Abstract
Monolaag celcultuur niet adequaat model van de in vivo gedrag van weefsels, die complexe cel-cel en cel-matrix interacties omvat. Driedimensionale (3D) celkweektechnieken een recente innovatie ontwikkeld om de tekortkomingen van hechtende celkweek pakken. Hoewel verschillende technieken voor het genereren van weefsel analogen in vitro ontwikkeld, deze werkwijzen zijn vaak complex, duur om, vereisen gespecialiseerde apparatuur en meestal beperkt door verenigbaarheid met slechts bepaalde celtypen. We beschrijven hier een snelle en flexibele protocol voor het aggregeren cellen tot multicellulaire sferoïden 3D consistente grootte die compatibel is met een groei van verschillende tumor en normale cellijnen. Wij gebruiken variërende concentraties serum en methylcellulose (MC) om verankering-onafhankelijke sferoïde generatie bevorderen en op zeer reproduceerbare wijze de vorming van celmonolagen. Optimale omstandigheden voor individual cellijnen kunnen worden verwezenlijkt door de MC of serumconcentraties in het bolvormige formatie medium. De 3D sferoïden gegenereerd kan worden verzameld voor gebruik in een breed scala van toepassingen, waaronder cell signaling of gene expression studies, testgeneesmiddel screening, of de studie van cellulaire processen zoals tumorcel invasie en migratie. Het protocol wordt ook direct aangepast om klonale sferoïden van enkelvoudige cellen genereren, en kan worden aangepast om verankering-onafhankelijke groei en anoikis weerstand beoordelen. Overall, ons protocol bevat een gemakkelijk aanpasbaar werkwijze voor het genereren en gebruik 3D cellen sferoïden om de 3D micromilieu van weefsels recapituleren en het model van de in vivo groei van normale en tumorcellen.
Introduction
Biologisch relevante beoordeling van het gedrag van tumorcellen is een uitdaging met behulp van traditionele tweedimensionale (2D) celcultuur methoden, deels omdat deze niet voldoende afgestemd op het cel micro-omgeving gevonden in vivo. Alternatieve benaderingen waarin extracellulaire matrixcomponenten in de cultuur (bijvoorbeeld Boyden kamer assays) zijn fysiologisch representatief voor de in vivo weefselomgeving. Echter kunnen deze worden beperkt tot beoordeling van individuele gedrag van cellen en kan het complex in vivo combinaties van cel-matrix en cel-cel interacties die bijdragen aan weefsel of tumorgroei 1, 2, 3 niet herhalen.
Het gebruik van multicellulaire sferoïden is een recente aanpak die nauwkeuriger reproduceert de compacte architectuur van in vivo celgroei 1,4. Sferoïden kunnen worden gebruikt om cel-matrix interacties van normale cellen te onderzoeken, maar kan ook als tumor analogen kenmerken van tumorprogressie, zoals metastatische groei of geneesmiddelresistentie 4 modelleren.
Sferoïden worden gevormd door de proliferatie van afzonderlijke cellen ingebed in een matrix 5, of sneller, door het bevorderen van de aggregatie van meerdere cellen aan een cluster cellen (bv opknoping druppel, centrifugatiewerkwijzen) 6, 7 vormen. Bestaande cel aggregatie technieken kunnen kostbare materialen of gespecialiseerde apparatuur nodig. Bovendien hebben deze bolletjes hebben een breed scala aan afmetingen en morfologieën en kan moeilijk te produceren in grote hoeveelheden, het vergelijken van kweekomstandigheden of behandelingen moeilijk. Tenslotte kunnen sferoïden die door deze werkwijzen moeilijk te isoleren uit het eiwitmateriaal extracellaire matrix waarin ze zijn ingebed voor gebruik in andere toepassingen.
Hier beschrijven we een robuuste en gemakkelijk aanpasbaar celaggregatie methodologie voor de snelle vorming van gelijkvormige cellen sferoïden gebruikmaking van commercieel verkrijgbare U-bottom cell afstotend platen en een inert adhesiebevorderende matrix, methylcellulose. Eenmaal gevormd, worden deze multicellulaire sferoïden eenvoudig worden geïsoleerd voor gebruik in een breed scala van toepassingen. Het protocol is ook gemakkelijk aangepast sferoïden door middel van celproliferatie, die kunnen worden gebruikt om andere celprocessen beoordelen genereren. Hier tonen wij celinvasie assays gekwantificeerd door immunofluorescentie kleuring en een anoikis assay, zoals bijvoorbeeld toepassingen van deze twee sferoïde vorming protocollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: Alle reagentia en hulpstoffen worden opgenomen in de Materials List.
1. Sferoïde productie door Cell Aggregation
- Methylcellulose oplossing: Bereid 100 ml 100 mg / ml methylcellulose.
- Warmte 50 ml ultrapuur H 2 O tot 80 ° C. Voeg 10 g methylcellulose poeder en schud totdat de deeltjes gelijkmatig worden verspreid.
- Breng eindvolume met koude ultrapuur H 2 O en roer bij 4 ° C totdat de oplossing helder wordt, stro gekleurd en bevat geen zichtbare vaste stoffen.
- Passeren door een 0,45 urn filter om onopgeloste vaste stoffen te verwijderen. Bereide oplossing worden hoeveelheden verdeeld en maximaal 12 maanden bewaard bij 4 ° C.
OPMERKING: Methylcellulose vormt een niet-cytotoxisch, inert, suspendeermiddel tot cel-cel adhesie te verbeteren en ontmoedigen de vorming van een hechtende monolaag. Methyl cellulose is oplosbaar in water en weg kan volgende koba worden gewassenoid generatie.
- Sferoïde formatie medium
LET OP: Bereid sferoïde vorming medium onmiddellijk voor gebruik. Niet bewaren.- Methylcellulose verdunde oplossing van 1-5 mg / ml in het juiste kweekmedium.
- Passeren door een 0,22 pm filter te steriliseren en te verwijderen onopgeloste vaste stoffen.
- Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)
- Verdun tot 1x en passeren door een 0,45 pm filter voor gebruik. Bereide oplossing kan onbeperkt worden bewaard bij kamertemperatuur.
- Cel sferoïde productie (figuur 1)
OPMERKING: Bereid alle reagentia vooraf. Het is belangrijk om besmetting van oplossingen door stof, vezels of andere onoplosbare deeltjes te voorkomen. De aanwezigheid van deze contaminanten zal aantasten sferoïde vorming. Kweekmedium en andere oplossingen moeten worden door een 0,45 urn filter om deze deeltjes te verwijderen wanneer poslijk. Gebruik geen katoen gefiltreerd pipetten bij het overbrengen van oplossingen als deze extra vezels kunnen introduceren.- Cultuur celmonolagen tot 70% confluentie in het juiste kweekmedium aangevuld met 10% serum. Aspireren kweekmedium en spoel met 1x PBS om vuil te verwijderen. Voeg 3 ml trypsine-EDTA (0,05% trypsine) dissociatie buffer een 10 cm celkweekschaal en incubeer cellen bij 37 ° C en 5% CO2.
- Inspecteer cellen onder de microscoop bij 10x vergroting onthechting te bevestigen. Neutraliseren dissociatie buffer met 7 ml-serum aangevuld kweekmedium.
- Centrifugeer celsuspensie bij 500 xg gedurende 10 min zachtjes pellet cellen.
- Verwijder supernatant. Resuspendeer celpellet in 1 ml bolvormige formatie medium met behulp van een P1000 pipet met een filter tip.
NB: De celsuspensie moet vrij zijn van klonten zijn.- Naar cel pellet vermaal, drukt u op de pipet tip tegen de bodem van de buis onder een lichte hoek, terwijlpipetteren naar cel pellet te scheren. Vermijd tritureren meer dan 3-5 keer deze cellen kan beschadigen. Pipet langzaam en niet gehele inhoud van de pipet tip verdrijven om te voorkomen dat het creëren van bubbels.
- Aantal cellen met een hemocytometer en verdunde celsuspensie tot 1 x 10 4 cellen / ml.
OPMERKING: Het aantal cellen kan worden geoptimaliseerd om sferoïden van verschillende grootte te genereren. Trypan blauw kleuring van beschadigde cellen kunnen worden gebruikt om de levensvatbaarheid van geresuspendeerde cellen bevestigen. - Overdracht celsuspensie in een steriele, stofvrije multichannel pipet reservoir en het gebruik van filter tips om 100 ul af te geven in elk putje van een 96-wells U-bodem cel-afstotend plaat.
- Spoel het reservoir met gefilterd ultrapuur H 2 O om stof en vezels te verwijderen.
- Meng de celsuspensie periodiek tijdens enten voorkomen cellen zich afzet op de bodem van het reservoir. Om te voorkomen dat het creëren van bubbels, gebruik maken van een omgekeerde pipetteertechniek tijdens het mengen en dispensing.
- Overdrachtsplaten weefselkweek incubator (37 ° C en 5% CO2) en dagelijks controleer sferoïde vorming. De cellen moeten naar de bodem van elk putje in 6 uur en in het algemeen samen te voegen tot een sferoïde binnen 24-48 h (figuur 2).
- Ter bevestiging van de succesvolle sferoïde formatie, gebruik dan een p10 tip en voorzichtig pipet medium over de bolvormige inachtneming onder een microscoop bij 10x vergroting. Behoorlijk gevormd sferoïden zullen los te maken van de plaat en roll, bevestigen van hun 3D-structuur.
OPMERKING: Methylcellulose en serum concentraties worden bepaald door titratie voor elke cellijn vorming van een sferoïde opbrengst per putje. Voorwaarden op deze wijze geoptimaliseerd voor geselecteerde cellijnen zijn getoond in tabel 1, en voorbeelden van de sferoïden gevormd in figuur 2B. Sferoïden worden gekweekt langer dan aanbevolen, maar ze groter worden ze groeien steeds moeilijkerte hanteren zonder fragmentatie. Als cellen vormen een monolaag, satelliet sferoïden, of niet naar de bodem van de put, moet de concentratie van methylcellulose en serum verder worden aangepast voor optimale sferoïde vorming (Figuur 3B). Niet sferoïden bevat verontreinigingen zoals vezels of stof (figuur 3A) te gebruiken. Voorgevormde sferoïden kunnen worden behandeld met verbindingen van belang, zoals groeifactoren, live cell vlekken of remmers voor analyse.
2. Sferoïde Invasion Assay (figuur 4)
- geneutraliseerd collageen
- Koel alle vloeistoffen tot 4 ° C en houd op ijs bij het werken met collageen om ongewenste polymerisatie te voorkomen.
- Bereid verse 0,1 M en 0,01 M oplossingen van NaOH en verse 0,1 M HCl in ultrapuur H 2 O. Pass alle oplossingen door middel van 0,22 pm filters.
- Meng bovine type 1 collageen (3,1 mg / ml voorraad), 0,01 M NaOH en 10x PBS (8: 1: 1 volumeverhouding) en op pH 7,4 met koud 0,1 M NaOH en HCl. De eindconcentratie van collageen is 2,5 mg / ml.
- Bereid voldoende geneutraliseerd collageen om de afbeeldingsvat vullen tot een diepte van 2-3 mm. Een minimum van 100 ul vereist voor elk putje van de 8-well tissue kweekkamer slide in materialen opgesomd.
- Inbedding sferoïden in collageen (figuur 4)
- Bedek de bodem van elk putje van een 8-well weefselkweek kamer dia met een minimum van 50 pi geneutraliseerde collageen.
- Gebruik reverse pipetteertechniek om te voorkomen dat bellen in het collageen. Gebruik de pipet tip om het collageen gelijkmatig verdeeld over het oppervlak goed.
LET OP: Deze collageen basislaag zal bolletjes in suspensie te houden en is typisch 1-2 mm dik. De basislaag minimaliseert vorming van een meniscus op de bovenkant collageenlaag. Als de basislaag is te dun, kan sferoïden contact maken met de bodem van de kamer glijbaan envormen een cel monolaag.
- Gebruik reverse pipetteertechniek om te voorkomen dat bellen in het collageen. Gebruik de pipet tip om het collageen gelijkmatig verdeeld over het oppervlak goed.
- Plaats de kamer schuif, en een 35 mm weefselkweekplaat gevuld met ultrapuur H 2 O, in een 10 cm weefselkweek schaaltje. Incubeer bij 37 ° C totdat het collageen wordt gepolymeriseerd, typisch 1 uur. Store resterende geneutraliseerd collageen op ijs.
OPMERKING: De watergevulde 35 mm schotel zal vocht zorgen en uitdroogt. De kamer slide moet deze vochtkast verandert gedurende de meting blijven. Het collageen basislaag kan worden gedurende de nacht polymeriseren. Langere incubaties meestal tot gevolg dat stijver gel. - Met behulp van een p1,000 filter tip, verzamelen voorgevormde sferoïden (stap 1.4.7) van de 96-well U-bodem cel-afstotend plaat 1,5 ml snap top buizen. Pipet langzaam en vermijd herhaalde of krachtig pipetteren om vloeistof-afschuiving van bolvormige deeltjes te minimaliseren. Meerdere sferoïden worden samengevoegd in een enkele buis voor overdracht naar een putje van de 8-well tissue kweekkamer slide.
- Centrifugeer de verzamelde sferoïden in een tabletop microcentrifuge bij 2000 xg gedurende 2-5 s en verwijder supernatant met behulp van een p200 pipet. Vermijd centrifugeren langer dan nodig is, omdat dit kan ertoe leiden dat de bolletjes breekt of samenklonteren.
LET OP: Na het pipetteren van het grootste deel van de bovenstaande, de buis kan worden omgekeerd voorzichtig over een schone papieren handdoek om weg lont overtollige vloeistof. Sta niet toe dat bolvormige deeltjes te drogen. - Met behulp van een breed boring P200 tip, zachtjes resuspendeer sferoïden in 50 ul geneutraliseerd collageen. Doe dit voor elke buis van de verzamelde sferoïden voordat er sferoïden worden overgebracht in de kamer dia. Houd bolvormige deeltjes die zijn gesuspendeerd in geneutraliseerd collageen op ijs pas klaar voor overdracht naar de kamer dia's.
- Verwijder kamer dia uit incubator en zorgvuldig pipet de bolvormige collageen-mengsel op de top van collageen basislaag. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 totdat collageen wordt gepolymeriseerd.
- Heeft gehele inhoud van de pipet niet afzien om te voorkomen dat het creëren van bubbels. Dropwise pipetteren vermindert de kans op verstoring van de collageen basislaag.
- Voeg langzaam minste 100 ul verwarmd kweekmedium gewenste chemoattractanten, remmers of andere behandelingen aan elk putje van de kamer schuif. Het collageen laag met bolletjes kan scheuren als vloeistof op het te heftig wordt gepipetteerd. Kweekmedium langzaam kan worden afgegeven aan de zijkant van een goed om te voorkomen dat het verstoren van de collageen.
- Incubeer kamer glijbaan bij 37 ° C en 5% CO 2 tot celinvasie mogelijk. Invasie in het omringende collageen kan worden waargenomen door helderveld of fluorescentiebeeldvorming en gekwantificeerd door een verscheidenheid van methoden waarbij epifluorescentie, confocale microscopie of lichtwaaier.
- Bedek de bodem van elk putje van een 8-well weefselkweek kamer dia met een minimum van 50 pi geneutraliseerde collageen.
3. Kwantificering van Invasion: Helderveld Microscopy
- Op gezette tijdstippen, het collageen-ingebedde bolletjes bij 10x vergroting met behulp van een helderveld microscoop (stap 2.2.8).
LET OP: Voorlangere termijn levende cellen experimenten, een verwarmde microscoop podium en CO 2 gereguleerde kamer kan worden gebruikt om sferoïden bij 37 ° C en 5% CO 2 tijdens beeldvorming handhaven. - Kwantificeren invasiviteit gebruik van software zoals ImageJ het aantal cellen invasie in de omringende collageen en de gemiddelde afstand binnengedrongen op elk tijdstip te meten.
4. Kwantificering van Invasion: fluorescentiemicroscopie met Live Cell Stain
- Na stap 2.2.8, vullen het medium in de kamer dia met een fluorescentiekleurstof zoals DAPI, calceïne AM, of andere cel bijhouden verbinding wenselijk de cellijn volgens de instructies van de fabrikant.
Opmerking: Voor kwantificering van invasiviteit, homogene kleuring gehele bolvormige niet essentieel. Voor toepassingen die diepere penetratie van de vlek, langere incubatie (> 3 uur) nodig zijn. - Verwijder de vlek en te vervangen door 500 ul warm 1x PBS. Incubate bij 37 ° C gedurende 10 minuten om de overmaat kleuring te verwijderen. Herhaal dit een minimum van twee keer.
- Met behulp van een fluorescentiemicroscoop, verwerven optische doorsneden door de binnenvallende sferoïden.
LET OP: Langdurige blootstelling aan laserlicht moet worden geminimaliseerd tijdens repetitieve beeldvorming om fototoxiciteit en fotobleken te beperken. - Gebruik software zoals ImageJ een Z-projectie, die kan worden gebruikt om de totale oppervlakte van de sferoïde kwantificeren genereren aantal binnendringende cellen en afstanden binnengedrongen in de collageenmatrix.
- Als voorbeeld, om de invasie te kwantificeren, pas het beeld drempel naar de achtergrond te sluiten, met de nadruk alleen de bolvormige en binnenvallende cellen, en hun gebied te meten. Het gebied van het origineel bolvormige kan worden afgetrokken van dit totaal aan invasiviteit kwantificeren.
5. Kwantificering van Invasion: Immunofluorescentie
LET OP: Alle oplossingen en buffers moeten worden doorgegeven door een 0,45 pm filter voor gebruik om remove vuil, die een negatieve kleuring kan beïnvloeden.
- Bereid PBS + wasbuffer. Bereid 1x PBS en voeg CaCl2 en MgCl2 tot een eindconcentratie van 0,1 mM. Do buffer Autoclaveer na CaCl2 en MgCl2 toegevoegd. Oplossing kan filter-gesteriliseerd en opgeslagen bij kamertemperatuur.
- Bereid neutraal gebufferde formaline (NBF) fixatie buffer. Voeg 5 druppels 1 M NaOH tot 0,6 g paraformaldehyde. Breng 20 ml met PBS + en incubeer bij 60 ° C totdat paraformaldehyde opgelost (ongeveer 1 uur). Afkoelen tot kamertemperatuur en breng de pH op 7,4 met 1 M HCl.
OPMERKING: NBF fixatie buffer moet worden voorbereid onmiddellijk voor gebruik. - Bereid runderserumalbumine (BSA) blokkerende buffer. Oplossen BSA in PBS + 3% w / v. Oplossing kan worden gesteriliseerd filter en gedurende enkele dagen bewaard bij 4 ° C maar wordt best vers bereid. Niet verwarmen.
- Bereid Permeabilisatie buffer. Verdun Triton X-100tot 0,2% v / v in PBS +.
LET OP: Permeabilisatie buffer dient onmiddellijk te worden voorbereid voor gebruik. - Optioneel bereiden MOWIOL montage medium. Combineer 2.4 g MOWIOL, 6 g glycerol en 6 ml ultrapuur H 2 O. Meng gedurende 3 h in een rotator bij kamertemperatuur. Voeg 12 ml 0,2 M Tris-Cl (pH 8,5). Incubeer onder menging bij 50 ° C gedurende 10 minuten.
- Centrifugeer bij 5000 xg gedurende 15 min om onoplosbaar materiaal te pelletiseren. Add anti-bleekmiddel, zoals 2,5% DABCO. Bewaren in 500 gl aliquots bij -20 ° C.
- Immunofluorescentiekleuring van sferoïden (figuur 5)
LET OP: Gebruik een pipet om langzaam toe te voegen of te verwijderen van vloeistoffen uit kamer dia. Vermijd het gebruik van een afzuiger, omdat dit de collageen laag kan verstoren.- Bereid sferoïden en verankeren in collageen gevulde kamer dia's, zoals beschreven in de punten 1-2.
OPMERKING: Collageen autofluorescentie kan worden geminimaliseerd door dunne lagen of kleine hoeveelheden collagen. - Verwijder zoveel kweekmedium mogelijk vanaf elke kamer dia.
- Kort spoelen collageen laag met 500 pi PBS + wasbuffer om resten van het medium te verwijderen.
- Voeg 500 ul vers PBS + wasbuffer aan elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten tot sferoïden wassen. Herhaal dit twee keer.
- Vervang PBS + wasbuffer met 500 pi NBF fixatie buffer. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 - 25 min.
- Verwijder NBF fixatie buffer en spoel met 500 pi PBS + wasbuffer. Wassen 5 minuten met verse PBS + wasbuffer minstens 3 keer.
OPMERKING: Vaste sferoïden kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C in PBS + verse wasbuffer gedurende enkele dagen. 0,01% natriumazide worden toegevoegd aan de wasbuffer microbiële groei tijdens opslag te remmen. - Vervang PBS + wasbuffer met 500 pi permeabilisatie buffer. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10-15 min.
- Optioneel verwijderen BSA blokkerende buffer. Gebruik scalpel of schaar, accijns sferoïden en het omliggende 3 mm x 3 mm gebied van de collageenlaag. Met behulp van een breed boring P1000 tip, los het uitgesneden blok van collageen door zachtjes te spoelen met verse BSA blokkerende buffer. Transfer collageen blok naar 1,5 ml buis.
- Centrifugeer bij 2000 xg gedurende 2 minuten en verwijder supernatant. De buis kan voorzichtig worden omgekeerd op schone papieren handdoek om weg lont overtollige vloeistof.
- Bereid sferoïden en verankeren in collageen gevulde kamer dia's, zoals beschreven in de punten 1-2.
- Voeg primair antilichaam tegen sferoïden en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Voeg voldoende hoeveelheid primair antilichaam zodanig dat de gehele collageenlaag gelijkmatig wordt ondergedompeld. De optionele bovenstaande stappen (5.6.8.1-5.6.8.2) gewoonlijk staan het gebruik van kleinere hoeveelheden antilichaam.
- Dompel kamer dia in een container met ten minste 10 ml PBS + wash buffer gedurende 10 minuten te wassen. Herhaal dit een minimum van twee keer.
- Facultatief bij sferoïden werden uit collageenlaag eerder (Stap 5.6.8.1), voeg minste 1 mL PBS + wasbuffer aan de 1,5 ml buis en voorzichtig schudden. Laat het geheel minimaal 10 minuten.
- Verwijder zoveel PBS + wasbuffer mogelijk en herhaald wassen met PBS + wasbuffer minste tweemaal. Centrifugeer bij 2000 xg gedurende enkele minuten aan collageen blokkeren pellet.
LET OP: Clean buitenkant van de kamer dia door bestrijken met 70% ethanol voor onder te dompelen in wasbuffer.
- Herhaal stap 5.6.9-5.6.10 met behulp van passende secundaire antilichaam.
NB: Als sferoïden direct werden gekleurd in de beeldvorming vat, ga dan naar stap 5.6.13. - Facultatief bij sferoïden werden uit collageenlaag eerder (Stap 5.6.8.1), schone objectglaasjes en confocale microscopie compatibel dekglaasjes met 70% ethanol.
- Verwijder zoveel wasbuffer mogelijk van het collageen blok en resuspendeer in ultrapuur H 2 O. Voer deze stap onmiddellijk voor de montage. Do-lood blokken niet laten weken in water.
- Met behulp van fijne getipt tang, pakt rand van collageen blok en transfer naar glasplaatje.
- Met behulp van de tang om het collageen in zijn plaats te houden, gebruik dan een schoon wattenstaafje om overtollige vloeistof lont uit het collageen blok, zorg ervoor dat niet aan het collageen direct raken.
LET OP: Als collageen wordt vast aan wattenstaafje kan voorzichtig worden verwijderd, hetzij met behulp van een tang, of door onderdompeling in water.
- Met behulp van reverse pipetteertechniek, afzien van 100 ul MOWIOL montage medium op de collageen blok en plaats dekglaasje over het monster.
- Gebruik een wattenstaafje of keukenpapier om overtollig MOWIOL montage medium en water lont uit van onder het dekglaasje.
- Laat MOWIOL montage medium om 's nachts te harden bij 4 °C. Seal randen van dekglaasje met nagellak.
- Afbeelding gekleurd bolletjes met behulp van confocale of fluorescentiemicroscopie om lokalisatie van eiwitten van belang, de vorming van invasieve structuren, enz. (Figuren 5B, 5C) observeren.
LET OP: Stained bolletjes moeten worden beschermd tegen licht om fotobleken te voorkomen.
6. anoikis Assay
OPMERKING: De sferoïde vorming protocol geeft ruimte aan verankering-onafhankelijke groei en anoikis weerstand kwantificeren in verschillende celtypen.
- Zaaien cellen voor anoikis assay (figuur 6)
- Volg de instructies voor de bolvormige productie in punt 1.4 maar gebruik een minimum van 30 mg / ml methylcellulose om sferoïde vorming medium te bereiden.
OPMERKING: Wanneer opgewarmd, moet 30 mg / ml methylcellulose een dikke gel die cellen in suspensie houdt produceren. - Incubeer cellen gedurende enkele dagen tot weken endenk, regelmatig bij 10x vergroting met behulp van een microscoop. Cellen die anoikis te weerstaan prolifereren en vormen kolonies.
- Kwantificeren anoikis door het meten van het aantal en de grootte van de kolonies gevormd in elk putje.
Opmerking: wanneer kolonies zijn gevormd, kunnen ze worden gewassen om de methylcellulose verwijderd en gebruikt voor sferoïde gebaseerde testen, zoals beschreven.
- Volg de instructies voor de bolvormige productie in punt 1.4 maar gebruik een minimum van 30 mg / ml methylcellulose om sferoïde vorming medium te bereiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We beschrijven een flexibele en efficiënte methode om discrete bolletjes met behulp van mobiele-afstotende platen en sferoïde vorming media waaraan MC genereren. Onder de geschikte omstandigheden MC en serum, individuele cellen regelen en klonteren in het midden van de put sferoïden met minimale hechting aan de putbodem vormen. Met dit protocol werden sferoïden gevormd uit verschillende cellijnen (figuur 2B). Titratie van MC serumconcentratie is vereist voor elke cellijn optimale omstandigheden waarbij slechts één sferoïde gevormd die robuust genoeg is om manipulatie toe te laten zonder fragmenteren identificeren. Optimaal, de sferoïden werden tussen 200 tot 500 urn in diameter, en bestond uit sterk gebonden cellen met minimale celafval. Sferoïden overleefd verpompen zonder schade, dat zij kunnen worden verzameld en gebruikt in een grote verscheidenheid aan assays.
(figuur 3A), wat resulteerde in aggregaten van dode cellen. In aanwezigheid van stof of andere verontreinigingen vezels, meervoudige of onregelmatig gevormde celgroepen die slechts zwak geaggregeerde werden gevormd en de resulterende bolletjes gemakkelijk brak uiteen bij hantering. Sferoïde vorming werd ook beïnvloed door suboptimale concentraties MC serum of in de bolvormige formatie medium (figuur 3B). In onze tests vele cellijnen konden zich aan cel-afstotende platen bij afwezigheid of bij lage concentraties, MC, en resulteerde in de vorming van een sferoïde omringd door een cellaag (Figuur 3B-ii). BxPC-3 celgroei in suboptimale MC omstandigheden als voorbeeld. In het algemeen hogere concentraties MC verhinderd cellen hechten aan de bron, maar een te hoge concentratie van MC verminderde adhesie van cellen, zodat de cellen vanafwikkeling op de bodem van de put, waardoor de vorming van losse aggregaten en talrijke satelliet sferoïden (figuur 3B-i). De concentratie van serum ook beïnvloed celoverleving en cel-cel en cel-adhesie en plastic moeten worden geoptimaliseerd voor verschillende cellijnen. Voor cellijnen zoals HCT-116 en PANC-1, te hoge serumconcentratie resulteerde in excessieve celproliferatie en productie van grote sferoïden die gemakkelijk beschadigd door het hanteren of gepromoot celadhesie aan het plastic goed en de vorming van een monolaag ( figuur 3B-iii). Interessant is dat de effecten onvoldoende serum verschilde cellijnen. HCT-116 celoverleving werd verminderd en kunnen de sferoïden gevormd zijn klein, met een grote hoeveelheid dode cellen in laag serum. Daarentegen PANC-1 cellen levensvatbaar in de afwezigheid van serum, maar werd meer hechtende, en vormde meerdere aggregaten en een monolaag (figuur 3B-iv, v).
Een modificatie van de beschreven sferoïde vorming protocol, waarin afzonderlijke cellen gesuspendeerd in hogere concentratie MC (30 mg / ml) kan worden gebruikt voor anoikis weerstand controleren. Bij deze MC concentraties, kan medium worden getransfereerd, pipet terwijl koel, maar verdikt tot een vaste gel bij 37 ° C. Anoikis-resistente cellen geresuspendeerd in dit medium bleef in suspensie en verspreid over een periode van 2-4 weken, vormen gesuspendeerd sferoïden van verschillende afmetingen (Figuur 6B). Ankerafhankelijke cellen niet sferoïden onder deze omstandigheden vormen. We konden anoikis weerstand gekwantificeerd door telling van het verdoofder van sferoïden gevormd in elk putje.
Figuur 1: Overzicht van 3D Sferoïde Formation Protocol. Gekweekt in monolaag cultuur gedissocieerd geteld, gepelletiseerd en opnieuw gesuspendeerd in bolvormige formatie medium aangevuld met methylcellulose (MC) en serum (i-iv). De suspensie wordt geënt in een U-bodemcel afstotende plaat op gewenste dichtheid vorming van sferoïden van de gewenste grootte (v) mogelijk maken, en de plaat wordt geïncubeerd tot één afzonderlijke cel sferoïde produceren elk putje (vi). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Geoptimaliseerde Sferoïde Formation Voorwaarden.(A) Sferoïde formatie onder optimale omstandigheden voor SH-SY5Y cellen. 1000 cellen gezaaid in U-bottom cell afstotend platen in medium aangevuld met 5% serum en 1 mg / ml MC samengevoegd in compacte sferoïden binnen 24 uur. (B) Representatieve beelden van sferoïden gevormd door verschillende cellijnen onder optimale omstandigheden weergegeven in tabel 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Sferoïde Vorming onder suboptimale omstandigheden. (A) sferoïden gevormd in de aanwezigheid van verontreinigingen. Microbiële besmetting resulteerde in celdood en losjes geaggregeerd bolletjes. In aanwezigheid van onoplosbare verontreinigingen, zoals stof of vezels cellen gehecht aan deze materialen en niet aggregaten. (B) de vorming Sferoïde in suboptimale bolvormige formatie medium. BxPC-3 cellen gezaaid in aanwezigheid van overmaat MC (10 mg / ml) gevormd talrijke satelliet sferoïden (i), terwijl onvoldoende MC (0 mg / ml) resulteerde in cel aggregaten die gehecht aan de putbodem en vormden een monolaag (ii ). Soortgelijke resultaten werden waargenomen voor andere geteste cellijnen (niet getoond). Overmaat serum (20%) resulteerde in een verhoogde HCT-116 cellen proliferatie en vorming monolaag (iii). Onvoldoende serum (0%) had cellijn-specifieke effecten, van celdood in HCT-116 (iv) de vorming van sferoïden satelliet in PANC-1 (v). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Invasion Assay gebruiken sferoïden. (A) Overview van sferoïde invasie assay. De afbeeldingsvat is vooraf bekleed met een laag geneutraliseerd collageen en geïncubeerd aan het collageen (i-ii) polymeriseren. Voorgevormde sferoïden worden verzameld in 1,5 ml buisjes en geresuspendeerd in geneutraliseerde collageen (iii-vi). De sferoïde-collageen mengsel wordt bedekt op de collageen basislaag en geïncubeerd aan het collageen (vii-viii) polymeriseren. Groeimedium bevattende gewenste verbindingen wordt vervolgens bedekt op de gepolymeriseerde sferoïdachtige collageenlaag en geïncubeerd om celinvasie (ix-x) toe. (B) In aanwezigheid van een chemoattractant worden cellen weergegeven invasie in het omgevende collageenmatrix uit een ingesloten PANC-1 sferoïde op de aangegeven tijdstippen. Elk paneel toont fase contrast beeld verkregen met behulp van een 10X objectief. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: immunofluorescentiekleuring van collageen-ingebedde sferoïden. (A) Overzicht van protocol voor immunofluorescentie kleuring van sferoïden. Embedded sferoïden worden gewassen, vaste (NBF), en geblokkeerde (BSA) direct in de beeldvorming vat. Sferoïden kunnen direct worden gekleurd of uitgesneden en gekleurd in een kleiner volume, zoals een 1,5 ml buis. Sferoïden moet worden gewassen met een overmaat buffer na elke vlek op de achtergrond fluorescentie te minimaliseren. Stained sferoïden kunnen direct worden afgebeeld in het vat of gemonteerd onder een dekglaasje voor de beeldvorming en opslag. (B) Immunofluorescentie beelden van een TPC-1 cel sferoïde ingebed in collageen en liet vallen voor 24 uur. (C) Afbeeldingen tonen phalloidin gekleurde cellen typisch voor de regio's die in B. Elk paneel toont een 20 urn Z-projectie (0,2 micrometer stappen) verkregen met behulp van een 60X doelstelling: Cellen binnen de bolvormige body ongeveer 20 urn vanaf het oppervlak (1), cellen uitsteekt in collageen (2), en cellen binnenvallende tot collageen (3). Schaalbalken = 25 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Sferoïde Formation anoikis Assay. (A) Overzicht van protocol voor anoikis test. Cellen worden bereid zoals beschreven in figuur 1, maar zijn geresuspendeerd in bolvormige vorming medium met ten minste 30 mg / ml MC waarin een dikke laag op individuele cellen in suspensie te houden en te voorkomen celaggregatie (i-ii) vormt. De celsuspensie wordt geënt in U-bottom cell afstotend platen en geïncubeerd (iii-iv). De gesuspendeerde cellen kan worden gecontroleerd op de vorming van bolvormige door proliferatie, wat aangeeft anoikis weerstand. (
| cellijn | MC (mg / ml) | Serum (%) | Geschatte incubatie tijd |
| SH-SY5Y | 1 | 5 | 24 uur |
| BxPC-3 | 5 | 5 | 3-5 dagen |
| PANC-1 | 5 | 5 | 5-7 dagen |
| HCT-116 | 3 | 10 | 2-4 dagen |
| TT | 1 | 10 | 7 tot 10 dagen |
| TPC-1 | 3 | 5 | 1-2 dagen |
Tabel 1: Optimale Sferoïde Vorming Medium Samenstelling en incubatietijden voor gevalideerde cellijnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We presenteren een snelle en flexibele werkwijze voor het vervaardigen van 3D cel sferoïden de architectuur van weefsels in vivo met behulp van goedkope en algemeen verkrijgbare reagentia modelleren. Ons protocol maakt gebruik van de niet-cytotoxische en adhesie-bevorderende eigenschappen van MC 8, 9 naar cel aggregatie bemiddelen en cel monolaag de vorming van een minimum te beperken. Unlike eiwit gebaseerde matrices geïsoleerd uit dierlijke bronnen, MC inert, bevat geen groeifactoren en wordt gemakkelijk verwijderd door wassen, waardoor isolatie van sferoïden voor gebruik in diverse toepassingen zonder de aanwezigheid van residuele matrix. Ons protocol maakt gebruik van een snelle aggregatie van consistente cel aantallen te homogeen en kleinbedrijf bolletjes te genereren, waardoor directe vergelijkingen van de sferoïden geteeld onder verschillende experimentele omstandigheden. Deze methode kan worden aangepast voor gemengde kweken model in vivo tumorgroei door het combineren van vaste nummers van meerdere tumorgeassocieerde celtypen (bijvoorbeeld fibroblasten, leukocyten, stromale cellen) om meer nauwkeurig de tumoromgeving.
Modificaties van ons protocol gebruiken cellen gezaaid in hoge concentraties MC kan worden om verankering-onafhankelijke groei van cellen kunnen prolifereren in suspensie te volgen, en kunnen worden toegepast als anoikis assay (Deel 6) te identificeren of te kwantificeren celtransformatie. Sferoïden gegenereerd door ons protocol zijn ideaal voor toepassingen zoals drug discovery, waardoor vergelijking van de celgroei, het metabolisme, de overleving en invasiviteit tussen de behandeling. Geïsoleerd sferoïden ook worden ingebed in een extracellulaire matrix, zoals collageen, te evalueren en te kwantificeren cel invasiviteit in een 3D-micro (punt 2.2, figuur 4) die nauwkeuriger modellen in vivo tumorgroei. Verder kan ons protocol worden gebruikt om grote hoeveelheden van de sferoïden MC matrix isoleren eiwit of RNA preparaat, waardoor users naar cel signaal of genexpressie veranderingen evalueren reactie op behandeling of kweekomstandigheden.
Onze sferoïde vorming protocol vereist optimalisering van serum en MC-concentraties, en het aantal cellen uitgezet per cellijn. Cellijn specifieke kenmerken, zoals levensvatbaarheid van de cellen, cel-cel en cel-plastic kleverigheid, kan een aanzienlijke invloed op het gemak waarmee sferoïden worden gevormd. In het algemeen, cellijnen met een slechte levensvatbaarheid in monolaag cultuur vereist hogere serum concentraties sferoïde vorming te bevorderen, terwijl hogere MC concentraties werden de voorkeur voor sterk hechtende cellijnen. Wij raden u daarom aan titraties van serum en MC worden uitgevoerd om de optimale condities voor de overleving van de cel (serum concentratie) te bepalen, terwijl het minimaliseren van monolaag en de vorming van een satelliet sferoïde (MC concentratie). Deze voorwaarden moeten leiden tot vorming van een enkele discrete spheroïde per well zonder satellieten. Optimale grootte spheroïde vooranalyse applicatie-afhankelijk en wordt beïnvloed door het aantal cellen uitgezet en serumconcentratie (stap 1.4.7). Zaaien minder cellen geeft kleinere aggregaten die gemakkelijker homogeen gekleurd, maar kunnen niet voortplanten in vivo cel-cel en cel-micromilieu interacties. Verhoging van het aantal cellen uitgezet ontstaat een grotere sferoïden, die een fysiologisch representatieve hypoxische kern 10 die cel gedrag kan beïnvloeden en veranderen interpretaties van de groei of overleving assays bevatten. Wanneer echter te groot, sferoïden fragiel en kunnen gemakkelijk breken uit elkaar of beschadigd tijdens isolatie. Grotere sferoïden zijn ook veel moeilijker te visualiseren zonder gespecialiseerde imaging platforms voor optische sectie (bv licht vel fluorescentiemicroscoop) of door het inbedden of cryosectioning en kleuring van doorsneden door de bolvormige 11. Wij raden een doelwit spheroïde grootte van 200-500 urn voor flexibiliteit engebruiksgemak voor de meeste toepassingen. Algemeen, is het essentieel om de voorwaarden voor sferoïde vorming optimaliseren voor zowel een cellijn-specifieke en applicatie-specifieke wijze.
Sferoïde productie protocollen vereisen bijzondere aandacht voor besmetting van sferoïden door stof en andere deeltjes te voorkomen. Cellen hechten stof en andere onoplosbare verontreinigingen, resulteert in een onregelmatige vorm, losjes hechtende cel aggregaten ongeschikt voor analyse (figuur 3A). Bronnen van verontreiniging worden geminimaliseerd door het passeren alle oplossingen door een 0,45 urn filter spoelen van de cel monolaag met gefilterd medium voordat dissociatie (stap 1.4.1), en spoelen multichannel pipet reservoirs met gefilterd ultrazuiver water onmiddellijk voor gebruik (Stap 1.4.6.1). Verder katoen gefiltreerd serologische pipetten, welke vezels afwerpen in oplossingen, moet worden vermeden. Hoewel niet kritisch, kan stof verder worden verminderd door het passeren dissociated cellen door een 100 um zeef cel voorafgaand aan het zaaien (stap 1.4.6). Verdampingsverlies van medium een aanvullende technische overweging, in het bijzonder voor incubatietijden dan 1 week, zoals vereist door sommige cellijnen sferoïde vorming (Tabel 1) of bij anoikis assays (hoofdstuk 6). Verdamping kunnen worden geminimaliseerd door enten van cellen in putjes in het middengebied van multiwell-platen, vullen omtrek putjes met ultrazuiver water en losjes afdichten van de randen van de plaat of omsluiten de plaat in een bevochtigde kamer.
3D cel sferoïden zijn een waardevol model voor de studie van zowel normale als tumorcellen gedrag en fysiologie. Ons protocol is een snelle en economische methode voor het genereren van gelijkvormige 3D cel sferoïden die kunnen worden gebruikt in een verscheidenheid aan assays en toepassingen. Deze sferoïden een waardevolle karakterisatie van tumorgroei en micro-interacties alsook modellen preClinical evaluatie van nieuwe therapieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffers | |||
| 10x Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| Calcium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 21114 | Used for PBS+ wash buffer; Do not autoclave PBS+ wash buffer upon addition of calcium chloride |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | M1028 | Used for PBS+ wash buffer; Do not autoclave PBS+ wash buffer upon addition of magnesium chloride |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Spheroid Formation | |||
| 96-well U-bottom Cell-Repellent Plate | Greiner Bio-One | 650970 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | D5546 | For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines |
| F12K Medium | Thermo Fisher Scientific | 2112722 | For culturing TT cell line |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | Filter prior to use to remove particulate contaminants |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M7027 | Prepare in water to 100 mg/mL |
| Roswell Park Memorial Institute Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | Dissociation buffer |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Invasion Assay | |||
| Bovine Type I Collagen | Corning Incorporated | 354231 | Stock 3.1 mg/mL; Maintain on ice when in use |
| DMEM Phenol Red Free Low Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11054-20 | Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium |
| Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-10 | Chemoattractant |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Immunofluorescence Microscopy | |||
| #1.5 Coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72225-01 | For mounting excised spheroids |
| Alexa-Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | Used to stain actin at 1:200 |
| Bovine Serum Albumin | Bioshop Canada Incorporated | ALB001 | Used in BSA blocking buffer |
| Dabco 33-LV | Sigma-Aldrich | 290734 | Antifade |
| Glycerol | Bioshop Canada Incorporated | GLY001 | Used in MOWIOL mounting medium |
| ImageJ Software | Freeware, NIH | - | Used for image analysis |
| Microslides | VWR International | 48312-024 | For mounting excised spheroids |
| MOWIOL 4-88 | EMD-Millipore | 475904 | Used in MOWIOL mounting medium |
| Paraformaldehyde | EMD-Millipore | PX0055-3 | Used in fixation buffer |
| Triton X-100 | Bioshop Canada Incorporated | TRX777 | Used in permeabilization buffer |
References
- Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. A. Two-dimensional vs. three-dimensional in vitro tumor migration and invasion assays. Methods Mol Biol. 986 (986), 227-252 (2013).
- Albini, A., Noonan, D. M. The 'chemoinvasion' assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).
- Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture. Methods Mol Biol. 695, 17-39 (2011).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. (51), (2011).
- Handschel, J. G., et al. Prospects of micromass culture technology in tissue engineering. Head Face Med. 3, 4 (2007).
- Stuckhoff, A. P., DelValle, L. Neuronal Cell Culture Methods and Protocols Vol. 1078 Methods in Molecular Biology. Amini, S., White, M. K. 1078, Humana Press. 119-132 (2013).
- Stewart, G. J., Wang, Y., Niewiarowski, S. Methylcellulose protects the ability of anchorage-dependent cells to adhere following isolation and holding in suspension. Biotechniques. 19 (4), 598-604 (1995).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biol. 10, 29 (2012).
- Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional. Anal. Biochem. 437 (1), 17-19 (2013).
