Abstract
Monolager cellodling inte tillräckligt modellera beteendet in vivo av vävnader, vilket inbegriper komplicerade cell-cell och cell-matrix-interaktioner. Tredimensionella (3D) cellodlingstekniker är en ny innovation utvecklats för att åtgärda bristerna i vidhäftande cellkultur. Medan flera tekniker för att generera vävnads analoger in vitro har utvecklats, dessa metoder är ofta komplexa, dyra att upprätta, kräver specialiserad utrustning och är i allmänhet begränsade av kompatibilitet med endast vissa celltyper. Här beskriver vi en snabb och flexibel protokoll för aggregering celler i flercelliga 3D sfäroider konsekvent storlek som är kompatibel med en tillväxt på en mängd olika tumör och normala cellinjer. Vi utnyttjar varierande koncentrationer av serum och metylcellulosa (MC) för att främja förankringsoberoende sfäroid generering och förhindra bildandet av cellmonoskikt på ett mycket reproducerbart sätt. Optimala förhållanden för individual cellinjer kan åstadkommas genom att justera MC eller serumkoncentrationerna i sfäroid formation mediet. 3D sfäroider som genereras kan samlas upp för användning i ett brett spektrum av tillämpningar, inklusive cellsignalering eller genuttryck studier, läkemedelskandidaten screening, eller i studier av cellulära processer såsom tumörcellinvasion och migration. Protokollet är också lätt anpassas för att generera klonala sfäroider från enstaka celler, och kan anpassas för att bedöma förankringsoberoende tillväxt och anoikis resistens. Sammantaget ger våra protokoll en lätt modifierbar metod för generering och användning av 3D-cell sfäroider för att rekapitulera 3D mikromiljö av vävnader och modellera tillväxten av normala celler och tumörceller in vivo.
Introduction
Biologiskt relevant bedömning av tumörcellbeteende utmanar med traditionella tvådimensionella (2D) cellodlingsmetoder, delvis på grund av dessa inte korrekt speglar cellmikro påträffats in vivo. Alternativa metoder som innehåller extracellulära matrixkomponenter i kulturen (t.ex. Boyden kammaranalyser) är mer fysiologiskt representativ för in vivo vävnadsmiljö. Däremot kan de begränsas till bedömning av enskilda cellbeteende, och inte rekapitulera komplexet in vivo kombinationer av cell-matrix och cell-cell-interaktioner som bidrar till vävnad eller tumörtillväxt 1, 2, 3.
Användningen av flercelliga sfäroider är en ny metod som mer exakt återger den kompakta arkitektur in vivo celltillväxt 14. Sfäroider kan användas för att undersöka cell-matris interaktioner av normala celler, men kan också fungera som tumör analoger för att modellera egenskaper hos tumörprogression, såsom metastatisk tillväxt eller läkemedelsresistens 4.
Sfäroider kan bildas genom proliferationen av enskilda celler inbäddade i en matris 5, eller snabbare, för att genom att främja aggregering av flera celler bildar en enda cellkluster (t.ex., hängande droppe, centrifugeringsmetoder) 6, 7. Befintliga cell aggregering tekniker kan kräva kostsamma material eller specialutrustning. Dessutom är dessa sfäroider har ett brett utbud av storlekar och morfologier och kan vara svåra att producera i stora mängder, vilket gör jämförelser mellan tillväxtbetingelser eller behandlingar svåra. Slutligen kan sfäroider som genereras av dessa metoder vara svåra att isolera från det proteinhaltiga extracellular matris i vilken de är inbäddade för användning i andra tillämpningar.
Här beskriver vi en robust och lätt modifierbar cellaggregation metodik för snabb bildning av genomgående dimensionerade cell sfäroider användning av kommersiellt tillgängliga U-bottnade cellavvisande plattor och ett inert vidhäftningsbefrämjande matris, metylcellulosa. När den väl bildats, är dessa flercelliga sfäroider lätt isoleras för användning i ett brett spektrum av tillämpningar. Protokollet är också enkelt anpassas för att generera sfäroider genom cellproliferation, vilket kan användas för att utvärdera andra cellprocesser. Här visar vi cellinvasionsanalyser, kvantifierade genom immunofluorescens färgning, och en anoikis analys, som exempelvis tillämpningar av dessa två olika sfäroid formation protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla reagens och förbrukningsartiklar listas i materiallistan.
1. Sfäroid Produktionen av Cell Aggregation
- Metylcellulosalösning: Bered 100 ml av 100 mg / ml metylcellulosa.
- Värme 50 ml ultrarent H2O till 80 ° C. Tillsätt 10 g metylcellulosa pulver och skaka tills partiklarna är jämnt dispergerad.
- Föra till slutlig volym med kall ultrarent H2O och rör om vid 4 ° C tills lösningen blir klar, halmfärgad, och innehåller inga synliga fasta substanser.
- Passera genom ett 0,45 | im filter för avlägsnande av oupplösta fasta ämnen. Beredda lösningen kan alikvoter och lagrades vid 4 ° C i upp till 12 månader.
OBS: Metylcellulosa tjänar som ett icke-cytotoxiskt, inert, suspensionsmedel för att förbättra cell-cell-adhesion och motverka bildandet av en vidhäftande cellmonoskiktet. Metylcellulosa är vattenlösligt och kan tvättas bort efter spheroid generation.
- Sfäroid formation mediet
OBS: Förbered sfäroid formation medium omedelbart före användning. Lagrar inte.- Späd metylcellulosalösning till 1-5 mg / ml i lämpligt odlingsmedium.
- Passera genom ett 0,22 pm filter för att sterilisera och avlägsna oupplösta fasta ämnen.
- Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (PBS)
- Späd till 1x och passera genom en 0,45 um filter före användning. Beredda lösningen kan förvaras under obegränsad tid vid rumstemperatur.
- Cell sfäroid (figur 1)
OBS: Förbered alla reagenser i förväg. Det är viktigt att undvika kontaminering av lösningar av damm, fibrer eller andra olösliga partiklar. Närvaron av dessa föroreningar kommer att påverka sfäroid formation. Odlingsmedium och andra lösningar bör ledas genom ett 0,45 m filter för att avlägsna dessa partiklar när posligt. Undvik att använda bomulls filtrerade pipetter vid överföring av lösningar eftersom dessa kan införa ytterligare fibrer.- Kultur cellmonoskikt till 70% sammanflytning i lämpligt odlingsmedium kompletterat med 10% serum. Aspirera odlingsmedium och skölj med 1x PBS för att ta bort skräp. Tillsätt 3 ml trypsin-EDTA (0,05% trypsin) dissociation buffert till en 10 cm cellodlingsskål, och inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO2.
- Inspektera celler under mikroskop vid 10X förstoring för att bekräfta lossnar. Neutralisera dissociationsbuffert med 7 ml serum kompletterat odlingsmedium.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 500 xg under 10 min till försiktigt Pellets celler.
- Avlägsna supernatanten. Resuspendera cellpelleten i 1 ml sfäroid formation medium med användning av en P1000 pipett med en filterspets.
OBS: Cellsuspensionen bör vara fri från klumpar.- Att finfördela cellpelleten trycker pipettspetsen mot botten av röret vid en liten vinkel medanpipettering för skjuvning cellpelleten. Undvika finfördelning mer än 3 - 5 gånger eftersom detta kan skada cellerna. Pipett långsamt och inte utvisa hela innehållet i pipettspetsen att undvika att skapa bubblor.
- Räkna celler med användning av en hemocytometer och utspädd cellsuspension till 1 x 10 4 celler / ml.
OBS: Cellantalet kan optimeras för att generera sfärer av varierande storlek. Trypan blue-färgning av skadade celler kan användas för att bekräfta livsdugligheten av återsuspenderade celler. - Överföringscellsuspension till en steril, dammfri multikanalpipett reservoar och använda filterspetsar för att dispensera 100 mikroliter i varje brunn på en 96-brunnars U-bottnad cellavvisande platta.
- Skölj behållare med filtrerat ultrarent H2O för att avlägsna damm och fibrer.
- Blanda cellsuspensionen period medan ympning för att förhindra celler från att landa på botten av reservoaren. För att undvika att skapa bubblor, använda en omvänd pipetteringsteknik under blandning och dispensing.
- Överförings plattor till vävnadsodlingsinkubator (37 ° C och 5% CO2) och inspektera dagligen för sfäroid bildning. Celler bör sjunka till botten av varje brunn i 6 timmar och i allmänhet aggregera i en sfäroid inom 24-48 timmar (Figur 2).
- För bekräftelse av framgångsrika sfäroid bildning, använda en p10 spets och försiktigt pipettera medel över sfäroid med iakttagande under ett mikroskop med 10x förstoring. Korrekt bildade sfäroider kommer att lossna från plattan och rulla, bekräftar deras 3D-struktur.
OBS: metylcellulosa och serumkoncentrationer bör bestämmas genom titrering för varje cellinje för att ge bildning av en enda sfäroid per brunn. Betingelser optimerade på detta sätt för utvalda cellinjer visas i tabell 1, och exempel på sfäroiderna bildade i figur 2B. Sfäroider kan odlas för längre än angivet men när de blir större de växer progressivt svårareatt hantera utan fragmentering. Om celler bildar ett monolager, satellit sfäroider, eller misslyckas med att sjunka till botten av brunnen, kan koncentrationen av metylcellulosa och serum behöva justeras ytterligare för optimal sfäroid bildning (Figur 3B). Använd inte sfäroider som innehåller föroreningar såsom fibrer eller damm (Figur 3A). Förformade sfäroider kan behandlas med föreningar av intresse, såsom tillväxtfaktorer, levande cellfläckar, eller inhibitorer för analys.
2. Sfäroid Invasion analys (Figur 4)
- neutraliserade kollagen
- Kyla alla vätskor till 4 ° C och håll på is när man arbetar med kollagen för att förhindra oönskad polymerisation.
- Förbered färsk 0,1 M och 0,01 M lösningar av NaOH och färsk 0,1 M HCl i ultrarent H2O Pass alla lösningar genom 0,22 um filter.
- Blanda bovint typ 1 kollagen (3,1 mg / ml stock), 0,01 M NaOH och 10 x PBS (8: 1: 1 volymförhållande) och justera till pH 7,4 med användning av kall 0,1 M NaOH och HCl. Den slutliga koncentrationen av kollagen är 2,5 mg / ml.
- Förbered tillräckligt neutraliserade kollagen för att fylla bildkärlet till ett djup av 2-3 mm. krävs minst 100 mikroliter för varje brunn i åtta brunnar vävnadsodlingskammare slide listas i materiallistan.
- Bädda spheroids i kollagen (Figur 4)
- Täck botten av varje brunn i en 8-brunnars vävnadsodlingskammare bild med ett minimum av 50 mikroliter neutraliserade kollagen.
- Använd omvänd pipetteringsteknik för att undvika att skapa bubblor i kollagen. Använda pipettspetsen för att sprida kollagen jämnt över brunnens yta.
OBS: Denna kollagen baslager håller spheroids i suspension och är typiskt 1-2 mm tjock. Basskiktet minimerar bildningen av en menisk på det övre kollagenskiktet. Om basskiktet är för tunn, kan sfäroider gör kontakt med botten av kammaren sliden ochbildning av en cellmonolager.
- Använd omvänd pipetteringsteknik för att undvika att skapa bubblor i kollagen. Använda pipettspetsen för att sprida kollagen jämnt över brunnens yta.
- Placera kammaren sliden, och en 35 mm vävnadsodlingsskål fylld med ultrarent H2O, i ett 10 cm vävnadsodlingsskål. Inkubera vid 37 ° C tills kollagen polymeriseras, typiskt 1 h. Store återstående neutraliserade kollagen på is.
OBS: Den vattenfyllda 35 mm skål kommer att ge fukt och förhindra torkning. Kammaren slide bör förbli i denna fuktkammare under analysen. Kollagen basskiktet kan lämnas att polymerisera över natten. Längre inkubationer resulterar vanligtvis i en styvare gel. - Med användning av en p1,000 filtermunstycke, samla förformade sfäroider (steg 1.4.7) från 96-brunnars U-bottnad cellavvisande plattan i 1,5 ml snap topp rör. Pipett långsamt och undvika upprepad eller kraftig pipettering för att minimera vätske klippning av sfäroider. Flera sfäroiderna kan slås samman i ett enda rör för överföring till en brunn på 8 brunnar vävnadsodlingskammare slide.
- Centrifugera de uppsamlade sfäroider i en tablETOP mikro vid 2000 xg i 2-5 s och avlägsna supernatanten med hjälp av en p200 pipett. Undvika centrifugering längre än vad som krävs, eftersom detta kan orsaka sfäroiderna att bryta sönder eller klumpar ihop sig.
OBS: Efter pipettering av större delen av supernatanten röret kan inverteras försiktigt över en ren pappershandduk för att transportera bort överskottsvätska. Låt inte sfäroider torka. - Med hjälp av en bred borrning P200 spets, försiktigt suspendera spheroids i 50 mikroliter neutraliserade kollagen. Gör detta för varje rör av insamlade sfäroider innan några sfäroider överförs in i kammaren sliden. Håll sfäroider som har lösts upp i neutraliserade kollagen på is tills redo för överföring till kammarglas.
- Ta kammare glida ur inkubatorn och försiktigt pipett sfäroid-kollagenblandningen ovanpå kollagen baslagret. Inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 tills kollagen polymeriseras.
- Inte fördela hela innehållet i pipetten för att undvika att skapa bubblor. Dropwise pipettering minskar risken för att störa den kollagen basskiktet.
- Tillsätt långsamt ett minimum av 100 mikroliter värmde odlingsmedium innehållande önskade kemoattraherande ämnen, inhibitorer, eller andra behandlingar till varje brunn i kammarobjektglas. De kollagenskiktet innehåller sfäroider kan riva om vätska pipetteras på den alltför kraftigt. Odlingsmedium kan sakta dispens längs sidan av en brunn för att undvika att störa kollagen.
- Inkubera kammarobjektglas vid 37 ° C och 5% CO2 för att medge cellinvasion. Cellinvasion in i den omgivande kollagen kan observeras genom bright eller fluorescens avbildning och kvantifierades genom en mängd olika metoder som använder epifluorescence, konfokal eller ljus ark mikroskopi.
- Täck botten av varje brunn i en 8-brunnars vävnadsodlingskammare bild med ett minimum av 50 mikroliter neutraliserade kollagen.
3. Kvantifiering av Invasion: Brightmicroscopy
- Vid bestämda tidsintervall, bildkollagen inbäddade sfäroider vid 10X förstoring med hjälp av en ljusfältsmikroskop (steg 2.2.8).
OBS!långsiktiga levande cellförsök, en uppvärmd mikroskop scenen och CO2 regleras kammare kan användas för att upprätthålla sfäroider vid 37 ° C och 5% CO 2 under avbildning. - Kvantifiera invasivitet med användning av programvara såsom ImageJ för att mäta antalet celler som invaderar in i den omgivande kollagen och det genomsnittliga avståndet invaderade vid varje tidpunkt.
4. Kvantifiering av Invasion: fluorescensmikroskopi med levande celler Stain
- Efter steg 2.2.8, komplettera mediet i de kammare diabilder med en fluorescerande fläck, såsom DAPI, kalcein AM, eller annat cellspårningsförening lämpligt att cellinjen enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: För kvantifiering invasivt, är inte nödvändigt homogen färgning hela sfäroid. För applikationer som kräver djupare penetration av fläcken, längre inkubationer (> 3 h) kan vara nödvändig. - Ta bort fläcken och ersätta med 500 mikroliter varmt 1x PBS. Icubate vid 37 ° C under 10 min för att avlägsna överflödig färg. Upprepa minst två gånger.
- Med hjälp av ett fluorescensmikroskop, förvärva optiska sektioner genom de invaderande sfäroider.
OBS: Långvarig exponering för laserljus skall minimeras under repetitiva avbildning att begränsa fototoxicitet och fotoblekning. - Använd program som ImageJ för att generera en Z-projektion, som kan användas för att kvantifiera den totala arealen av den sfäroid, antal invaderande celler, och avstånd invaderade i kollagenmatrisen.
- Som ett exempel, för att kvantifiera invasion, justera tröskeln på bilden för att utesluta bakgrund, belyser bara sfäroid och invaderande celler, och mäta deras område. Området av den ursprungliga sfäroid kan subtraheras från denna summa att kvantifiera invasivt.
5. Kvantifiering av Invasion: Immunofluorescens
NOTERA: Alla lösningar och buffertar bör ledas genom en 0,45 ^ m filter före användning för att remove skräp, som negativt kan påverka färgning.
- Förbered PBS + tvättbuffert. Förbereda 1x PBS och tillsätt CaCl2 och MgCl2 till en slutkoncentration av 0,1 mM. Autoklavera inte bufferten efter CaCl2 och MgCl2 tillsätts. Lösningen kan vara filtersteriliserad och lagrades vid rumstemperatur.
- Förbered neutral buffrad formalin (NBF) fixering buffert. Tillsätt 5 droppar 1 M NaOH till 0,6 g paraformaldehyd. Sätta till 20 ml med PBS + och inkubera vid 60 ° C tills paraformaldehyd är upplöst (ca 1 h). Svalna till rumstemperatur och justera pH till 7,4 med 1 M HCl.
OBS: NBF fixering buffert bör beredas omedelbart före användning. - Förbereda bovint serumalbumin (BSA) blockeringsbuffert. Upplösa BSA i PBS + vid 3% vikt / volym. Lösningen kan filtersteriliseras och lagrades vid 4 ° C under flera dagar men är bäst förberedda färsk. Värm inte.
- Förbereda Permeabilization buffert. Späd Triton X-100till 0,2% vol / vol i PBS +.
OBS: Permeabilization bufferten bör beredas omedelbart före användning. - Eventuellt förbereda MOWIOL monteringsmedium. Kombinera 2,4 g MOWIOL, 6 g glycerol och 6 ml ultrarent H2O Mix i 3 h i en rotator vid rumstemperatur. Lägga 12 ml 0,2 M Tris-Cl (pH 8,5). Inkubera under blandning vid 50 ° C under 10 min.
- Centrifugera vid 5000 xg under 15 min för att pelletera olösligt material. Lägg till anti-blekmedel, såsom 2,5% DABCO. Butik i 500 mikroliter alikvoter vid -20 ° C.
- Immunofluorescens färgning av sfäroider (Figur 5)
OBS: Använd en pipett för att sakta lägga till eller ta bort vätska från kammaren slide. Undvik att använda en suganordning, eftersom det kan störa kollagenskiktet.- Förbered sfäroider och bädda in i kollagenfyllda kammarobjektglas, som beskrivs i avsnitt 1 till 2.
OBS: Collagen autofluorescens kan minimeras genom användning av tunna skikt eller små volymer av collagen. - Ta bort så mycket odlingsmedium som möjligt från varje kammare objektglas.
- Skölj hastigt kollagenskiktet med 500 mikroliter PBS + tvättbuffert för att avlägsna kvarvarande medium.
- Tillsätt 500 mikroliter färska PBS + tvättbuffert i varje brunn och inkubera vid 37 ° C under 5 minuter för att tvätta sfäroider. Upprepa två gånger.
- Byt PBS + tvättbuffert med 500 mikroliter NBF fixering buffert. Inkubera vid rumstemperatur under 20-25 minuter.
- Ta NBF fixering buffert och skölj med 500 mikroliter PBS + tvättbuffert. Tvätta i 5 minuter med färsk PBS + tvättbuffert minst 3 gånger.
OBS: Fast sfäroider kan lagras vid 4 ° C i färsk PBS + tvättbuffert i flera dagar. 0,01% natriumazid kan tillsättas till tvättbuffert för att inhibera mikrobiell tillväxt under lagring. - Byt PBS + tvättbuffert med 500 mikroliter permeabilization buffert. Inkubera vid rumstemperatur under 10-15 min.
- Eventuellt bort BSA blockerande buffert. Med hjälp av skalpell eller sax, punkt sfäroider och den omgivande 3 mm x 3 mm område från kollagenskiktet. Med hjälp av en bred borrning P1000 spets, rubba den utskurna block av kollagen genom att skölja försiktigt med färsk BSA blockerande buffert. Överför kollagen block till 1,5 ml rör.
- Centrifugera vid 2000 x g under 2 min och avlägsna supernatanten. Röret kan noggrant inverteras över ren pappershandduk för att transportera bort överskottsvätska.
- Förbered sfäroider och bädda in i kollagenfyllda kammarobjektglas, som beskrivs i avsnitt 1 till 2.
- Lägg primära antikroppen till sfäroider och inkubera vid rumstemperatur i 1 h. Tillsätt tillräcklig volym av primär antikropp så att hela kollagenskiktet är jämnt nedsänkt. De valfria stegen ovan (5.6.8.1-5.6.8.2) tillåter vanligtvis användning av mindre volymer av antikropp.
- Sänk kammar glida i en behållare med åtminstone 10 ml PBS + tvätt buffer under 10 min för att tvätta. Upprepa minst två gånger.
- Frivilligt, om sfäroider skars ut från kollagenskiktet tidigare (steg 5.6.8.1), lägga till minst 1 mL PBS + tvättbuffert till 1,5 ml rör och försiktigt skaka. Tillåt i blöt i minst 10 min.
- Ta bort så mycket PBS + tvättbuffert som möjligt och upprepa tvättning med PBS + tvättbuffert minst två gånger. Centrifugera vid 2000 xg under flera minuter för att pellekollagenblock.
OBS: Rengör utsidan av kammar glida genom att torka med 70% etanol innan nedsänkning i tvättbuffert.
- Upprepa steg 5.6.9-5.6.10 användning av lämplig sekundär antikropp.
OBS: Om sfäroider färgades direkt i bildkärlet, gå vidare till steg 5.6.13. - Frivilligt, om sfäroider skars ut från kollagenlager tidigare (Steg 5.6.8.1), rena glasskivor och konfokalmikroskopi-kompatibel täckglas med 70% etanol.
- Ta bort så mycket tvättbuffert som möjligt från kollagenblocket och återsuspendera i ultrarent H2O Utför detta steg omedelbart före montering. Lämna inte färgade block blötläggning i vatten.
- Använda fin spets pincett, ta tag kanten av kollagen block och överföring till glasskiva.
- Med hjälp av pincett för att hålla kollagen på plats, använd en ren bomullspinne för att transportera överskottsvätska från kollagenblocket, se till att inte röra vid kollagen direkt.
OBS: Om kollagen fastnar till bomullspinne det kan lätt avlägsnas antingen med hjälp av pincett, eller genom att sänka i vatten.
- Använda omvänd pipetteringsteknik, fördela 100 mikroliter MOWIOL monteringsmedium på kollagen blocket och plats täck över provet.
- Använd en bomullspinne eller pappershandduk för att transportera överskotts MOWIOL monteringsmedium och vatten ut från under täck.
- Tillåt MOWIOL monteringsmedium att härda över natten vid 4 °C. Seal kanter täck med nagellack.
- Bild färgade sfäroider använder konfokala eller fluorescensmikroskopi att observera lokalisering av proteiner av intresse, bildandet av invasiva strukturer, etc. (figurerna 5B, 5C).
OBS: Stained sfäroider bör skyddas från ljus för att förhindra fotoblekning.
6. anoikis Assay
OBS: sfäroid formation protokollet är lätt anpassas för att kvantifiera förankringsoberoende tillväxt och anoikis beständighet i en mängd olika celltyper.
- Sådd celler för anoikis analys (figur 6)
- Följ instruktionerna för sfäroid produktion i avsnitt 1.4 men använd minst 30 mg / ml metylcellulosa att förbereda sfäroid formation medium.
NOTERA: När värmas, bör 30 mg / ml metylcellulosa producera en tjock gel som håller cellerna i suspension. - Inkubera celler för flera dagar till veckor och ispect regelbundet vid 10X förstoring med ett mikroskop. Celler som motstår anoikis ska föröka sig och bilda kolonier.
- Kvantifiera anoikis genom mätning av antalet och storleken av bildade kolonier i varje brunn.
NOTERA: När kolonier bildas, kan de tvättas för avlägsnande av metylcellulosa och används för sfäroida baserade analyser, såsom beskrivits.
- Följ instruktionerna för sfäroid produktion i avsnitt 1.4 men använd minst 30 mg / ml metylcellulosa att förbereda sfäroid formation medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi beskriver en flexibel och effektiv metod för att generera diskreta sfäroider med användning av cellavvisande plattor och sfäroida formations media kompletterade med MC. Under lämpliga betingelser av MC och serum, individuella celler sedimentera och vidhäftning i centrum av brunnen för att bilda sfäroider med minimal vidhäftning till brunnens botten. Användning av detta protokoll, var sfäroider genereras från en mängd olika cellinjer (Figur 2B). Titrering av MC och serumkoncentrationer krävs för varje cellinje för att identifiera optimala förhållanden där endast ett enda sfäroid bildas som är tillräckligt robust för att tillåta manipulation utan fragmentering. Optimalt sfäroiderna var mellan 200 till 500 | im i diameter, och bestod av tätt vidhäftande celler med minimal cellrester. Sfäroider överlevde varsam hantering utan skador, så att de kan samlas in och används i en mängd olika analyser.
(figur 3A), vilket resulterade i aggregat av döda celler. I närvaro av damm eller andra föroreningar fiber, flera eller oregelbundet formade kluster cell som endast svagt samman bildats, och de resulterande sfäroiderna lätt bröts sönder vid hantering. Sfäroid formation påverkades också av suboptimala koncentrationer av MC eller serum i sfäroid formation medium (Figur 3B). I våra tester, många cellinjer kunde vidhäfta till cell-avstötande plattor i frånvaro, eller vid låga koncentrationer, av MC, och resulterade i bildandet av en sfäroid som omges av ett cellmonoskikt (figur 3B-ii). visas BxPC-3 celltillväxt i suboptimala MC betingelser som ett exempel. I allmänhet, högre koncentrationer av MC förhindrade celler från att vidhäfta till brunnen, men en alltför hög koncentration av MC reducerade cell-cellvidhäftning, och förhindrade celler frånsedimentering på botten av brunnen, vilket resulterade i bildandet av lösa aggregat och ett stort antal satellit sfäroider (Figur 3B-i). Koncentrationen av serum påverkade också cellöverlevnad, och cell-cell och cell-plastvidhäftning och behövs för att optimeras för olika cellinjer. För cellinjer såsom HCT-116 och PANC-1, en för hög serumkoncentration resulterade i överdriven cellproliferation och produktion av överdimensionerade sfäroider som lätt skadats av hantering, eller främjas celladhesion till plasten väl och bildandet av ett monolager ( Figur 3B-iii). Intressant nog effekterna av otillräcklig serum skilde mellan cellinjer. HCT-116 cellöverlevnad reducerades och sfäroiderna bildade var små, som innehåller en stor andel av döda celler i lågt serum. I kontrast, PANC-1-celler var livsdugliga i frånvaro av serum, men blev mer vidhäftande, och bildade multipla aggregat samt ett cellmonoskikt (figur 3B-IV, V).
En modifiering av den beskrivna sfäroid formation protokoll, i vilket individuella cellerna suspenderas i högre koncentration MC (30 mg / ml) kan användas för att övervaka anoikis motstånd. Vid dessa MC koncentrationer, kan mediet fortfarande överföras med pipett medan cool, men tjocknade till en fast gel vid 37 ° C. Anoikis resistenta cellerna resuspenderades i detta medium återstod i suspension och prolifererade över en period av 2-4 veckor, som bildar suspenderade sfäroider av varierande storlekar (Figur 6B). Förankringsberoende celler inte bildar sfäroider under dessa betingelser. Vi kunde kvantifiera anoikis-motstånd genom att räkna number av sfäroider bildas i varje brunn.
Figur 1: Översikt över 3D Sfäroid Formation protokoll. Celler odlade i monolagerkultur dissocieras, räknades, pelleterades och återsuspenderades i sfäroid formation medium kompletterat med metylcellulosa (MC) och serum (i-iv). Suspensionen ympades i en U-bottnad cellavvisande platta vid önskad densitet för att medge bildning av sfäroider av önskad storlek (v), och plattan inkuberas för att producera en enda, diskret cell sfäroid i varje brunn (vi). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Optimerad Sfäroid Formation förhållanden.(A) Sfäroid bildning under optimala förhållanden för SH-SY5Y-celler. 1000 celler sådda i U-bottnade cellavvisande plattor i medium kompletterat med 5% serum och 1 mg / ml MC samman till kompakta sfäroider inom 24 timmar. (B) Representativa bilder av sfäroider bildas av olika cellinjer under optimala förhållanden som visas i tabell 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Sfäroid Bildning Under förhållandena inte är optimala. (A) sfäroider bildas i närvaro av föroreningar. Mikrobiell förorening resulterade i celldöd och löst aggregerade sfäroider. I närvaro av olösliga föroreningar, såsom damm eller fibrer, celler vidhäftade till dessa material och inte aggregåt. (B) Sfäroid bildning i suboptimal sfäroid formation medium. BxPC-3-celler sådda i närvaro av överskott av MC (10 mg / ml) som bildas många satellit sfäroider (i), medan otillräcklig MC (0 mg / ml) resulterade i cellaggregat som vidhäftade till brunnens botten och bildade ett monolager (ii ). Liknande resultat observerades för andra testade cellinjer (ej visad). Överskott serum (20%) resulterade i ökad HCT-116 celltillväxt och monolager bildning (iii). Otillräcklig serum (0%) hade cellinje specifika effekter som sträcker sig från celldöd i HCT-116 (iv) till bildandet av satellit sfäroider i PANC-1 (v). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Invasion analys Använda sfäroider. (A) Ove översikt av sfäroid invasionsanalys. Avbildningskärlet förbelagd med ett skikt av neutraliserad kollagen och inkuberas för att polymerisera kollagen (I-II). Förformade sfäroider uppsamlas i 1,5 ml rör och återsuspenderades i neutraliserad kollagen (iii-vi). Den sfäroid-kollagenblandningen överlagras på kollagen bas-skikt och inkuberas för att polymerisera kollagen (vii-viii). Odlingsmedium innehållande önskade föreningarna sedan överlagras på det polymeriserade sfäroid-kollagenskiktet och inkuberas för att tillåta cellinvasion (ix-x). (B) i närvaro av en kemoattraherande celler visas invadera i den omgivande kollagenmatrisen från en inbäddad PANC-1 sfäroid vid de angivna tidpunkterna. Varje panel visar en faskontrastbilden förvärvats med hjälp av en 10X objektiv. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: immunofluorescensfärgning av kollagen-inbäddade sfäroider. (A) Översikt över protokoll för immunofluorescens färgning av sfäroider. Inbäddade sfäroider tvättas, fast (NBF), och blockerade (BSA) direkt i bildkärlet. Sfäroider kan färgas direkt, eller skars ut och färgades i en mindre volym, till exempel en 1,5 ml rör. Sfäroider bör tvättas med överskott buffert efter varje fläck för att minimera bakgrundsfluorescens. Färgade sfäroider kan avbildas direkt i kärlet eller monterad under en täck för avbildning och lagring. (B) Immunofluorescens bilder av ett TPC-1 cell sfäroid inbäddade i kollagen och tilläts invadera under 24 h. (C) bilder som visar falloidin färgade celler typiska för regioner som anges i B. Varje panel visar en 20 um Z-projektion (0,2 um steg) förvärvats med hjälp en 60X mål: Celler i sfäroid BODY approximativt 20 ^ m från ytan (1), celler som skjuter ut in i kollagen (2), och celler som invaderar genom kollagen (3). Skalstrecken = 25 | im. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Sfäroid Formation anoikis analys. (A) Översikt över protokoll för anoikis analys. Celler framställes såsom beskrivits i figur 1, men återsuspenderas i sfäroid formation medium innehållande ett minimum av 30 mg / ml MC som bildar ett tjockt lager för att hålla enskilda celler i suspension och förhindra cellaggregation (i-ii). Cellsuspensionen såddes i U-bottnade cellavvisande plattor och inkuberades (III-IV). De suspenderade cellerna kan övervakas för sfäroid bildning av proliferation, vilket indikerar anoikis motstånd. (
| cELLINJE | MC (mg / ml) | Serum (%) | ungefärlig inkubation tid |
| SH-SY5Y | 1 | 5 | 24 timmar |
| BxPC-3 | 5 | 5 | 3 till 5 dagar |
| PANC-1 | 5 | 5 | 5 till 7 dagar |
| HCT-116 | 3 | 10 | 2 till 4 dagar |
| TT | 1 | 10 | 7 till 10 dagar |
| TPC-1 | 3 | 5 | 1 till 2 dagar |
Tabell 1: Optimal Sfäroid Bildning Medium Sammansättning och inkubationstider för validerade cellinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterar en snabb och flexibel metod för att producera 3D-cell sfäroiderna att modellera arkitektur in vivo vävnader med hjälp av billiga och lättillgängliga reagens. Vår protokoll utnyttjar icke-cytotoxiska och vidhäftningsbefrämjande egenskaperna hos MC 8, 9 att medla cell aggregering och minimera cellmonolager bildas. Till skillnad från proteinbaserade matriser som isolerats från djurkällor, är MC inert, innehåller inga tillväxtfaktorer, och kan lätt avlägsnas genom tvättning, vilket möjliggör isolering av sfäroider för användning i en mängd olika tillämpningar utan närvaro av kvarvarande matris. Vår protokoll använder snabb aggregering av enhetliga cellantal för att generera homogent stora sfäroider, vilket gör att direkta jämförelser av sfäroider odlas under olika experimentella betingelser. Denna metod kan anpassas för blandade kulturer att modellera in vivo tumörtillväxt genom att kombinera fasta nummer för flera tumörassocierade celltyper (t.ex. fibroblaster, leukocyter, stromaceller) för att mer exakt representera tumörmiljön.
Ändringar av våra protokoll användning av celler sådda i höga koncentrationer av MC kan göras för att övervaka förankringsoberoende tillväxt av celler med förmåga att föröka sig i suspension, och kan användas som en anoikis analys (avsnitt 6) för att identifiera eller kvantifiera celltransformation. Sfäroider som genereras av våra protokoll är idealiska för tillämpningar såsom läkemedelsscreening, vilket gör jämförelse av celltillväxt, metabolism, överlevnad, och invasions mellan behandlingsförhållanden. Isolerade sfäroiderna kan också vara inbäddade i ett extracellulärt matrix, såsom kollagen, för att bedöma och kvantifiera cell invasiv i en 3D-mikro (avsnitt 2.2, Figur 4) som mer exakt modeller in vivo tumörtillväxt. Vidare kan våra protokoll användas för att isolera stora mängder av sfäroider från MC matris för protein eller RNA-beredning, vilket gör att uSERS att utvärdera cell signal eller genuttryck förändringar som svar på behandling eller tillväxtbetingelser.
Vår sfäroid bildning protokollet kräver optimering av serum och MC koncentrationer och antalet celler sådda för varje cellinje. Cellinje specifika egenskaper, såsom cellviabilitet, cell-cell och cell-plastvidhäftningsförmåga, kan väsentligt påverka den lätthet med vilken sfäroider bildas. I allmänhet, cellinjer med dålig lönsamhet i monolager kultur krävs högre serumkoncentrationer för att främja sfäroid bildning, medan högre MC koncentrationer föredrogs för mycket vidhäftande cellinjer. Vi rekommenderar därför att titreringar av serum och MC utföras för att bestämma de optimala förhållandena för cellöverlevnad (serumkoncentrationen), och samtidigt minimera monolager och satellit sfäroid formation (MC koncentration). Dessa villkor bör resultera i generering av en enda diskret sfäroid per brunn utan satelliter. Optimal sfäroid storlek föranalys är applikationsberoende och påverkas av antalet celler sådda och serumkoncentrationen (steg 1.4.7). Sådd färre celler ger mindre aggregat som lättare är homogent färgade, men kan inte föröka sig in vivo cell-cell och cell-mikro interaktioner. Ökning av antalet celler sådda genererar större sfäroider, som kan innehålla en fysiologiskt representativ hypoxisk kärna 10 som kan påverka cellens beteende och ändra tolkningar av tillväxt- eller överlevnadsanalyser. Men när alltför stor, kan sfäroider vara bräcklig och lätt bryts sönder eller skadas under isolering. Större sfäroider är också mycket svårare att visualisera utan specialiserade avbildningsplattformar för optisk sektionering (t.ex. ljus ark fluorescerande mikroskop) eller genom att bädda in eller cryosectioning och färgning av tvärsnitt genom sfäroid 11. Vi rekommenderar ett mål sfäroid storlek 200-500 pm för flexibilitet ochlätthanterlighet för de flesta tillämpningar. Totalt sett är det viktigt att optimera betingelserna för sfäroid-bildning i både en cellinje specifika och programspecifikt sätt.
Sfäroid produktionsprotokoll kräver särskild uppmärksamhet för att undvika kontaminering av sfäroider av damm och andra partiklar. Celler följa damm och andra olösliga föroreningar, vilket resulterar i oregelbundet formade, löst vidhäftande cellaggregat olämpliga för användning i analyser (figur 3A). Föroreningskällor kan minimeras genom att passera alla lösningar genom ett 0,45 ^ m filter, sköljning av cellmonoskiktet med filtrerat medium före dissociation (steg 1.4.1), och sköljning flerkanalspipett reservoarer med filtrerat ultrarent vatten omedelbart före användning (Steg 1.4.6.1). Vidare, bomull filtrerad serologiska pipetter, som kan kasta fibrer i lösningar, bör undvikas. Även om det inte kritisk, kan damm minskas ytterligare genom att dissociated celler genom en 100 ìm cell sil före sådd (steg 1.4.6). Avdunstning av medium är ett ytterligare tekniska undersökningar, särskilt för inkubationstider än en vecka, såsom de som krävs av vissa cellinjer för sfäroid bildning (tabell 1) eller under anoikis analyser (avsnitt 6). Avdunstning kan minimeras genom ympning celler i brunnar i mittområdet av flerbrunnsplattor, fyllning omkretsen brunnar med ultrarent vatten och löst försegling av kanterna av plattan eller innesluter plattan i en fuktad kammare.
3D cell sfäroider är en värdefull modell för studier av både normala och tumörcellbeteende och fysiologi. Vår protokoll är en snabb och ekonomisk metod för generering av genomgående stora 3D cell sfäroider som kan användas i ett sortiment av analyser och tillämpningar. Dessa sfäroider representerar värdefulla verktyg för karakterisering av tumörtillväxt och mikro interaktioner samt modeller för preclinical utvärdering av nya terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffers | |||
| 10x Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| Calcium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 21114 | Used for PBS+ wash buffer; Do not autoclave PBS+ wash buffer upon addition of calcium chloride |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | M1028 | Used for PBS+ wash buffer; Do not autoclave PBS+ wash buffer upon addition of magnesium chloride |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Spheroid Formation | |||
| 96-well U-bottom Cell-Repellent Plate | Greiner Bio-One | 650970 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | D5546 | For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines |
| F12K Medium | Thermo Fisher Scientific | 2112722 | For culturing TT cell line |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | Filter prior to use to remove particulate contaminants |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M7027 | Prepare in water to 100 mg/mL |
| Roswell Park Memorial Institute Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | Dissociation buffer |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Invasion Assay | |||
| Bovine Type I Collagen | Corning Incorporated | 354231 | Stock 3.1 mg/mL; Maintain on ice when in use |
| DMEM Phenol Red Free Low Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11054-20 | Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium |
| Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-10 | Chemoattractant |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Immunofluorescence Microscopy | |||
| #1.5 Coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72225-01 | For mounting excised spheroids |
| Alexa-Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | Used to stain actin at 1:200 |
| Bovine Serum Albumin | Bioshop Canada Incorporated | ALB001 | Used in BSA blocking buffer |
| Dabco 33-LV | Sigma-Aldrich | 290734 | Antifade |
| Glycerol | Bioshop Canada Incorporated | GLY001 | Used in MOWIOL mounting medium |
| ImageJ Software | Freeware, NIH | - | Used for image analysis |
| Microslides | VWR International | 48312-024 | For mounting excised spheroids |
| MOWIOL 4-88 | EMD-Millipore | 475904 | Used in MOWIOL mounting medium |
| Paraformaldehyde | EMD-Millipore | PX0055-3 | Used in fixation buffer |
| Triton X-100 | Bioshop Canada Incorporated | TRX777 | Used in permeabilization buffer |
References
- Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. A. Two-dimensional vs. three-dimensional in vitro tumor migration and invasion assays. Methods Mol Biol. 986 (986), 227-252 (2013).
- Albini, A., Noonan, D. M. The 'chemoinvasion' assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).
- Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture. Methods Mol Biol. 695, 17-39 (2011).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. (51), (2011).
- Handschel, J. G., et al. Prospects of micromass culture technology in tissue engineering. Head Face Med. 3, 4 (2007).
- Stuckhoff, A. P., DelValle, L. Neuronal Cell Culture Methods and Protocols Vol. 1078 Methods in Molecular Biology. Amini, S., White, M. K. 1078, Humana Press. 119-132 (2013).
- Stewart, G. J., Wang, Y., Niewiarowski, S. Methylcellulose protects the ability of anchorage-dependent cells to adhere following isolation and holding in suspension. Biotechniques. 19 (4), 598-604 (1995).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biol. 10, 29 (2012).
- Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional. Anal. Biochem. 437 (1), 17-19 (2013).
