Abstract
単層細胞培養物は十分に複雑な細胞-細胞及び細胞-マトリックス相互作用に関与する組織のインビボ挙動をモデル化しません。三次元（3D）細胞培養技術は、接着細胞培養物の欠点に対処するために開発され、最近の技術革新です。 インビトロ組織類似体を生成するためのいくつかの技術が開発されてきたが、これらの方法を確立すること、高価、しばしば複雑であり、特殊な装置を必要とし、一般的にのみ、特定の細胞型との互換性により制限されます。ここでは、腫瘍の様々な成長と正常細胞株と互換性のある一貫したサイズの多3Dスフェロイドに細胞を集約するための迅速かつ柔軟なプロトコルを記述します。我々は、足場非依存性スフェロイドの生成を促進し、高度に再現可能な方法で細胞単層の形成を防止するために、血清およびメチルセルロース（MC）の種々の濃度を使用します。 INDIVのための最適条件idual細胞株はスフェロイド形成培地中MCまたは血清濃度を調整することによって達成することができます。生成された3Dスフェロイドは、細胞シグナル伝達または遺伝子発現研究、候補薬物のスクリーニング、またはそのような腫瘍細胞の浸潤および遊走などの細胞プロセスの研究に含めた幅広い用途での使用のために収集することができます。プロトコルはまた、容易に単一細胞からクローンスフェロイドを生成するように適合され、足場非依存性増殖およびアノイキス耐性を評価するために適合させることができます。全体として、我々のプロトコルは、組織の三次元微小環境を再現し、正常細胞および腫瘍細胞のインビボ増殖をモデル化するために、3D細胞スフェロイドを生成し、利用するための簡単に修正する方法を提供します。
Introduction
腫瘍細胞の挙動の生物学的に関連する評価は、これらが十分に生体内で見つかった細胞微小環境を反映していないため、部分的には、従来の2次元（2D）細胞培養法を用いて挑戦されています。培養物（ 例えば 、Boydenチャンバーアッセイ）に細胞外マトリックス成分を組み込んだ別のアプローチは、生体内の組織環境の複数の生理的に代表的なものです。しかしながら、それらは個々の細胞の挙動の評価に限定することができ、組織または腫瘍増殖1、2、3に寄与する細胞-マトリックス及び細胞-細胞間相互作用のインビボでの組み合わせで複合体を再現しません。
多細胞スフェロイドの使用は、より正確にin vivoでの細胞増殖1のコンパクトなアーキテクチャを再現最近のアプローチであります4。スフェロイドは、正常細胞の細胞-マトリックス相互作用を調査するために使用することができるだけでなく、転移性増殖または薬剤耐性4のように、腫瘍進行の特性をモデル化するために、腫瘍の類似体として作用することができます。
スフェロイドは、単一細胞クラスター（ 例えば 、懸滴、遠心分離法）6,7を形成するために、複数の細胞の凝集を促進することにより、より迅速マトリックス5内に埋め込まれた単一細胞の増殖により形成された、又はされてもよいです。既存の細胞凝集技術は、高価な材料や特殊な装置を必要とし得ます。加えて、これらのスフェロイドは、サイズ及び形態の広い範囲を有し、成長条件または困難な処置間の比較を行う、大量に製造することが困難であってもよいです。最後に、これらの方法によって生成されたスフェロイドは、タンパク質extracelから単離することは困難ですそれらは、他のアプリケーションで使用するために埋め込まれたlularマトリックス。
ここでは、市販のU底細胞撥プレートと不活性接着促進マトリックス、メチルセルロースを使用して、一貫サイズのスフェロイドの急速な形成のための堅牢かつ容易に修正細胞凝集方法を説明します。一旦形成されると、これらの多細胞スフェロイドを容易に広範囲の用途での使用のために単離されます。プロトコルはまた、容易に他の細胞プロセスを評価するために使用され得る細胞増殖を介してスフェロイドを生成するように適合されています。ここでは、これらの二つの異なる回転楕円体形成プロトコルのアプリケーション例として、免疫蛍光染色によって定量し、細胞浸潤アッセイ、およびアノイキスアッセイを示します。
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Protocol
注：すべての試薬および消耗品は、 物質一覧に記載されています。
細胞凝集により1スフェロイド生産
- メチルセルロース溶液：100ミリグラム/ mLのメチルセルロースの100ミリリットルを準備します。
- 熱50mLの超純H 2 Oに80℃です。 10 gでメチルセルロース粉末を追加し、粒子が均一に分散するまで攪拌します。
- 冷たい超純H 2 Oで最終体積に持参し、溶液が透明になるまで4℃で撹拌し、淡黄色、そして目に見える固形物が含まれていません。
- 未溶解の固体を除去し、0.45μmのフィルターを通過します。調製した溶液を等分し、最長12ヶ月間4℃で保存することができます。
注：メチルセルロースは、細胞 - 細胞接着を増強し、接着細胞単層の形成を阻止するために、非細胞毒性、不活性、懸濁剤として作用します。メチルセルロースは、水溶性であり、spher次洗い流すことができますOID世代。
- スフェロイド形成培地
注：使用直前にスフェロイド形成培地を準備します。保管しないでください。- 適切な培養培地中で1~5 mg / mlでのメチルセルロース溶液を希釈します。
- 殺菌および未溶解固形物を除去するために、0.22μmのフィルターを通過します。
- ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）
- 1倍、使用前に0.45μmのフィルターを通過するように希釈します。調製した溶液を、室温で無期限に保存してもよいです。
- 細胞スフェロイドの生成（図1）
注：事前に全ての試薬を準備します。ほこり、繊維または他の不溶性粒子による溶液の汚染を避けることが重要です。これらの汚染物質の存在が悪影響スフェロイドの形成に影響を与えます。培養培地および他のソリューションは、ときに、POSこれらの粒子を除去するために、0.45μmのフィルターを通過する必要がありますsible。これらは、追加の繊維を導入することができるようにソリューションを転送するときに綿ろ過ピペットの使用は避けてください。- 10％血清を補充した適切な培養培地中で70％コンフルエンスに培養細胞単層。吸引し培地と破片を除去するために、1×PBSですすいでください。 CO 2 10cmの細胞培養皿をトリプシン-EDTA（0.05％トリプシン）解離緩衝液3 mLを加え、37℃で細胞をインキュベートし、5％。
- 剥離を確認するために10倍の倍率で顕微鏡下で細胞を検査します。血清添加培地の7 mLで解離緩衝液を中和します。
- 10分にやさしくペレット細胞のための500×gで遠心し細胞懸濁液。
- 上清を取り除きます。フィルタチップをP1000ピペットを用いて1mLのスフェロイド形成培地中で再懸濁細胞ペレット。
注：細胞懸濁液は、凝集塊があってはなりません。- 、細胞ペレットを粉砕する一方で、わずかな角度でチューブの底部に対してピペットの先端を押してください細胞ペレットをせん断するためのピペッティング。これは、細胞に損傷を与えることができるよう5倍 - 以上3を粉砕しないでください。ピペットは、ゆっくりと泡を作成しないようにピペットチップの内容全体を追放しないでください。
- 血球計数器を用いて細胞を計数し、1×10 4細胞/ mLの細胞懸濁液を希釈します。
注：細胞数は、様々なサイズのスフェロイドを生成するために最適化することができます。損傷を受けた細胞のトリパンブルー染色で再懸濁した細胞の生存度を確認するために使用されてもよいです。 - 無菌、無塵マルチチャンネルピペットリザーバに細胞懸濁液を移し、96ウェルU底細胞撥プレートの各ウェルに100μLを分注するためにフィルターチップを使用します。
- ほこりや繊維を除去するために濾過し、超純H 2 Oで、リザーバをすすぎます。
- 容器の底に沈降から細胞を防ぐために、播種しながら、定期的に細胞懸濁液を混合します。混合およびdispensinながら、気泡の発生を防ぐために、リバースピペッティング技法を使用グラム。
- 組織培養インキュベーターに移しプレート（37℃、5％CO 2）およびスフェロイド形成のための毎日の検査。細胞は、6時間以内に各ウェルの底に沈殿し、一般的に24〜48時間（ 図2）内に回転楕円体に凝集する必要があります。
- 成功したスフェロイド形成の確認のため、P10チップを使用し、軽く10倍の倍率で顕微鏡下で観察しながら、回転楕円体の上に培地をピペット。適切に形成されたスフェロイドは、その3D構造を確認し、プレートおよびロールから緩めます。
注：メチルセルロースおよび血清濃度はウェル当たり単一のスフェロイドの形成をもたらすために、各細胞株について滴定によって決定されるべきです。選択された細胞株は、このように最適化された条件を表1に示し、 図2Bに形成された球状体の例。スフェロイドが示さ以上に長く成長させることができるが、それらは大きくなるように、彼らは次第に困難に成長します断片化せずに処理します。細胞は、単層、衛星スフェロイドを形成し、またはウェルの底に沈殿しない場合、メチルセルロースおよび血清の濃度は、さらに最適なスフェロイド形成（ 図3B）のために調整する必要があるかもしれません。このような繊維やゴミ（ 図3A）のような汚染物質を含むスフェロイドを使用しないでください。予め形成された球状体は、成長因子、生細胞染色、または分析のための阻害剤として関心のある化合物で治療することができます。
2.スフェロイド浸潤アッセイ（図4）
- 中和コラーゲン
- 4°Cにすべての液体を冷却し、不要な重合を防止するために、コラーゲンで作業する場合、氷上に保持します。
- NaOHおよび超純H 2 Oパスで新鮮0.1 MのHClの新鮮0.1 Mおよび0.01 Mソリューション0.22μmのフィルターを通してすべてのソリューションを準備します。
- ウシ1型コラーゲン（3.1ミリグラム/ mLのストック）を混ぜ、0.01 M NaOHおよび10×PBS（8：1：1体積比）と冷たい0.1 M NaOHおよびHClを用いてpHを7.4に調整します。コラーゲンの最終濃度は、2.5 mg / mlです。
- 2〜3ミリメートルの深さにイメージング容器を満たすのに十分な中和コラーゲンを準備します。 100μLの最小値は物質一覧に記載された8ウェル組織培養チャンバースライドの各ウェルに必要とされます。
- コラーゲン中のスフェロイドを埋め込む（図4）
- コートは、50μLの最小と8ウェル組織培養チャンバースライドの各ウェルの底部は、コラーゲンを中和しました。
- コラーゲン中の気泡生成することを避けるために、逆ピペット操作技術を使用してください。ウェル表面に均等にコラーゲンを広めるためにピペットチップを使用してください。
注：このコラーゲンベース層は、懸濁液中のスフェロイドを保持し、典型的には1〜2 mm厚であるだろう。ベース層は、上部コラーゲン層のメニスカスの形成を最小限に抑えます。ベース層が薄すぎる場合には、スフェロイドは、チャンバスライドの底部と接触することができると細胞単層を形成します。
- コラーゲン中の気泡生成することを避けるために、逆ピペット操作技術を使用してください。ウェル表面に均等にコラーゲンを広めるためにピペットチップを使用してください。
- チャンバースライドを配置し、そして10cmの組織培養皿中で超純粋H 2 Oを充填した35mmの組織培養皿、。コラーゲンは、典型的には1時間重合されるまで、37℃でインキュベートします。氷上で中和されたコラーゲンを、残りのストア。
注：水で満たされた35mm皿は、湿度を提供し、乾燥を防ぐことができます。チャンバースライドは、アッセイを通じて、この湿度室に残るべきです。コラーゲン基層一晩を重合しておいてもよいです。より長いインキュベーションは、典型的には、より硬質ゲルになります。 - p1,000フィルターチップを使用して、トップチューブをスナップ1.5 mL中に96ウェルU底細胞撥プレートから予め形成されたスフェロイド（ステップ1.4.7）を収集。ピペットは、スフェロイドの流体せん断を最小限にするために反復または積極的なピペッティングを避け、ゆっくりと。複数のスフェロイドは、8ウェル組織培養チャンバースライドの1ウェルに移送するための単一の管にプールしてもよいです。
- TABLで収集したスフェロイドを遠心2-5秒間2000×gでetopの微量とP200ピペットを用いて上清を除去します。これはスフェロイドがばらばらにまたは一緒に凝集する原因となり、必要以上に長いの遠心分離を避けてください。
注：上清のほとんどをオフにピペッティングした後、チューブを過剰の液体を吸い取るために清潔なペーパータオル上で慎重に逆にしてもよいです。スフェロイドを乾燥させないでください。 - ワイドボアP200チップを使用して、静かにコラーゲンを中和し、50μLでスフェロイドを懸濁します。任意のスフェロイドをチャンバースライドに移し、前に収集したスフェロイドの各チューブのためにこれを行います。チャンバースライドへの転送の準備ができるまで氷上で中和したコラーゲンに再懸濁されたスフェロイドを保管してください。
- インキュベーターからチャンバースライドを取り外し、慎重にコラーゲンベース層の上にスフェロイド - コラーゲン混合物をピペット。コラーゲンが重合されるまで、37℃でインキュベートし、5％CO 2。
- 泡を作成しないようにピペットの内容全体を分配しないでください。 Dropw伊勢のピペッティングは、コラーゲンベース層を乱す可能性を低減します。
- ゆっくりと100μLの最小値を追加チャンバースライドの各ウェルに所望の化学誘引物質、阻害剤、または他の治療を含む培養培地を温めました。液体があまりにも激しく上にピペットされている場合はスフェロイドを含むコラーゲン層が裂けることがあります。培地をゆっくりコラーゲンを乱さないために、ウェルの側面を下に分配することができます。
- 細胞浸潤を可能にするために37℃、5％CO 2で、チャンバースライドをインキュベートします。周囲のコラーゲンへの細胞浸潤は、明視野または蛍光画像化によって観察し落射蛍光、共焦点又は光学シート用顕微鏡を用いて様々な方法によって定量することができます。
- コートは、50μLの最小と8ウェル組織培養チャンバースライドの各ウェルの底部は、コラーゲンを中和しました。
侵略の3定量：明視野顕微鏡
- 設定時間間隔で、画像の明視野顕微鏡（ステップ2.2.8）を使用して10倍の倍率でスフェロイドをコラーゲン埋め込ま。
注：について長期生細胞の実験では、加熱された顕微鏡ステージ及びCO 2規制室37℃でスフェロイドを維持するために使用することができ、5％CO 2結像します。 - 周囲のコラーゲンと各時点で侵入平均距離への浸潤細胞の数を測定するために、そのようなImageJのようなソフトウェアを使用して侵襲性を定量化します。
侵攻の4定量化：ライブ細胞染色と蛍光顕微鏡
- ステップ2.2.8に続いて、このようなDAPI、カルセインAM、または製造元の指示に従って、細胞株に適切な他の細胞の追跡化合物などの蛍光染色でチャンバースライド中の培地を補います。
注：侵襲性の定量のために、回転楕円体全体に均一な染色が必須ではありません。汚れのより深い浸透を必要とするアプリケーションの場合、より長いインキュベーション（> 3時間）が必要になることがあります。 - 汚れを削除し、500μL暖かい1×PBSと交換してください。に過剰な汚れを除去するために10分間37℃でcubate。最低2回繰り返します。
- 蛍光顕微鏡を使用して、侵入スフェロイドを介して光セクションを獲得します。
注：レーザー光に長時間さらさは光毒性と光退色を制限するために繰り返し撮像中に最小化されるべきです。 - 回転楕円体の総面積を定量するために使用することができるZ投影を生成するためにそのようなImageJのようなソフトウェアを使用して、浸潤細胞、および距離の数は、コラーゲンマトリックスに侵入しました。
- 一例として、浸潤を定量化するためにのみ回転楕円体を強調し、細胞に侵入する、背景を除外するために、画像の閾値を調整し、その面積を測定します。元のスフェロイドの面積は侵襲性を定量化するために、この合計から減算することができます。
侵攻の5.定量：蛍光抗体法
注：使用はレモする前に、すべての溶液および緩衝液を0.45μmのフィルターを通過する必要があります負染色に影響を与えることができる破片を、VEの。
- PBS +洗浄バッファーを準備します。 1×PBSを準備および0.1mMの最終濃度までのCaCl 2およびMgCl 2を追加します。 CaCl 2およびMgCl 2が追加された後にバッファをオートクレーブしないでください。溶液を濾過滅菌し、室温で保存してもよいです。
- 中性緩衝ホルマリン（NBF）固定バッファを準備します。 0.6グラムのパラホルムアルデヒドに1MのNaOHの5滴を追加します。 PBS +で20 mLに持参し、パラホルムアルデヒドを（約1時間）に溶解するまで60℃でインキュベートします。室温まで冷却し、1M HClでpHを7.4に調整します。
注：NBF固定バッファは、使用直前に調製しなければなりません。 - ブロッキング緩衝液、ウシ血清アルブミン（BSA）を準備します。 w / vで3％PBS +にBSAを溶解させます。溶液を濾過滅菌し、数日間4℃で保存されたが、最良の新たに調製されてもよいです。加熱したりしないでください。
- 透過化バッファを準備します。トリトンX-100を希釈PBS +で0.2％v / vのに。
注：透過処理バッファーは、使用直前に調製しなければなりません。 - 必要に応じて、MOWIOLマウンティング培地を準備します。 2.4グラムのMOWIOL、6グラムのグリセロール、および6 mLの超純H 2 O混合は、室温でローテーターで3時間兼ね備えています。 12 mLの0.2 Mトリス-Cl（pHは8.5）を追加します。 10分間50℃で混合しながらインキュベートします。
- 不溶性物質をペレット化するために15分間、5000×gで遠心分離します。例えば2.5％DABCOとして、抗漂白剤を加えます。 -20℃で500μLの分量を保存します。
- スフェロイドの免疫蛍光染色（図5）
注：ゆっくりチャンバースライドから液体を追加または削除するには、ピペットを使用してください。これはコラーゲン層を破壊し得るよう、アスピレータの使用は避けてください。- スフェロイドを準備し、2にセクション1に記載されているように、コラーゲンで満たされたチャンバースライドに埋め込みます。
注：コラーゲンの自家蛍光は、薄層またはCの少量を使用することによって最小化することができますollagen。 - 各チャンバースライドから培地を可能な限り除去します。
- 簡単に言えば残留培地を除去するために、500μLのPBS +洗浄緩衝液でコラーゲン層をすすぎます。
- 各ウェルに500μLの新鮮なPBS +洗浄バッファーを追加し、スフェロイドを洗浄するために37℃で5分間インキュベートします。二回繰り返します。
- 500μLNBF固定緩衝液を用いてPBS +洗浄緩衝液を交換してください。 25分 - 20室温でインキュベートします。
- NBF固定バッファを削除し、500μLのPBS +洗浄緩衝液ですすいでください。新鮮なPBS +で5分間洗浄するには、最低3回洗浄緩衝液。
注：固定スフェロイドは、数日間、新鮮なPBS +洗浄緩衝液中で4℃で保存することができます。 0.01％アジ化ナトリウムは、貯蔵中の微生物の増殖を阻害するために洗浄緩衝液に添加してもよいです。 - 500μLの透過化緩衝液を用いてPBS +洗浄緩衝液を交換してください。 10〜15分間、室温でインキュベートします。
- 必要に応じて、BSAブロッキングバッファーを除去します。コラーゲン層からメスやハサミ、消費税スフェロイドと周辺の3ミリメートル×3ミリメートルの領域を使用します。ワイドボアP1000チップを使用して、新鮮なBSAブロッキングバッファーで軽くすすぐことによって、コラーゲンの切除されたブロックを取り除きます。 1.5 mLのチューブにコラーゲンブロックを転送します。
- 2分間2000×gで遠心分離し、上清を除去します。チューブは慎重に余分な液体を移送するように清潔なペーパータオルの上に反転させることができます。
- スフェロイドを準備し、2にセクション1に記載されているように、コラーゲンで満たされたチャンバースライドに埋め込みます。
- スフェロイドを一次抗体を加え、室温で1時間インキュベートします。全体のコラーゲン層が均等に沈められるように、一次抗体の十分な量を追加します。 （5.6.8.1-5.6.8.2）上記の任意の工程は、典型的には、抗体の小さいボリュームの使用を可能にします。
- 少なくとも10 mLのPBS +洗浄BUFと容器内のチャンバースライドを水没洗浄するために10分間のFER。最低2回繰り返します。
- オプション、スフェロイドは、コラーゲン層から切除した場合、以前に（ステップ5.6.8.1）、1 mLのPBS +の最小を追加1.5 mLチューブにバッファリングし、穏やかに攪拌洗浄。最低10分間浸すことを許可します。
- できるだけ多くのPBS +洗浄バッファーを削除し、最低2回洗浄緩衝液をPBS +で洗浄を繰り返します。コラーゲンブロックをペレット化するには、いくつかの分間2000×gで遠心分離します。
注：洗浄緩衝液中に浸漬する前に、70％エタノールで拭いてチャンバースライドの外面を清掃してください。
- 手順を繰り返し5.6.9-5.6.10適切な二次抗体を使用して。
注：スフェロイドは、撮像容器内で直接染色した場合は、5.6.13に進みます。 - オプション、スフェロイドを70％エタノールでコラーゲン層以前に（ステップ5.6.8.1）、きれいなガラススライドと共焦点顕微鏡と互換性のあるカバースリップから切除した場合。
- 超純H 2 O中のコラーゲンブロックを再懸濁からできるだけ多くの洗浄バッファを削除取り付ける直前にこの手順を実行します。水中に浸漬し染色されたブロックを放置しないでください。
- 細かい傾け鉗子を使用して、コラーゲンのブロックとスライドガラスへの転送のエッジをつかみます。
- 鉗子を使用すると、必ず直接コラーゲンに触れないようになって、コラーゲンのブロックから余分な液体を吸い上げるためにきれいな綿棒を使用し、場所中のコラーゲンを保持します。
注：コラーゲンは綿棒にこだわっなった場合、それは静かに鉗子を使用して、または水に浸漬することによってのいずれかを除去することができます。
- リバースピペッティング技法を使用して、サンプルの上にコラーゲンブロックと場所カバースリップ上に100μLMOWIOLマウンティング培地を分注します。
- カバーガラスの下から過剰MOWIOL封入剤と水を吸い上げるために綿棒またはペーパータオルを使用してください。
- MOWIOLマウンティング培地は4℃で一晩硬化することを許可しますマニキュアでカバースリップのC.シールは、エッジ。
- 等の目的のタンパク質の局在を観察する共焦点または蛍光顕微鏡を用いて画像染色スフェロイド、侵襲性構造の形成、（ 図5B、5C）。
注：染色したスフェロイドは、光退色を防止するために、光から保護されなければなりません。
6.アノイキスアッセイ
注：スフェロイド形成プロトコルは容易に種々の細胞型における足場非依存性増殖およびアノイキス耐性を定量化するように構成されています。
- アノイキスアッセイのために細胞を播種する（図6）
- 1.4節では回転楕円体の生産のための指示に従いますが、スフェロイド形成媒体を準備するために30ミリグラム/ mLのメチルセルロースの最小値を使用します。
注：温めたときに、30 mg / mlでメチルセルロースを懸濁液中の細胞を保持する厚いゲルを生成する必要があります。 - 週に数日間細胞をインキュベートし、中顕微鏡を用いて10倍の倍率で定期的にSPECT。アノイキスに抵抗する細胞が増殖し、コロニーを形成する必要があります。
- 各ウェル内に形成されたコロニーの数と大きさを測定することにより、アノイキスを定量化します。
注：コロニーが形成されると記載されているように、それらは、メチルセルロースを除去するために洗浄し、回転楕円体ベースのアッセイのために使用することができます。
- 1.4節では回転楕円体の生産のための指示に従いますが、スフェロイド形成媒体を準備するために30ミリグラム/ mLのメチルセルロースの最小値を使用します。
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Representative Results
我々は、細胞撥プレートとMCを補充したスフェロイド形成媒体を使用して個別のスフェロイドを生成するための柔軟で効率的な方法を説明します。 MCおよび血清の適切な条件の下では、個々の細胞が落ち着くとウェル底への最小限の遵守とスフェロイドを形成するために、ウェルの中央で一緒に接着します。このプロトコルを使用して、スフェロイドは、細胞株の様々な（ 図2B）から生成されました。 MCおよび血清濃度の滴定は、単一のスフェロイドの断片化することなく、操作を可能にするのに十分に頑強であるが形成される最適な条件を同定するために、各細胞株のために必要とされます。最適には、スフェロイドは、直径200〜500ミクロンの間であった、と最小限の細胞破片と緊密に付着細胞から成っていました。スフェロイドは、彼らが収集され、多種多様なアッセイで使用することができるように、損傷を与えることなく、穏やかな処理を生き延びました。
図3A）によって損なわれる可能性があります。取り扱う際に埃や他の繊維汚染の存在下では、弱くしか形成され集約された、複数または不規則な形状の細胞クラスター、得られたスフェロイドを簡単に離れて壊しました。スフェロイド形成は、スフェロイド形成培地（ 図3B）での次善のMCの濃度又は血清の影響を受けました。我々のテストでは、多くの細胞株はMCの、非存在下で、または低濃度で細胞撥プレートに付着することができた、そして細胞単層（ 図3B-II）で囲まれたスフェロイドの形成をもたらしました。次善MC条件におけるたBxPC-3細胞の増殖は、例として示されています。一般に、MCのより高い濃度は、十分に付着する細胞を防止するが、MCの高すぎる濃度は、細胞 - 細胞接着を低減し、そしてから細胞を防止します緩い凝集体と多数の衛星スフェロイド（ 図3B-i）の形成をもたらす、ウェルの底に沈降。血清の濃度は、細胞生存、および細胞 - 細胞および細胞 - プラスチックの接着に影響し、異なる細胞株について最適化する必要がありました。例えばHCT-116およびPANC-1などの細胞株について、高すぎる血清濃度は、過剰な細胞増殖と容易に処理することによってダメージを受け、またはウェルのプラスチックへの細胞接着を促進した特大のスフェロイドの製造及び単分子層の形成（もたらし図3B-III）。興味深いことに、不十分な血清の効果は、細胞株の間で異なっていました。 HCT-116細胞の生存が低下し、形成されたスフェロイドは、低血清中の死細胞の大部分を含む、小さかったました。対照的に、PANC-1細胞は、血清の非存在下で生存可能であったが、より接着性になり、複数の凝集体、ならびに細胞単層（ 図3B-IV、V）を形成しました。
個々の細胞は、より高濃度MCた（30mg / mL）中に懸濁しているに記載のスフェロイド形成プロトコルの変更は、アノイキス耐性をモニターするために使用することができます。クールながら、これらのMC濃度において、培地は、依然としてピペットで移すことができるが、37℃で固体ゲルに増粘。この培地に再懸濁しアノイキス耐性細胞は、懸濁液中に残存し、様々なサイズ（ 図6B）の懸濁スフェロイドを形成し、2~4週間にわたって増殖しました。足場依存性細胞は、これらの条件下でスフェロイドを形成しません。私たちは、麻痺をカウントすることによってアノイキス耐性を定量化することができましたスフェロイドのERは、各ウェル内に形成されました。
図1：3Dスフェロイド形成プロトコルの概要。単層培養で増殖させた細胞は、解離し、計数し、ペレット化し、メチルセルロース（MC）及び血清（I-IV）を補充したスフェロイド形成培地に再懸濁します。懸濁液は、所望の大きさ（V）のスフェロイドの形成を可能にするために所望の濃度でU底セル撥プレートに播種し、そしてプレートを、各ウェル（VI）において、単一の個別の細胞スフェロイドを生成するためにインキュベートします。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：最適化されたスフェロイドの形成条件。（A）SH-SY5Y細胞のための最適な条件の下でスフェロイド形成。 1,000個の細胞が5％血清および1mgを補充した培地中のU底細胞撥プレートに播種/ mLのMCは、24時間以内にコンパクトなスフェロイドに集約しました。 （B）を表1に示した最適条件の下で種々の細胞株によって形成されたスフェロイドの代表的な画像この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：最適以下の条件の下でスフェロイド形成。 （A）汚染物質の存在下で形成されたスフェロイド。微生物汚染は、細胞死とゆるく凝集した球状体を生じました。このような埃や繊維、これらの材料に付着した細胞のような不溶性の混入物の存在下で及びaggregなかったです食べました。次善のスフェロイド形成培地中で（B）スフェロイド形成。 II（過剰MCの存在下で播種したBxPC-3細胞を、（10mg / ml）を、多数の衛星スフェロイド（I）形成が不十分MCながら（0ミリグラム/ mL）をウェル底に接着し、単層を形成された細胞凝集体を生じ）。同様の結果が、他の試験した細胞株について観察された（図示せず）。過剰の血清（20％）（iii）の増加したHCT-116細胞の増殖及び単層形成をもたらしました。不十分な血清（0％）（v）のHCT-116（IV）における細胞死からPANC-1衛星スフェロイドの形成までの細胞株に特異的な効果を有していました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：スフェロイドを使用して浸潤アッセイ。 （A）Ovとスフェロイド浸潤アッセイのerview。撮像容器中和コラーゲンの層で予めコーティングしたコラーゲン（I-II）を重合することインキュベートします。予め形成された球状体を1.5 mLチューブに回収し、中和コラーゲン（III-VI）に再懸濁します。スフェロイド - コラーゲン混合物は、コラーゲンベース層の上に重層し、コラーゲン（VII-VIII）を重合することインキュベートします。所望の化合物を含有する増殖培地は、次いで重合スフェロイドコラーゲン層の上に重層し、細胞浸潤（IX-X）を可能にするようにインキュベートされます。化学誘引物質の存在下で、（B）は 、細胞は、示された時点で埋め込みPANC-1スフェロイドから周囲のコラーゲンマトリックスに侵入示します。各パネルは、10×対物レンズを用いて取得された位相コントラスト画像を示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：コラーゲン包埋スフェロイドの免疫蛍光染色。 （A）スフェロイドの免疫蛍光染色のためのプロトコルの概要。埋め込まれた球状体を直接画像化容器に、洗浄（NBF）固定し、（BSA）でブロックされます。スフェロイドは、1.5mlチューブとして、より小さい体積で直接染色し、または切除し、染色することができます。スフェロイドは、バックグラウンド蛍光を最小化するために、各染色以下の過剰緩衝液で洗浄する必要があります。ステンドスフェロイドは、容器内で直接画像化され、またはイメージングと保存のためのカバーガラスの下に装着することができます。 TPC-1細胞スフェロイドの（B）免疫蛍光画像は、コラーゲン中に包埋し、24時間浸潤させました。細胞を回転楕円体B内：ファロイジン染色細胞を示す（C）画像は、Bに示した領域の典型的な各パネルは、20μmのZ-投影（0.2μmのステップは）60Xの対物レンズを用いて取得示していますODY約20μmの表面から（1）、コラーゲン内に突出細胞（2）、およびコラーゲン（3）を介して浸潤細胞。スケールバー=25μmで。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6：スフェロイド形成アノイキスアッセイ。 （A）アノイキスアッセイのためのプロトコルの概要。細胞を、図1に記載のように調製されるが、懸濁液中の個々の細胞を保持し、細胞凝集（I-II）を防止するために厚い層を形成する30 mg / mlとMCの最小値を含むスフェロイド形成培地中に再懸濁します。細胞懸濁液をU底細胞撥プレートに播種し、（III-IV）でインキュベートします。懸濁された細胞は、アノイキス耐性を示し、増殖によってスフェロイド形成のために監視することができます。 （
| 細胞株 | MC（mg / mlで） | 血清（％） | おおよそのインキュベーション 時間 |
| SH-SY5Y | 1 | 5 | 24時間 |
| BxPC-3 | 5 | 5 | 3〜5日 |
| PANC-1 | 5 | 5 | 5〜7日 |
| HCT-116 | 3 | 10 | 2~4日 |
| TT | 1 | 10 | 7〜10日 |
| TPC-1 | 3 | 5 | 1から2日 |
表1：検証済み細胞株に最適なスフェロイド形成培地組成およびインキュベーション時間。
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Discussion
私たちは、安価で広く入手可能な試薬を用いたin vivo組織のアーキテクチャをモデル化するために、3Dスフェロイドを生産するための迅速かつ柔軟な方法を提示します。我々のプロトコルは、細胞凝集を媒介し、細胞単層の形成を最小限にするためにMC 8,9の非細胞毒性および接着促進特性を利用します。動物源から単離されたタンパク質ベースのマトリックスとは異なり、MCは、不活性でない成長因子を含まず、かつ容易に残差行列が存在しない様々な用途に使用するための球状の単離を可能にすること、洗浄することによって除去されます。私たちのプロトコルは、様々な実験条件下で成長させたスフェロイドの直接比較を可能にする、均一なサイズのスフェロイドを生成するために、一貫性のある細胞数の急速な凝集を使用しています。この方法は、（複数の腫瘍関連細胞型の固定数を組み合わせることにより、インビボ腫瘍増殖にモデル化するために混合培養に適合させることができますより正確に腫瘍環境を表すために、例えば、線維芽細胞、白血球、間質細胞）。
MCの高濃度で播種した細胞を用いて、我々のプロトコルの変形例は、懸濁液中で増殖することができる細胞の足場非依存性増殖をモニターするために行うことができ、そして細胞形質転換を同定または定量するアノイキスアッセイ（セクション6）として使用することができます。我々のプロトコルによって生成されたスフェロイドは、細胞増殖、代謝、生存、および処理条件との間の侵襲性の比較を可能にする、そのような薬物スクリーニングなどのアプリケーションに最適です。単離されたスフェロイド3次元微小環境における細胞浸潤性を評価し、定量化するために、コラーゲンなどの細胞外マトリックスにもを埋め込むことができる（2.2節、 図4）は、 インビボ腫瘍増殖のより正確なモデル。 さらに、我々のプロトコルは、Uを可能にするタンパク質またはRNA調製のためにMCマトリックスからスフェロイドを大量に単離することができますSERSは、治療又は成長条件に応じて、細胞シグナルまたは遺伝子発現の変化を評価します。
我々のスフェロイド形成プロトコルは、血清およびMC濃度の最適化を必要とし、細胞数は、各細胞株のために播種しました。このような細胞の生存、細胞 - 細胞および細胞 - プラスチックの接着性などの細胞株に特異的な特性は、有意にスフェロイドが形成される容易性に影響を与えることができます。一般的に、単層培養における悪い生存率を有する細胞株は、より高いMC濃度が高い接着細胞株のために好まれたが、球状体の形成を促進するために、より高い血清濃度が必要でした。したがって、我々は、単層および衛星スフェロイド形成（MC濃度）を最小化しながら、血清とMCの滴定は、細胞の生存（血清中濃度）の最適条件を決定するために実行することをお勧めします。これらの条件は衛星ずにウェルあたり単一の個別スフェロイドの生成をもたらすはずです。以下のための最適な回転楕円体の大きさ分析は、アプリケーションに依存し、播種した細胞や血清濃度（ステップ1.4.7）の数に影響されます。少数の細胞を播種すると、より簡単に均一に染色されているより小さな凝集体を生成するが、 生体内の細胞-細胞および細胞-微小環境の相互作用では再現できない場合があります。播種した細胞の数を増加させることは、細胞の挙動に影響を与え、成長または生存アッセイの解釈を変えることができる生理的に代表的な低酸素性コア10を含むことができるより大きいスフェロイドを生成します。しかし、多すぎると、スフェロイドは脆くすることができ、容易に単離の間離れて折れたり破損しています。大きいスフェロイドはまた、光学切片に特化したイメージングプラットフォーム（ 例えば光シート蛍光顕微鏡）を使用せずに、または埋め込むまたは回転楕円体11を介して凍結切片と断面の染色により可視化するはるかに困難です。私たちは、柔軟性のために200から500ミクロンの目標スフェロイドサイズをお勧めしますし、ほとんどのアプリケーションで取り扱いの容易さ。全体として、両方の細胞株特異的およびアプリケーション固有の方法でスフェロイド形成のための条件を最適化することが重要です。
スフェロイド生産プロトコルは、埃や他の粒子によってスフェロイドの汚染を避けるために、特に注意が必要です。細胞は、分析（ 図3A）での使用には適さない不規則な形状、緩く接着細胞の集合体で、その結果、埃や他の不溶性夾雑物に付着します。汚染源は、0.45μmのフィルターを通してすべてのソリューションを渡す前に解離（ステップ1.4.1）へのフィルタリング媒体と細胞単層をすすぎ、そして使用直前にフィルタリング超純水でマルチチャンネルピペットのリザーバをすすぐことによって最小限に抑えることができます （ステップ1.4.6.1）。また、ソリューションに繊維を当てることができ綿ろ過血清学的ピペットは、避けるべきです。重要ではないが、塵埃がさらにdissociatを通過させることによって低減することができます播種前に100μmのセルストレーナー（ステップ1.4.6）を介して細胞を編。媒体の蒸発損失は、特にそのようなスフェロイド形成（ 表1）またはアノイキスアッセイ（セクション6）中の特定の細胞株によって要求されるもののような1週間を超えるインキュベーション時間のために、さらなる技術的な考慮事項です。蒸発は、マルチウェルプレートの中心領域のウェル中の細胞を播種し、超純水でウェル周囲の充填、及び緩く板の縁部をシールするか、加湿チャンバー内でプレートを囲むことによって最小限に抑えることができます。
3Dスフェロイドは、正常および腫瘍細胞の挙動および生理学の両方の研究のための貴重なモデルです。我々のプロトコルは、アッセイおよびアプリケーションの類別に使用することができる一貫したサイズの3次元細胞スフェロイドを生成するための迅速かつ経済的な方法です。これらのスフェロイドは、貴重な腫瘍増殖および微小環境の相互作用の特徴づけのためのツールとしてだけでなく、広報のためのモデルを表します新しい治療法のeclinical評価。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffers | |||
| 10x Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| Calcium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 21114 | Used for PBS+ wash buffer; Do not autoclave PBS+ wash buffer upon addition of calcium chloride |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | M1028 | Used for PBS+ wash buffer; Do not autoclave PBS+ wash buffer upon addition of magnesium chloride |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Spheroid Formation | |||
| 96-well U-bottom Cell-Repellent Plate | Greiner Bio-One | 650970 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | D5546 | For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines |
| F12K Medium | Thermo Fisher Scientific | 2112722 | For culturing TT cell line |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | Filter prior to use to remove particulate contaminants |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M7027 | Prepare in water to 100 mg/mL |
| Roswell Park Memorial Institute Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | Dissociation buffer |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Invasion Assay | |||
| Bovine Type I Collagen | Corning Incorporated | 354231 | Stock 3.1 mg/mL; Maintain on ice when in use |
| DMEM Phenol Red Free Low Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11054-20 | Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium |
| Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-10 | Chemoattractant |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Immunofluorescence Microscopy | |||
| #1.5 Coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72225-01 | For mounting excised spheroids |
| Alexa-Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | Used to stain actin at 1:200 |
| Bovine Serum Albumin | Bioshop Canada Incorporated | ALB001 | Used in BSA blocking buffer |
| Dabco 33-LV | Sigma-Aldrich | 290734 | Antifade |
| Glycerol | Bioshop Canada Incorporated | GLY001 | Used in MOWIOL mounting medium |
| ImageJ Software | Freeware, NIH | - | Used for image analysis |
| Microslides | VWR International | 48312-024 | For mounting excised spheroids |
| MOWIOL 4-88 | EMD-Millipore | 475904 | Used in MOWIOL mounting medium |
| Paraformaldehyde | EMD-Millipore | PX0055-3 | Used in fixation buffer |
| Triton X-100 | Bioshop Canada Incorporated | TRX777 | Used in permeabilization buffer |
References
- Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. A. Two-dimensional vs. three-dimensional in vitro tumor migration and invasion assays. Methods Mol Biol. 986 (986), 227-252 (2013).
- Albini, A., Noonan, D. M. The 'chemoinvasion' assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).
- Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture. Methods Mol Biol. 695, 17-39 (2011).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. (51), (2011).
- Handschel, J. G., et al. Prospects of micromass culture technology in tissue engineering. Head Face Med. 3, 4 (2007).
- Stuckhoff, A. P., DelValle, L. Neuronal Cell Culture Methods and Protocols Vol. 1078 Methods in Molecular Biology. Amini, S., White, M. K. 1078, Humana Press. 119-132 (2013).
- Stewart, G. J., Wang, Y., Niewiarowski, S. Methylcellulose protects the ability of anchorage-dependent cells to adhere following isolation and holding in suspension. Biotechniques. 19 (4), 598-604 (1995).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biol. 10, 29 (2012).
- Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional. Anal. Biochem. 437 (1), 17-19 (2013).
