Abstract
단층 세포 배양 충분히 복잡한 세포 - 세포 및 세포 - 기질 상호 작용을 포함한다 조직의 생체 내 행동을 모델링하지 않습니다. 3 차원 (3D) 세포 배양 기술을 접착 세포 배양의 단점을 해결하기 위해 개발 된 최근의 기술 혁신이다. 시험관 내에서 조직 유사체를 생성하기위한 몇 가지 기술이 개발되었지만,이 방법은 비용이 확립 자주 복잡 특수 장비를 필요로하고, 일반적으로 특정 유형의 세포와의 호환성에 의해 제한된다. 여기서는 종양 정상적인 다양한 세포주의 성장과 호환 일관된 크기 다세포 차원 타원체로 세포 응집을위한 신속하고 유연한 프로토콜을 설명한다. 우리 앵커리지 독립적 타원체 생성을 촉진하고, 높은 재현성으로 세포 단층의 형성을 방지하기 위해 혈청 및 메틸 셀룰로오스 (MC)의 다양한 농도를 사용한다. 개인 라지을위한 최적의 조건idual 세포주 회전 타원체 형성 매체 MC 또는 혈청 농도를 조정함으로써 달성 될 수있다. 생성 된 3D 타원체 셀 시그널링 또는 유전자 발현 연구 후보 약물 스크리닝, 또는 종양 세포의 침윤 및 이동과 같은 세포 과정의 연구 등의 다양한 애플리케이션에 사용하기 위해 수집 될 수있다. 프로토콜은 또한 용이하게 단일 세포 클론 타원체를 생성하도록 구성되고, 앵커리지 - 독립된 성장 anoikis 저항을 평가하도록 구성 될 수있다. 전체적으로, 우리는 프로토콜을 생성하고, 정상 및 종양 세포의 생체 내 성장을 조직의 3 차원 미세 요점을 되풀이하고 모델링하기 위해 3 차원 셀 타원체를 이용하는 쉽게 수정 방법을 제공한다.
Introduction
종양 세포의 생물학적 행위 관련 사정이 적절히 생체 내에서 발견되는 세포 미세 환경을 반영하지 않기 때문에, 부분적으로는 기존의 2 차원 세포 배양 방법을 사용하여 도전하고있다. 배양 (예, 보이든 챔버 분석법)에 세포 외 기질 성분을 통합하는 대안 적 방법은 생체 조직 환경 이상의 생리 대표. 그러나, 개별 셀 동작의 평가에 한정 될 수 있으며, 조직 또는 종양 성장을 1, 2, 3에 기여하는 세포 기질 및 세포 - 세포 상호 작용의 생체 조합 복소 요점을 되풀이하지 않는다.
다세포 타원체의 사용은,보다 정확하게 생체 내 세포 성장 (1)의 콤팩트 한 구조를 재생하는 방법이다 최근4. 구 상체는 정상 세포의 세포 - 기질 상호 작용을 조사하기 위하여 사용될 수 있으며,뿐만 아니라, 전이성 성장 또는 약물 내성 4와 같은 종양 진행의 특성을 모델링하기 위해, 종양 유사체로서 작용할 수있다.
타원체가 매트릭스 5 또는 더 빠르게 내장 단일 세포의 증식에 의해 형성 될 수 있고, 다수의 세포의 응집을 촉진함으로써 단일 셀 클러스터 (예를 들어, 걸려 강하를 원심 분리 방법) (6, 7)을 형성한다. 기존의 세포 응집 기술은 비용이 많이 드는 재료 또는 특수 장비가 필요할 수 있습니다. 또한, 이러한 회전 타원체는 크기 및 모폴로지의 넓은 범위가 성장 조건이나 곤란 치료 간의 비교를, 대량 생산하기가 어려울 수있다. 마지막으로, 이러한 방법에 의해 생성 된 타원체는 단백질 extracel에서 분리하기가 어려울 수 있습니다적인 다공질 행렬을하는 그들은 다른 응용 프로그램에서 사용하기 위해 포함됩니다.
여기에서는 시판 U 바닥 셀 반발 판 불활성 접착 촉진 행렬 메틸 셀룰로오스를 이용하여 지속적으로 크기가 셀 타원체의 신속한 형성을위한 견고하고 용이하게 수정 세포 응집 방법을 설명한다. 형성 후에,이 다세포 타원체 용이하게 다양한 애플리케이션에서 사용하기 위해 분리된다. 프로토콜은 쉽게 다른 세포 프로세스를 평가하기 위해 사용될 수있다 세포 증식을 통해 구 상체를 생성하도록 구성된다. 여기, 우리는이 두 개의 서로 다른 회전 타원체 형성 프로토콜의 예 응용 프로그램과 같은 면역 형광 염색법에 의해 정량화 셀 침공 분석, 및 anoikis 분석은 보여줍니다.
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Protocol
참고 : 모든 시약 및 소모품은 재료 목록에 나열되어 있습니다.
셀 집계 1. 회전 타원체 생산
- 메틸 셀룰로오스 용액 100 ㎎ / ㎖의 메틸 셀룰로오스 100 ㎖를 준비한다.
- 열 50ml의 초순수 H 2 O 80 °의 C. 10g 메틸 셀룰로오스 분말을 추가하고 입자가 균일하게 분산 될 때까지 교반.
- 차가운 초순수 H 2 O와 최종 부피 가져 오기 및 솔루션이 명확해질 때까지 4 ℃에서 교반, 밀짚 색깔, 그리고 눈에 보이는 고체가 포함되어 있지 않습니다.
- 용해되지 않은 고형물을 제거하기 위해 0.45 ㎛의 필터를 통과한다. 준비된 용액을 분주하고 12 개월까지 4 ℃에서 저장 될 수있다.
주 : 메틸 셀룰로오스는 세포 - 세포 부착을 향상시키고 접착 성 세포 단층의 형성을 억제 할 수있는 비 독성, 불활성, 현탁 화제로서 기능한다. 메틸 셀룰로오스는 수용성이고 spher 따라 씻겨 수OID 세대.
- 회전 타원체 형성 매체
참고 : 사용하기 전에 즉시 회전 타원체 형성 매체를 준비합니다. 보관하지 마십시오.- 적절한 배지에서 1 내지 5 ㎎ / ㎖로 메틸 셀룰로오스 용액을 희석.
- 소독 및 용해되지 않은 고형물을 제거하기 위해 0.22 ㎛의 필터를 통과한다.
- 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)
- 배에서 사용하기 전에 0.45 μm의 필터를 통과하도록 희석. 제조 된 용액을 실온에서 무기한으로 저장 될 수있다.
- 셀 회전 타원체 생산 (그림 1)
참고 : 사전에 모든 시약을 준비합니다. 이 먼지, 섬유 또는 기타 불용성 입자에 의해 용액의 오염을 방지하는 것이 중요하다. 이러한 오염 물질의 존재는 불리하게 회전 타원체의 형성에 영향을 미칠 것이다. 배지 및 기타 솔루션이 때 POS 입자를 제거하기 위해 0.45 ㎛의 필터를 통과해야sible. 이러한 추가 섬유를 소개합니다 수있는 솔루션을 전송할 때면 필터링 피펫의 사용을 피하십시오.- 적절한 배양 70 % 합류로 배양 세포 단층을 배지 10 % 혈청. 기음 문화 매체와 이물질을 제거하는 1X PBS로 씻어. 트립신 EDTA (0.05 % 트립신)를 10cm 세포 배양 접시에 해리 버퍼 3 mL를 넣어 CO 2를 37 ° C에서 세포를 품어 5 %.
- 분리를 확인하기 위해 10 배 배율 현미경으로 세포를 검사합니다. 혈청이 보충 된 배양 배지 7 ㎖의 분해 완충액을 중화.
- 10 분에 부드럽게 펠릿 세포 500 XG에 원심 분리기 세포 현탁액.
- 상층 액을 제거합니다. 필터 팁을 가진 P1000 피펫을 사용하여 1 ㎖의 구형 형성 배지에 재현 탁 세포 펠렛.
주 : 세포 현탁액 덩어리가 없어야한다.- 세포 펠렛을 씹다하려면 약간의 각도와 비즈니스 튜브의 바닥에 대한 피펫 팁을 누르십시오피펫은 세포 펠렛 전단합니다. 이 세포를 손상시킬 수로 5 회 - 3 개 이상을 분쇄하여 피하십시오. 피펫 천천히 거품을 만드는 피하기 위해 피펫 팁의 전체 내용을 추방하지 않습니다.
- 혈구를 사용하여 세포를 카운트 1 × 104 세포 / mL의 세포 현탁액을 희석.
주 : 셀 번호는 다양한 크기의 타원체를 생성하도록 최적화 될 수있다. 손상된 세포를 트리 판 블루 염색 현탁 세포의 생존 능력을 확인하기 위해 사용될 수있다. - 전송 셀 멸균, 먼지가없는 멀티 채널 피펫 저수지에 서스펜션과 96 웰 U 바닥 세포 반발 플레이트의 각 웰에 100 μL를 분배하는 필터 팁을 사용합니다.
- 여과 초순수 H 2 O와 린스 탱크는 먼지와 섬유를 제거합니다.
- 저장조의 바닥에 침강 세포를 방지하기 위해 주기적으로 시드 중에 세포 현탁액을 혼합한다. 혼합 dispensin 동안 거품을 만드는 피하기 위해, 역 피펫 팅 기술을 사용지.
- 조직 문화 인큐베이터로 전송 판 (37 ° C와 5 % CO 2) 및 회전 타원체 형성을 위해 매일 검사합니다. 세포는 잘 6 시간 내에 각의 바닥에 정착하고 24 ~ 48 시간 (그림 2) 내에서 회전 타원체로 집계 일반적으로해야합니다.
- 성공적인 타원체 형성의 확인 들어, P10 팁을 사용하여 조심스럽게 10 배 확대 한 현미경 관찰하면서 회전 타원체 매체 위에 피펫. 제대로 형성 스페 로이드는 3D 구조를 확인하고, 판 및 롤에서 느슨해 질 것입니다.
주 : 각 세포주 웰당 하나의 회전 타원체의 형성을 수득하기 위해 메틸 셀룰로스 및 혈청 농도는 적정에 의해 결정되어야한다. 선택된 세포주는이 방식으로 최적화 조건은 표 1에 도시되며, 회전 타원체의 예는도 2b에 형성. 표시된 것보다 타원체는 이상 성장 될 수 있지만,이 커질대로 점차적으로 더 어려워 성장분열없이 처리 할 수 있습니다. 세포 단층 위성 타원체를 형성하거나, 웰의 바닥에 침전하지 않으면, 메틸 셀룰로오스, 혈청 농도가 상기 최적 회전 타원체 형성 (도 3b)에 대해 조정될 필요가있다. 이러한 섬유 나 먼지 (그림 3A)와 같은 오염 물질을 포함하는 타원체를 사용하지 마십시오. 예비 형성된 타원체는 분석 성장 인자, 생균 얼룩 또는 억제제로서의 관심있는 화합물로 처리 될 수있다.
2. 회전 타원체 침공 분석 (그림 4)
- 중화 콜라겐
- 4 ° C에 모든 액체를 냉각하고 원하지 않는 중합을 방지하기 위해 콜라겐 작업을 할 때 얼음에 개최합니다.
- 0.22 μm의 필터를 통해 초순수 H 2 O 패스 모든 솔루션의 NaOH와 신선한 0.1 M 염산의 신선한 0.1 M 및 0.01 M 솔루션을 준비합니다.
- 1 : 소 유형 1 콜라겐 (3.1 ㎎ / ㎖의 주), 0.01 M NaOH를 10 배 PBS (8 믹스: 1 부피 비율) 차가운 0.1 M 수산화 나트륨과 염산을 사용하여 pH를 7.4로 조정한다. 콜라겐의 최종 농도 / ㎖ 2.5 mg이었다.
- 2-3mm의 깊이로 촬상 용기를 채우기에 충분한 중화 콜라겐을 준비한다. 100 μL의 최소 자재 목록에 8 웰 조직 배양 챔버 슬라이드의 각 웰에 대해 요구된다.
- 콜라겐의 타원체를 포함한다 (그림 4)
- 코트 콜라겐 중화 50 μL의 최소 8 웰 조직 배양 챔버 슬라이드의 각 웰의 바닥.
- 콜라겐에 거품을 만드는 피하기 위해 역 피펫 팅 기술을 사용합니다. 우물의 표면에 균일하게 콜라겐을 확산 피펫 팁을 사용합니다.
참고 :이 콜라겐베이스 층은 현탁액 타원체를 개최하고 일반적으로 1-2mm 두께 것입니다. 베이스 층은 상부 콜라겐 층 상에 메 니스 커스의 형성을 최소화한다. 베이스 층이 너무 얇 으면, 구 상체는 챔버 슬라이드의 바닥과 접촉 할 수 있고세포 단층을 형성한다.
- 콜라겐에 거품을 만드는 피하기 위해 역 피펫 팅 기술을 사용합니다. 우물의 표면에 균일하게 콜라겐을 확산 피펫 팁을 사용합니다.
- 10cm의 조직 배양 접시에 챔버 슬라이드 및 초순수 H 2 O로 가득 35mm 조직 배양 접시를 놓습니다. 콜라겐은 일반적으로 1 시간 중합 될 때까지 37 ℃에서 인큐베이션. 스토어 얼음에 콜라겐을 중화 남아.
참고 : 물이 채워진 35mm 접시 습도를 제공하고 건조를 방지 할 수 있습니다. 챔버 슬라이드에 걸쳐 분석이 습도 챔버에 남아 있어야한다. 콜라겐베이스 층 밤새 중합 남아있을 수있다. 장기간 배양은 일반적으로 더 단단한 겔을 초래한다. - p1,000 필터 팁을 사용하여, 상단 튜브 스냅 1.5 mL에 96 웰 U 바닥 세포 반발 판에서 미리 형성된 회전 타원체 (단계 1.4.7)를 수집합니다. 피펫 천천히 반복 방지하고 또는 활발한 피펫은 회전 타원체의 유체 전단을 최소화 할 수 있습니다. 여러 타원체는 8 잘 조직 배양 챔버 슬라이드의 잘 하나에 전송을위한 하나의 튜브에 풀링 할 수있다.
- TABL에 수집 된 타원체를 원심 분리기2-5의 2,000 XG와의 etop의 마이크로 원심은 P200 피펫을 사용하여 상층 액을 제거합니다. 이것은 회전 타원체가 깨지거나 함께 응집시킬 수 있으므로, 필요 이상 원심 분리하지 마십시오.
참고 : 상층 액의 대부분을 피펫 팅 한 후, 튜브를 조심스럽게 초과 액체를 멀리 심지하는 깨끗한 종이 타월 위에 반전 될 수있다. 회전 타원체 건조하는 것을 허용하지 않습니다. - 넓은 구멍 P200 팁을 사용하여 부드럽게 콜라겐을 중화 50 μL에서 회전 타원체를 재현 탁. 어떤 타원체가 챔버 슬라이드로 전송되기 전에 수집 된 타원체의 각 튜브에 대해이 작업을 수행합니다. 챔버 슬라이드에 전송을위한 준비가 될 때까지 얼음에 무력화 콜라겐에 재현 탁 된 회전 타원체를 유지합니다.
- 인큐베이터 챔버에서 슬라이드를 제거하고 신중 콜라겐베이스 층의 상부에 회전 타원체 콜라겐 혼합물을 피펫. 콜라겐이 중합 될 때까지 CO 2, 37 ℃에서 인큐베이션하고, 5 %.
- 거품을 만드는 피하기 위해 피펫의 전체 내용을 분배하지 마십시오. Dropw이세 피펫 콜라겐베이스 층을 방해 할 가능성을 감소시킨다.
- 천천히 μL 챔버 슬라이드의 각 웰에 원하는 화학 유인 물질, 억제제, 또는 다른 치료법을 포함하는 배양 배지를 가온 (100)의 최소 추가한다. 액체가 너무 세게에 피펫 경우 콜라겐 층을 포함하는 타원체가 찢어 수 있습니다. 배양액을 천천히 콜라겐을 방해하지 않도록하기 위해 잘 측면을 생략 할 수있다.
- 세포 침입을 할 수 있도록 37 ° C, 5 % CO 2에서 챔버 슬라이드를 품어. 주위 콜라겐으로 세포 침윤 또는 형광 촬상 시야에서 관찰하여 표면 형광, 광 시트 또는 공 초점 현미경을 사용하여 다양한 방법에 의해 정량화 될 수있다.
- 코트 콜라겐 중화 50 μL의 최소 8 웰 조직 배양 챔버 슬라이드의 각 웰의 바닥.
침략 3. 정량 : 브라이트 현미경
- 설정된 시간 간격으로, 화상 A를 명 시야 현미경 (단계 2.2.8)를 사용하여 10 배 배율에서 타원체 콜라겐 매립.
참고 : 용장기 살아있는 세포 실험 가열 현미경 스테이지 및 CO 2 규제 챔버는 37 ° C에서 타원체 및 5 % CO 2 동안 영상을 유지하기 위해 사용될 수있다. - 주위 콜라겐과 각 시점에서 침입 평균 거리로 침입하는 세포의 수를 측정하는 등 ImageJ에 같은 소프트웨어를 사용하여 침입 정량화.
침략 4. 정량 : 라이브 셀 얼룩과 형광 현미경
- 단계 2.2.8 다음과 같은 DAPI, 칼 세인 AM, 또는 제조업체의 지침에 따라 세포주에 적합한 다른 세포 추적 화합물 형광 얼룩 챔버 슬라이드에서 매체를 보충합니다.
참고 : 침입의 정량화를 들어, 회전 타원체에 걸쳐 균일 한 염색이 필수적인 것은 아니다. 얼룩의 깊은 침투, 이상 배양을 필요로하는 응용 프로그램 (> 3 시간) 필요할 수 있습니다. - 얼룩을 제거하고 500 μL 따뜻한 1X PBS로 교체합니다. 에서10 분 동안 37 ° C에서 cubate 초과 얼룩을 제거합니다. 최소 2 회 반복한다.
- 형광 현미경을 사용하여 침입 회전 타원체를 통해 광학 부분을 취득.
참고 : 레이저 광선에 장시간 노출은 광독성과 광표백을 제한하기 위해 반복 촬영하는 동안 최소로 할 것. - 회전 타원체의 총 면적을 정량화하는데 사용될 수있는 Z-돌출부를 생성하도록 이러한 ImageJ에 같은 소프트웨어를 사용하여 침입 세포 및 거리의 수는 콜라겐 기질에 침입.
- 예를 들어, 침입을 정량 만 타원체 및 세포 침입을 강조 배경을 제외하고, 그 면적을 측정하기 위해 화상 임계치를 조정. 원래 회전 타원체의 면적은 침입을 정량화이 총에서 차감 할 수있다.
침략 5. 정량 : 면역 형광
참고 : 사용 REMO하기 전에 모든 솔루션 및 버퍼는 0.45 μm의 필터를 통과해야한다부정적인 염색에 영향을 미칠 수있는 파편을했습니다.
- PBS + 세척 버퍼를 준비합니다. 1X PBS를 준비하고 0.1 mm의 최종 농도 염화칼슘 2의 MgCl 2를 추가합니다. 염화칼슘 2의 MgCl 2를 추가 한 후 버퍼를 오토 클레이브하지 마십시오. 해결 방법은 필터 살균 실온에서 저장 될 수있다.
- 중성 완충 포르말린 (NBF) 고정 버퍼를 준비합니다. 0.6 g 파라 포름 알데히드에 1 M NaOH를 5 방울을 추가합니다. PBS + 20 mL를 가져 오기 및 파라 포름 알데히드가 (약 1 시간)에 용해 될 때까지 60 ℃에서 배양한다. 실온으로 냉각시키고, 1 M HCl로 pH 7.4까지를 조정한다.
참고 : NBF 고정 버퍼가 사용 직전에 준비를해야합니다. - 소 혈청 알부민 (BSA) 블로킹 버퍼를 준비한다. / V w 3 %에서 PBS +에서 BSA를 녹인다. 용액을 필터 멸균 수일 동안 4 ℃에 보관되지만 가장 새로운 제조 될 수있다. 가열하지 마십시오.
- Permeabilization 버퍼를 준비합니다. 트리톤 X-100을 희석PBS + 0.2 %의 v / V에.
참고 : Permeabilization 버퍼를 사용하기 전에 바로 준비를해야합니다. - 선택적으로, MOWIOL 설치 매체를 준비합니다. 2.4 g의 MOWIOL 6 g 글리세롤, 6 mL의 초순수의 H 실온에서 회에서 3 시간 동안 2 O. 믹스 수확기. 12 mL의 0.2 M 트리스 - CL (산도 8.5)를 추가합니다. 10 분 동안 50 ℃에서 혼합하면서 인큐베이션.
- 15 분 동안 5,000 XG에 원심 분리기 불용성 물질을 펠렛합니다. 안티 - 표백제와 같은 2.5 %의 DABCO를 추가합니다. -20 ° C에서 500 μL 씩에 보관할 것.
- 타원체의 면역 형광 염색법 (그림 5)
참고 : 천천히 챔버 슬라이드에서 액체를 추가하거나 제거 할 수 피펫을 사용합니다. 이 콜라겐 층을 방해 할 수 있으므로, 흡인기의 사용을 피하십시오.- 타원체를 준비하고 2 섹션 1에 기술 된 바와 같이, 콜라겐 가득한 챔버 슬라이드에 포함.
참고 : 콜라겐의 형광도가 얇은 층 또는 c의 작은 볼륨을 사용하여 최소화 할 수있다ollagen. - 각 챔버 슬라이드에서 가능한 한 많은 문화 매체를 제거합니다.
- 간단히 잔여 매체를 제거하기 위해 500 μL PBS + 세척 버퍼와 콜라겐 층을 씻어.
- 각 웰에 500 μL 신선한 PBS + 세척 버퍼를 추가하고 회전 타원체를 씻어 5 분 동안 37 ° C에서 품어. 두 번 반복합니다.
- 500 μL NBF 고정 버퍼와 PBS + 세척 버퍼를 교체합니다. 25 분 - 20 실온에서 품어.
- NBF 고정 버퍼를 제거하고 500 μL PBS + 세척 버퍼 씻어. 신선한 PBS + 5 분 동안 3 회 씻어 최소 버퍼 씻는다.
주 : 고정 타원체 며칠 동안 신선한 PBS + 세척 완충액에서 4 ℃에서 저장 될 수있다. 0.01 %의 아 지드 화 나트륨은 저장 동안 미생물의 성장을 억제하기 위해 세척 완충액에 첨가 할 수있다. - PBS는 + 500 μL의 permeabilization 버퍼와 버퍼를 씻어 교체합니다. 10-15 분 동안 실온에서 인큐베이션.
- 선택적으로, BSA 차단 버퍼를 제거합니다. 메스 나 가위, 소비세 회전 타원체와 콜라겐 층에서 주변 3mm X 3mm 영역을 사용. 넓은 구멍 P1000 팁을 사용, 신선한 BSA 차단 버퍼로 부드럽게 세척에 의해 콜라겐의 절제 블록을 제거. 1.5 ㎖의 튜브에 콜라겐 블록을 전송합니다.
- 2 분 동안 2,000 XG에 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다. 튜브는 조심스럽게 초과 액체를 멀리 심지 깨끗한 종이 타월 위에 반전 될 수있다.
- 타원체를 준비하고 2 섹션 1에 기술 된 바와 같이, 콜라겐 가득한 챔버 슬라이드에 포함.
- 타원체 1 차 항체를 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 전체 콜라겐 층이 균일하게 침수되도록 일차 항체의 충분한 볼륨을 추가합니다. 상기 선택적인 단계 (5.6.8.1-5.6.8.2)은 일반적으로 항체, 소량의 사용을 허용한다.
- 적어도 10 mL의 PBS + 세척 버피와 용기에 챔버 슬라이드를 잠수함10 분 동안 FER은 씻어. 최소 2 회 반복한다.
- 회전 타원체는 이전에 콜라겐 층 (스텝 5.6.8.1)로부터 절단 된 경우 선택, 1.5 mL의 튜브에 버퍼 부드럽게 교반 씻어 1 mL의 PBS + 최소를 추가합니다. 10 분의 최소 흡수 할 수 있습니다.
- 최대한 PBS + 세척 완충액을 제거하고 최소 2 회 씻어 버퍼 + PBS로 세척을 반복한다. 몇 분 동안 2,000 XG에 원심 분리기 콜라겐 블록 펠렛합니다.
참고 : 세척 버퍼에서 잠수하기 전에 70 % 에탄올로 닦아 챔버 슬라이드의 청소 외면.
- 단계를 반복 5.6.9-5.6.10 적절한 이차 항체를 사용하여.
참고 : 타원체가 영상 용기에 직접 염색하는 경우, 5.6.13 단계로 진행합니다. - 옵션, 타원체는 (5.6.8.1 단계) 이전에 콜라겐 층에서 적출 한 경우, 깨끗한 유리 슬라이드와 70 % 에탄올로 공 초점 현미경 호환 된 커버.
- O. 장착하기 전에이 단계를 즉시 수행 초순수 H 2의 콜라겐 블록에 resuspend에서 가능한 한 많이 세척 버퍼를 제거합니다. 물에 몸을 담근 스테인드 블록을 두지 마십시오.
- 좋은 팁 집게를 사용하여, 콜라겐 블록과 유리 슬라이드로 전송의 가장자리를 잡아.
- 집게를 사용하면 확실 직접 콜라겐을 건드리지 않도록주의하면서, 콜라겐 블록에서 초과 액체를 심지 깨끗한 면봉을 사용하여, 장소에 콜라겐을 개최합니다.
참고 : 콜라겐 면봉이 부드럽게 두 집게를 사용하여 제거 할 수 있습니다에 붙어 될 경우, 또는 물에 잠수하여.
- 역방향 피펫 팅 기법을 이용하여, 샘플 위에 콜라겐 블록 장소 커버 슬립 상에 100 μL MOWIOL 장착 매체 분배.
- 커버 슬립 아래에서 초과 MOWIOL 설치 매체와 물을 심지하기 위해 면봉이나 종이 타월을 사용합니다.
- MOWIOL 설치 매체가 4 ℃에서 하룻밤 강화하도록 허용매니큐어와 커버 슬립의 C. 인감 가장자리.
- 공 촛점 또는 형광 현미경을 사용하여 이미지 스테인드 타원체 관심, 침략 구조의 형성 등 (도 5B, 5C)의 단백질의 현지화를 관찰합니다.
참고 : 스테인드 타원체는 광표백을 방지하기 위해 빛으로부터 보호되어야한다.
6. Anoikis 분석
주 : 구형 형성 프로토콜 쉽게 다양한 종류의 세포 앵커리지 - 독립된 성장 anoikis 저항을 계량하도록 구성된다.
- anoikis 분석을위한 세포를 시드 (그림 6)
- 섹션 1.4 회전 타원체 생산을위한 지시 사항을 따르하지만 회전 타원체 형성 매체를 준비하는 30 ㎎ / ㎖의 메틸 셀룰로오스의 최소 사용합니다.
참고 : 따뜻하게하면, 30 ㎎ / ㎖의 메틸 셀룰로오스가 정지 세포를 보유하고 두꺼운 젤을 생산한다. - 주와 몇 일 동안 세포를 품어현미경을 사용하여 10 배 배율에서 정기적으로 SPECT. anoikis 저항 세포 증식과 식민지를 형성한다.
- 각 웰에 형성된 콜로니 수와 크기를 측정하여 정량화 anoikis.
주 : 콜로니가 형성되면, 이들은 메틸 셀룰로오스를 제거하는 세척 될 수 있고, 기술 된 바와 같이, 회전 타원체 기반 분석을 위해 사용된다.
- 섹션 1.4 회전 타원체 생산을위한 지시 사항을 따르하지만 회전 타원체 형성 매체를 준비하는 30 ㎎ / ㎖의 메틸 셀룰로오스의 최소 사용합니다.
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Representative Results
우리는 세포 반발 판과 MC로 보충 회전 타원체 형성 미디어를 사용하여 개별 회전 타원체를 생성하는 유연하고 효율적인 방법을 설명합니다. MC 혈청의 적절한 조건 하에서, 각각의 세포가 정착 웰 바닥에 최소한으로 부착 구 상체를 형성하는 웰의 중심에 함께 부착. 이 프로토콜을 이용하여, 구 상체는 다양한 세포주 (도 2b)에서 발생 하였다. MC 혈청 농도 적정은 단일 타원체가 단편화없이 조작 할 수 있도록 충분히 튼튼하다 형성되는 최적의 조건을 식별하는 각각의 세포주에 대해 요구된다. 최적의 구 상체는 직경이 200 내지 500 ㎛의 사이이었으며, 최소 세포 파편 단단히 부착 세포로 구성되었다. 타원체들을 수집 및 분석을 광범위하게 사용될 수 있도록, 손상없이 부드러운 핸들링 살아 남았다.
(도 3a)에 의해 손상 될 수있다. 처리시 먼지 나 오염 섬유 다중 또는 약하게 응집 형성 부정형 세포 클러스터, 얻어진 구 상체의 존재 하에서 쉽게 떨어져 끊었다. 회전 타원체 형성은 회전 타원체 형성 매체 (도 3b)에 최적 인 MC 농도 또는 혈청에 의해 영향을 받았다. 우리의 실험에서는, 다수의 세포주 MC 중, 부재 또는 낮은 농도에서 세포 반발 판에 부착 할 수 있었고, 세포 단층 (도 3B-II)에 의해 둘러싸인 구형의 형성 결과. MC 최적 조건의 BxPC-3 세포의 성장은 일례로서 도시되어있다. 일반적으로, MC 높은 농도의 웰에 세포 부착을 방해하지만, MC의 너무 높은 농도에서 세포 - 세포 부착 및 세포 방지 감소느슨한 응집체 수많은 위성 타원체 (도 3B-1)의 형성의 결과로, 웰의 바닥에 침전. 혈청의 농도는 세포 생존, 세포 - 세포 및 세포 - 플라스틱 접착 영향 상이한 세포주에 대해 최적화 될 필요가 있었다. 이러한 HCT-116 및 PANC-1 등의 세포주를 들어, 너무 높은 혈중 농도가 과대 증식하고 쉽게 취급 손상 또는 웰 플라스틱으로 세포 부착을 촉진 하였다 대형 구 상체의 제조 및 단층의 형성 (초래 그림 3B-III). 흥미롭게도, 혈청 부족의 영향은 세포주 사이에서 달랐다. HCT-116 세포의 생존율은 감소 형성된 타원체 낮은 혈청 사균을 다량 함유 작다고 하였다. 반대로, PANC-1 세포 혈청 부재하에 생존했으나, 더 부착되고, 다수의 응집체뿐 아니라 세포의 단층을 형성 (도 3B-IV, V).
개별 세포를 고농도 MC에 현탁 (30 ㎎ / ㎖)을 anoikis 저항을 모니터링 할 수있는 바와 타원체 형성 프로토콜의 변형. 이런 MC 농도에서, 매체는 여전히 37 ℃에서 고체 겔로 시원하면서 피펫으로 전달하지만 두껍게 할 수있다. 이 매체에 재현 탁 Anoikis 내성 세포 현탁액에 남아 있고 다양한 크기 (그림 6B)의 정지 타원체를 형성하는 2 ~ 4 주에 걸쳐 확산. 앵커리지에 의존하는 세포는 이러한 조건에서 회전 타원체를 형성하지 않습니다. 우리는 감각을 계산하여 anoikis 저항을 정량화 할 수 있었다타원체의 어 잘 각각 형성했다.
그림 1 : 3D 회전 타원체 형성 프로토콜의 개요. 단층 배양에서 배양 세포 해리 계수, 펠렛, 및 메틸 셀룰로오스 (MC) 및 혈청 (I-IV)로 보충 타원체 형성 배지에 재현 탁한다. 현탁액을 원하는 크기 (V)의 회전 타원체의 형성을 허용하기 위해, 원하는 농도에서 U 바닥 셀 반발 판에 접종하고, 플레이트는 각 웰 (VI) 중 하나의 개별 셀 타원체를 생산하는 배양된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 최적화 된 회전 타원체의 형성 조건.(A) SH-SY5Y 세포를 최적 조건으로 회전 타원체의 형성. 5 % 혈청 및 1 mg을 보충 미디어에서 U-바닥 세포 반발 플레이트에 접종 1,000 세포 / mL의 MC는 24 시간 내에 소형 회전 타원체로 집계. (B)를 표 1에 나타낸다 최적의 조건에서 다양한 세포주에 의해 형성된 회전 타원체의 대표 이미지 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 최적 인 조건에서 회전 타원체 형성. (A)는 회전 타원체 오염물의 존재하에 형성. 미생물 오염은 세포의 죽음과 느슨하게 집계 회전 타원체의 결과. 먼지 나 섬유, 이들 재료에 부착 된 세포와 같은 불용성 오염물의 존재 및 aggreg 않았다먹었다. 최적 회전 타원체 형성 매체 (B) 회전 타원체 형성. II (과량 MC의 존재하에 시드 BxPC-3 세포를 (10 ㎎ / ㎖)는 다수의 위성 타원체 (I)의 형성이 불충분 MC 상태 (0 ㎎ / ㎖)를 웰 바닥에 부착하고 단층을 형성 세포 집합체 초래 ). 유사한 결과가 다른 테스트 세포주에서 관찰되었다 (도시 생략). 과량의 혈청 (20 %) 증가 된 HCT-116 세포 증식 및 단층 형성 (III)였다. 혈청 부족 (0 %)는 세포 사멸에서 HCT-116의 범위 세포주 별 효과가 있었다 (IV) PANC-1 위성 타원체의 형성 (V). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 타원체를 사용 침공 분석. (A) OV회전 타원체 침공 분석의 erview. 촬상 용기 중화 콜라겐 층으로 미리 코팅 된 콜라겐 (I-II)를 중합 배양된다. 예비 형성된 타원체 1.5 ㎖의 튜브에 수집하고, 중화 된 콜라겐 (III-VI)에 재현 탁된다. 회전 타원체 콜라겐 혼합물을 콜라겐 기초 계층에 오버레이 및 콜라겐 (VII-VIII)을 중합 배양된다. 목적하는 화합물을 함유하는 성장 배지는 중합 타원체 콜라겐 층 입혔다 세포 침윤 (IX-X)를 허용하도록 배양한다. 화학 주성 인자의 존재 (B)는, 세포를 지시 된 시점에서 내장형 PANC-1 타원체에서 주위 콜라겐 매트릭스 내로 침입 나타낸다. 각각의 패널은 10 배 대물 렌즈를 사용하여 획득 된 위상차 이미지를 나타내고있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 콜라겐 포함 된 타원체의 면역 형광 염색법. 타원체의 면역 형광 염색법을위한 프로토콜의 (A) 개요. 임베디드 타원체 직접 영상 용기에, 세정 (NBF) 고정 및 (BSA)를 차단됩니다. 타원체 직접 염색 또는 절제 및 1.5 ㎖의 튜브로, 작은 부피로 염색 할 수있다. 타원체는 배경 형광을 최소화하기 위해 각 얼룩 다음 과량의 완충액으로 세척해야합니다. 스테인드 타원체는 용기에 직접 묘화 또는 이미징 및 저장을위한 커버 슬립 아래에 장착 될 수있다. TPC-1 세포 회전 타원체 콜라겐에 포함 된 24 시간 동안 침입 수의 (B) 면역 형광 이미지. 셀 회전 타원체의 B에서 : 팔로이 딘 염색 된 세포를 보여주는 (C) 이미지 B.에 표시된 지역의 전형적인 각 패널은 20 μm의 Z - 프로젝션 (0.2 μm의 단계)는 60X 목표를 사용하여 획득을 보여줍니다로디 약 20 μm의 표면으로부터 (1), 콜라겐 (2) 내로 돌출하는 세포와 콜라겐을 통해 침입하는 셀 (3). 스케일 바는 25 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 회전 타원체 형성 Anoikis 분석. anoikis 분석을위한 프로토콜의 (A) 개요. 세포를도 1에 기재된 바와 같이 제조되지만, 세포 응집 (I-II)을 현탁액에 각 셀을 길게 방지하기 위해 두꺼운 층을 형성하는 30 ㎎ / ㎖ MC 최소 함유 타원체 형성 배지에 재현 탁한다. 세포 현탁액은 U 바닥 셀 발수 플레이트에 접종하고 (III-IV)를 배양한다. 현탁 세포 anoikis 저항을 나타내는 증식 타원체 형성을 모니터링 할 수있다. (
| 세포주 | MC (㎎ / ㎖) | 혈청 (%) | 대략 배양 시각 |
| SH-SY5Y | 1 | (5) | 24 시간 |
| BxPC-3 | (5) | (5) | 3-5일 |
| PANC-1 | (5) | (5) | 5~7일 |
| HCT-116 | 삼 | (10) | 2~4일 |
| TT | 1 | (10) | 7-10일 |
| TPC-1 | 삼 | (5) | 1-2일 |
검증 된 세포주에 대한 최적의 회전 타원체 형성 중간 구성 및 배양 시간 : 표 1.
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Discussion
우리는 저렴하고 광범위하게 이용할 시약을 이용하여 생체 조직의 구조를 모델링하는 3 차원 셀 구 상체를 제조하기위한 신속하고 융통성있는 방법을 제시한다. 우리 프로토콜 MC (8, 9)의 비 독성 및 접착 촉진 성질 세포 응집을 매개 세포 단층의 형성을 최소화하기를 이용한다. 동물 소스로부터 단리 된 단백질 - 기초 매트릭스는 달리, MC는 불활성에는 성장 인자를 포함하지 않고, 쉽게 잔류 매트릭스의 존재없이 다양한 애플리케이션에 사용하기위한 회전 타원체의 절연 수 세척에 의해 제거된다. 우리의 프로토콜은 다양한 실험 조건 하에서 성장 타원체의 직접적인 비교를 허용 균일 크기의 타원체를 생성 일치 셀 수의 신속한 응집을 이용한다. 이 방법은 (다중 종양 - 관련 세포 유형의 고정 된 숫자를 조합하여 생체 내 종양 성장의 모델로 혼합 배양에 적합 할 수있다예를 들어, 섬유 아세포, 백혈구, 간질 세포)보다 정확하게 종양 환경을 표현한다.
MC 높은 농도로 시딩 된 프로토콜 사용하여 세포의 변형이 서스펜션에 증식 할 셀 앵커리지 - 독립된 성장을 모니터링 할 수 있고, 식별 또는 세포 형질 전환을 정량화하는 anoikis 분석 (제 6)로서 사용될 수있다. 우리의 프로토콜에 의해 생성 된 타원체는 처리 조건 사이의 세포 성장, 대사, 생존, 그리고 침입의 비교를 허용하는 등의 약물 검사와 같은 애플리케이션에 이상적이다. 격리 된 타원체는 평가와 3 차원 미세 환경 (2.2 절, 그림 4)에서 세포 침입을 정량화하기 위해, 콜라겐 등의 세포 외 기질에 삽입 될 수있는 생체 내 종양 성장에 더 정확하게 모델. 또한, 우리는 프로토콜 U 있도록, 단백질 또는 RNA의 제조를위한 MC 행렬에서 타원체 다량을 분리하는데 사용될 수있다SERS 치료 또는 성장 조건에 따라 셀 신호 또는 유전자 발현의 변화를 평가한다.
우리 타원체 형성 프로토콜 MC 혈청 농도, 각 세포주 파종 세포 수의 최적화를 필요로한다. 이러한 세포 생존, 세포 - 세포 및 세포 접착 성 수지 등의 세포주 특정 특성이 크게 스페 로이드가 형성되는 용이성에 영향을 미칠 수있다. 일반적으로 단층 배양 불량 가능성을 가진 세포주 MC보다 농도가 높은 접착제 세포주 바람직 동안, 회전 타원체의 형성을 촉진하기 위해보다 높은 혈중 농도가 필요했다. 따라서 우리는 단층 위성 타원체 형성 (MC 농도)를 최소화하면서 혈청 MC의 적정은 세포 생존 (혈중 농도)에 대한 최적의 조건을 결정하기 위해 수행 할 것을 추천한다. 이러한 조건은 위성 않고 잘 당 하나의 이산 회전 타원체의 발생을 초래한다. 최적 회전 타원체의 크기분석은 애플리케이션 의존적이며, 세포 시딩 혈청 농도 (단계 1.4.7)의 개수에 의해 영향을 받는다. 적은 수의 세포를 심는 것은 더 쉽게 균일하게 염색 작은 골재를 생산하지만, 생체 내 세포 - 세포 및 세포 미세 환경의 상호 작용에서 재생되지 않을 수 있습니다. 접종 세포의 수를 증가 시키면 셀의 동작에 영향을주는 성장 또는 생존 분석법 해석을 변경할 수있는 생리 학적으로 대표 저산소 코어 (10)를 포함 할 수있다 큰 타원체를 생성한다. 그러나, 너무 큰, 회전 타원체는 깨지기 쉬운 할 수 있고, 쉽게 떨어져 파손 또는 분리시 손상 될 수 있습니다. 큰 타원체는 광학 절편에 대한 전문 이미징 플랫폼 (예 : 광 시트 형광 현미경)없이 또는 삽입 또는 회전 타원체 (11) 냉동 절편과 단면의 염색에 의해 시각화하기가 훨씬 어렵습니다. 우리는 유연성이 200~500 ㎛의 구형의 타겟 사이즈를 추천 및대부분의 응용 프로그램 처리의 용이성. 전체적으로 두 세포주 특정 애플리케이션 특정 방식으로 구형의 형성을위한 조건을 최적화하는 것이 중요하다.
회전 타원체 생산 프로토콜에 먼지 나 다른 입자에 의해 회전 타원체의 오염을 방지하기 위해 특별한주의가 필요합니다. 세포는 불규칙한 모양의 결과로, 먼지 및 기타 불용성 오염 물질을 준수, 느슨하게 부착 셀은 분석에 사용 (그림 3A)에 적합 집계합니다. 오염원은 사용 직전 여과 초순수로 멀티 채널 피펫 저수지 (단계 1.4.1) 분리에 앞서, 여과 매체 세포 단층을 세척, 0.45 ㎛의 필터를 통해 모든 솔루션을 통과하고, 세정에 의해 최소화 될 수있다 (단계 1.4.6.1). 또한, 솔루션에 섬유를 흘릴 수면 필터링 된 혈청 피펫은 피해야한다. 중요하지 않지만, 상기 먼지 dissociat를 통과시킴으로써 감소 될 수있다시드 (단계 1.4.6) 이전에 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 에드 셀. 매체의 증발 손실이 특히 구형 형성 (표 1) 또는 anoikis 분석법 (제 6) 중 특정 세포주에 의해 요구되는 것과 같은 1 주일 초과 배양 시간에 대해, 추가적인 기술적 고려 사항이다. 증발은 멀티 웰 플레이트의 중심 영역의 웰에 세포를 파종 초순수 웰 경계 채우는 느슨하게 플레이트의 가장자리를 밀봉하거나 가습 챔버 내에서 상기 플레이트를 둘러싸는 최소화 될 수있다.
3 차원 셀 타원체는 정상 및 종양 세포 행동 모두 생리학 연구하기위한 유용한 모델이다. 우리의 프로토콜 분석 및 응용 프로그램의 구색에서 사용할 수있는 일관 크기의 3D 세포 타원체의 생성을위한 신속하고 경제적 인 방법이다. 이 타원체 홍보를위한 가치있는 종양의 성장 및 미세 상호 작용의 특성 분석을위한 도구뿐만 아니라 모델을 나타냅니다새로운 치료법의 e 임상 평가.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffers | |||
| 10x Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| Calcium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 21114 | Used for PBS+ wash buffer; Do not autoclave PBS+ wash buffer upon addition of calcium chloride |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | M1028 | Used for PBS+ wash buffer; Do not autoclave PBS+ wash buffer upon addition of magnesium chloride |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Spheroid Formation | |||
| 96-well U-bottom Cell-Repellent Plate | Greiner Bio-One | 650970 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | D5546 | For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines |
| F12K Medium | Thermo Fisher Scientific | 2112722 | For culturing TT cell line |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | Filter prior to use to remove particulate contaminants |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M7027 | Prepare in water to 100 mg/mL |
| Roswell Park Memorial Institute Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | Dissociation buffer |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Invasion Assay | |||
| Bovine Type I Collagen | Corning Incorporated | 354231 | Stock 3.1 mg/mL; Maintain on ice when in use |
| DMEM Phenol Red Free Low Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11054-20 | Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium |
| Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-10 | Chemoattractant |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Immunofluorescence Microscopy | |||
| #1.5 Coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72225-01 | For mounting excised spheroids |
| Alexa-Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | Used to stain actin at 1:200 |
| Bovine Serum Albumin | Bioshop Canada Incorporated | ALB001 | Used in BSA blocking buffer |
| Dabco 33-LV | Sigma-Aldrich | 290734 | Antifade |
| Glycerol | Bioshop Canada Incorporated | GLY001 | Used in MOWIOL mounting medium |
| ImageJ Software | Freeware, NIH | - | Used for image analysis |
| Microslides | VWR International | 48312-024 | For mounting excised spheroids |
| MOWIOL 4-88 | EMD-Millipore | 475904 | Used in MOWIOL mounting medium |
| Paraformaldehyde | EMD-Millipore | PX0055-3 | Used in fixation buffer |
| Triton X-100 | Bioshop Canada Incorporated | TRX777 | Used in permeabilization buffer |
References
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- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).
- Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture. Methods Mol Biol. 695, 17-39 (2011).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. (51), (2011).
- Handschel, J. G., et al. Prospects of micromass culture technology in tissue engineering. Head Face Med. 3, 4 (2007).
- Stuckhoff, A. P., DelValle, L. Neuronal Cell Culture Methods and Protocols Vol. 1078 Methods in Molecular Biology. Amini, S., White, M. K. 1078, Humana Press. 119-132 (2013).
- Stewart, G. J., Wang, Y., Niewiarowski, S. Methylcellulose protects the ability of anchorage-dependent cells to adhere following isolation and holding in suspension. Biotechniques. 19 (4), 598-604 (1995).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biol. 10, 29 (2012).
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