-410 (1996).
- Xiao, X., et al. Pancreatic cell tracing, lineage tagging and targeted genetic manipulations in multiple cell types using pancreatic ductal infusion of adeno-associated viral vectors and/or cell-tagging dyes. Nat Protoc. 9 (12), 2719-2724 (2014).
- Song, Z., et al. EGFR signaling regulates beta cell proliferation in adult mice. J Biol Chem. 291 (43), (2016).
- Xiao, X., et al. M2 macrophages promote beta-cell proliferation by up-regulation of SMAD7. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1211-E1220 (2014).
- Laukkarinen, J. M., Van Acker, G. J., Weiss, E. R., Steer, M. L., Perides, G. A mouse model of acute biliary pancreatitis induced by retrograde pancreatic duct infusion of Na-taurocholate. Gut. 56 (11), 1590-1598 (2007).
- Lichtenstein, A., et al. Acute lung injury in two experimental models of acute pancreatitis: infusion of saline or sodium taurocholate into the pancreatic duct. Crit Care Med. 28 (5), 1497-1502 (2000).
- Perides, G., van Acker, G. J., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nat Protoc. 5 (2), 335-341 (2010).
- Guo, P., et al. Specific transduction and labeling of pancreatic ducts by targeted recombinant viral infusion into mouse pancreatic ducts. Lab Invest. 93 (11), 1241-1253 (2013).
- Xiao, X., et al. Neurogenin3 activation is not sufficient to direct duct-to-beta cell transdifferentiation in the adult pancreas. J Biol Chem. 288 (35), 25297-25308 (2013).
