Abstract
Cultivo de células en monocapa no modela adecuadamente el comportamiento in vivo de los tejidos, que implica interacciones célula-célula y célula-matriz complejos. Tridimensionales técnicas de cultivo celular (3D) son una innovación reciente desarrollado para hacer frente a las deficiencias de cultivo de células adherentes. Aunque se han desarrollado varias técnicas para la generación de análogos de tejidos in vitro, estos métodos son frecuentemente complejos, caros de establecer, requieren un equipo especializado, y en general están limitados por la compatibilidad con sólo ciertos tipos de células. Aquí, se describe un protocolo rápido y flexible para la agregación de células en esferoides multicelulares 3D de tamaño consistente, que es compatible con el crecimiento de una variedad de líneas celulares tumorales y normales. Utilizamos concentraciones variables de suero y metilcelulosa (MC) para promover la generación esferoide independiente de anclaje y evitar la formación de monocapas de células de una manera altamente reproducible. Las condiciones óptimas para Indivlíneas celulares idual se pueden lograr mediante el ajuste de las concentraciones séricas de MC o en el medio de la formación de esferoides. Los esferoides 3D generados pueden ser recogidos para su uso en una amplia gama de aplicaciones, incluyendo la señalización celular o estudios de expresión génica, la detección de drogas candidato, o en el estudio de los procesos celulares, tales como la invasión de células tumorales y la migración. El protocolo también se adapta fácilmente para generar esferoides clonales de células individuales, y se puede adaptar para evaluar el crecimiento independiente de anclaje y anoikis resistencia. En general, el protocolo proporciona un método fácilmente modificable para la generación y utilización de esferoides de células en 3D con el fin de recapitular el microambiente 3D de los tejidos y modelar el crecimiento in vivo de las células normales y tumorales.
Introduction
Evaluación biológicamente relevantes del comportamiento de las células tumorales es un reto utilizando metodologías tradicionales de cultivo de células de dos dimensiones (2D), en parte debido a que estos no reflejan adecuadamente el microambiente celular encontrado in vivo. Los enfoques alternativos que incorporan componentes de la matriz extracelular en la cultura (por ejemplo, ensayos de cámara de Boyden) son fisiológicamente más representativa de las condiciones del tejido in vivo. Sin embargo, pueden estar limitados a la evaluación de comportamiento de la célula individual, y no recapitulan el complejo en combinaciones in vivo de célula-matriz y célula-célula interacciones que contribuyen a tejido o tumor de crecimiento 1, 2, 3.
El uso de esferoides multicelulares es un enfoque reciente que reproduce con mayor precisión la arquitectura compacta de crecimiento in vivo de células 1,4. Los esferoides se pueden utilizar para investigar las interacciones célula-matriz de las células normales, pero también pueden actuar como análogos tumorales para modelar características de la progresión del tumor, como el crecimiento metastásico o resistencia a los medicamentos 4.
Los esferoides pueden formarse por la proliferación de células individuales embebidos en una matriz de 5, o más rápidamente, mediante la promoción de la agregación de múltiples células para formar un clúster sola célula (por ejemplo, gota colgante, métodos de centrifugación) 6, 7. técnicas de agregación de células existentes pueden requerir materiales costosos o equipo especializado. Además, estos esferoides tienen una amplia gama de tamaños y morfologías y pueden ser difíciles de producir en grandes cantidades, haciendo las comparaciones entre las condiciones de crecimiento o tratamientos difíciles. Finalmente, esferoides generados por estos métodos pueden ser difíciles de aislar de la extracel proteináceolular matriz en la que están inmersos para su uso en otras aplicaciones.
A continuación, se describe un método de agregación celular robusto y fácilmente modificable para la rápida formación de esferoides de células de tamaño constantemente utilizando placas disponibles comercialmente de fondo en U de células repelente y una matriz inerte que promueve la adhesión, metil celulosa. Una vez formados, estos esferoides multicelulares son fácilmente aislados para su uso en una amplia gama de aplicaciones. El protocolo también se adapta fácilmente para generar esferoides a través de la proliferación celular, que puede utilizarse para evaluar otros procesos celulares. Aquí, se muestra ensayos de invasión celular, cuantificados mediante tinción de inmunofluorescencia, y un ensayo de anoikis, como ejemplo, las aplicaciones de estos dos protocolos diferentes de formación de esferoides.
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Protocol
NOTA: Todos los reactivos y consumibles se enumeran en la Lista de materiales.
1. Producción del esferoide por agregación de células
- Solución de metilcelulosa: Preparar 100 ml de 100 mg / ml de metilcelulosa.
- Calor 50 ml de H2O ultrapura a 80 ° C. Añadir 10 g de polvo de metilcelulosa y agitar hasta que las partículas se dispersan de manera uniforme.
- Llevar al volumen final con ultrapura fría H2O y se agita a 4 ° C hasta que la solución se vuelva clara, de color pajizo, y no contiene sólidos visibles.
- Pasar a través de un filtro de 0,45 micras para eliminar los sólidos no disueltos. solución preparada puede ser alícuotas y se almacenó a 4 ° C durante un máximo de 12 meses.
NOTA: celulosa de metilo sirve como un no citotóxico,, agente inerte de suspensión para mejorar la adhesión célula-célula y desalentar la formación de una monocapa de células adherentes. Metil celulosa es soluble en agua y se puede lavar siguiente sphergeneración de OID.
- Medio la formación de esferoides
NOTA: Preparar medio de la formación de esferoides inmediatamente antes de su uso. No almacene.- Diluir solución de celulosa de metilo a 1-5 mg / ml en el medio de cultivo apropiado.
- Pasar a través de un filtro de 0,22 micras para esterilizar y eliminar los sólidos no disueltos.
- Salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS)
- Diluir a 1X y pasar a través de un filtro de 0,45 micras antes de su uso. solución preparada puede almacenarse indefinidamente a temperatura ambiente.
- La producción de esferoides de células (Figura 1)
NOTA: Preparar todos los reactivos de antemano. Es importante evitar la contaminación de las soluciones por el polvo, fibras u otras partículas insolubles. La presencia de estos contaminantes afectará negativamente a la formación de esferoides. El medio de cultivo y otras soluciones se deben pasar a través de un filtro de 0,45 micras para eliminar estas partículas cuando possible. Evitar el uso de pipetas filtrada de algodón al transferir soluciones ya que estos pueden introducir fibras adicionales.- monocapas de células de cultivo a 70% de confluencia en el cultivo apropiado medio suplementado con 10% de suero. Aspirar el medio de cultivo y enjuague con 1x PBS para eliminar los residuos. Añadir 3 ml de tripsina-EDTA (0,05% de tripsina) tampón de disociación a una placa de cultivo celular de 10 cm, e incubar las células a 37 ° C y 5% de CO2.
- Inspeccionar las células bajo el microscopio a 10 aumentos confirmar desprendimiento. Neutralizar tampón de disociación con 7 ml de medio de cultivo suplementado con suero.
- suspensión de células Centrifugar a 500 xg durante 10 min a las células suavemente de pellets.
- Se retira el sobrenadante. sedimento celular Resuspender en 1 ml de medio de la formación de esferoides utilizando una pipeta p1000 con una punta de filtro.
NOTA: La suspensión celular debe estar libre de grumos.- Para triturar sedimento celular, presione la punta de la pipeta contra la parte inferior del tubo en un ligero ángulo mientraspipeteado para esquilar sedimento celular. Evitar trituración más de 3 - 5 veces ya que esto puede dañar las células. Pipeta lentamente y no expulsan a todo el contenido de la punta de la pipeta para evitar la creación de burbujas.
- Recuento de células utilizando un hemocitómetro y se diluye la suspensión de células a 1 x 10 4 células / ml.
NOTA: El número de células puede ser optimizado para generar esferoides de diferentes tamaños. Tinción con azul tripán de las células dañadas se puede usar para confirmar la viabilidad de las células resuspendidas. - suspensión celular traslado a un depósito multicanal pipeta estéril, libre de polvo y utilizar puntas con filtro para dispensar 100 l en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de células repelente de fondo en U.
- Depósito de enjuague con filtrada H2O ultrapura para eliminar el polvo y las fibras.
- Mezclar la suspensión de células periódicamente mientras la siembra para evitar que las células de depositarse en el fondo del depósito. Para evitar la creación de burbujas, utilice una técnica de pipeteado inverso mientras se mezcla y dispensingramo.
- Placas de transferencia a la incubadora de cultivo de tejidos (37 ° C y 5% de CO2) e inspeccionar todos los días para la formación de esferoides. Las células deben depositarse en el fondo de cada pocillo en las 6 h y, en general agregarse en un esferoide entre las 24-48 h (Figura 2).
- Para la confirmación de la formación de esferoides éxito, utilizar una punta de p10 y suavemente la pipeta medio sobre el esferoide mientras se observa bajo un microscopio a un aumento de 10X. Esferoides adecuadamente formados se afloje de la placa y rollo, lo que confirma su estructura 3D.
NOTA: metilcelulosa y las concentraciones séricas deben ser determinados por titulación para cada línea celular para producir la formación de un solo esferoide por pocillo. Condiciones optimizadas de esta manera para líneas celulares seleccionadas se muestran en la Tabla 1, y ejemplos de los esferoides formados en la Figura 2B. Esferoides pueden ser cultivadas durante más tiempo que el indicado pero a medida que se hacen más grandes que crecen progresivamente más difícilpara manejar sin fragmentación. Si las células forman una monocapa, esferoides satélite, o no se depositan en el fondo del pozo, puede ser necesario ajustar aún más para la formación óptima de esferoides (Figura 3B) la concentración de metilcelulosa y suero. No utilice esferoides que contienen contaminantes, tales como fibras o polvo (Figura 3A). esferoides preformada se pueden tratar con los compuestos de interés, tales como factores de crecimiento, las manchas de células vivas, o inhibidores para el análisis.
2. Esferoide Invasion de ensayo (Figura 4)
- colágeno neutralizado
- Enfriar todos los líquidos a 4 ° C y mantener en hielo cuando se trabaja con colágeno para evitar la polimerización no deseada.
- Preparar frescos 0,1 M y 0,01 M de NaOH y soluciones frescas HCl 0,1 M en H2O ultrapura Pasar todas las soluciones a través de filtros de 0,22 micras.
- Mezclar bovino tipo 1 colágeno (3,1 mg / ml de solución madre), M NaOH 0,01 y 10x PBS (8: 1: 1 relación en volumen) y ajustar el pH a 7,4 usando NaOH frío 0,1 M y HCl. La concentración final de colágeno es 2,5 mg / mL.
- Preparar suficiente colágeno neutralizado para llenar el recipiente de formación de imágenes a una profundidad de 2-3 mm. Se requiere un mínimo de 100 l de cada pocillo de la diapositiva cámara de cultivo de tejidos de 8 pocillos enumerados en la Lista de Materiales.
- Incorporación de esferoides en el colágeno (Figura 4)
- Cubrir el fondo de cada pocillo de un porta cámara de cultivo de tejidos de 8 pocillos con un mínimo de 50 l de colágeno neutralizado.
- Utilice la técnica de pipeteo inverso para evitar la creación de burbujas en el colágeno. Utilice la punta de la pipeta para difundir el colágeno de manera uniforme sobre la superficie del pocillo.
NOTA: Esta capa base de colágeno se mantenga esferoides en suspensión y es típicamente de 1-2 mm de espesor. La capa de base minimiza la formación de un menisco en la capa de colágeno superior. Si la capa de base es demasiado delgada, esferoides pueden hacer contacto con la parte inferior de la corredera de cámara yformar una monocapa de células.
- Utilice la técnica de pipeteo inverso para evitar la creación de burbujas en el colágeno. Utilice la punta de la pipeta para difundir el colágeno de manera uniforme sobre la superficie del pocillo.
- Colocar el portaobjetos de cámara, y una placa de cultivo de tejido de 35 mm llena de ultrapura H 2 O, en una placa de 10 cm de cultivo de tejidos. Incubar a 37 ° C hasta que se polimeriza el colágeno, típicamente 1 h. Almacenar el remanente neutralizada de colágeno en hielo.
NOTA: El plato lleno de agua 35 mm proporcionará la humedad y evitar que se seque. La cámara de diapositivas debe permanecer en esta cámara de humedad durante todo el ensayo. La capa de base de colágeno se puede dejar para polimerizar durante la noche. incubaciones más largas dan lugar típicamente a un gel más rígido. - El uso de un filtro de boquilla P1,000, recoger esferoides preformadas (paso 1.4.7) de la placa de células repelente de 96 pocillos de fondo en U en 1,5 ml complemento tubos superiores. Pipeta lentamente y evitar repetir o pipeteo vigoroso para reducir al mínimo los fluidos esquila de esferoides. Múltiples esferoides pueden ser agrupados en un único tubo para la transferencia a un pocillo de los 8 pocillos de cultivo de tejidos de diapositivas cámara.
- Centrifugar los esferoides recogidos en un tablETOP microcentrífuga a 2.000 xg durante 2-5 s y Aspirar el sobrenadante con una pipeta P200. Evitar centrifugación durante más tiempo de lo necesario, ya que esto puede causar que los esferoides se rompan o se agrupan juntos.
NOTA: Después de pipetear la mayor parte del sobrenadante, el tubo puede ser invertida con cuidado sobre una toalla de papel limpia para absorber el exceso de líquido. No permita que los esferoides se sequen. - Con una punta de taladro p200 amplia, resuspender suavemente esferoides en 50 l de colágeno neutralizado. Haga esto para cada tubo de esferoides recogidos antes de que los esferoides se transfieren a la cámara de diapositivas. Mantenga esferoides que han sido resuspendidas en el colágeno neutralizado en hielo hasta que esté listo para su transferencia a la cámara de diapositivas.
- Retire la diapositiva cámara de la incubadora y la pipeta con cuidado la mezcla esferoide-colágeno en la parte superior de la capa de base de colágeno. Incubar a 37 ° C y 5% de CO 2 hasta que se polimeriza colágeno.
- No inyectar todo el contenido de la pipeta para evitar la creación de burbujas. Dropwise pipeteo reduce las posibilidades de perturbar la capa de base de colágeno.
- Añadir lentamente un mínimo de 100 l calentado que contiene medio de cultivo quimioatrayentes deseados, inhibidores, u otros tratamientos a cada pocillo de la diapositiva cámara. Los esferoides que contienen capa de colágeno pueden romperse si el líquido se pipeta en ella con demasiada fuerza. El medio de cultivo se puede prescindir lentamente por el lado de un pozo para evitar perturbar el colágeno.
- Incubar diapositiva cámara a 37 ° C y 5% de CO 2 para permitir la invasión celular. invasión celular en el colágeno circundante puede ser observado por campo claro o fluorescencia de formación de imágenes y se cuantificó mediante una variedad de métodos que utilizan epifluorescencia, microscopía confocal o de lámina de luz.
- Cubrir el fondo de cada pocillo de un porta cámara de cultivo de tejidos de 8 pocillos con un mínimo de 50 l de colágeno neutralizado.
3. La cuantificación de la invasión: Microscopía de campo claro
- A intervalos de tiempo establecidos, la imagen esferoides colágeno-incrustado en un aumento de 10X utilizando un microscopio de campo claro (paso 2.2.8).
NOTA: Paraexperimentos de células en vivo a largo plazo, una platina de microscopio calentado y CO 2 cámara regulada se pueden utilizar para mantener esferoides a 37 ° C y CO 2 mientras que las imágenes 5%. - Cuantificar la invasividad utilizando software como ImageJ para medir el número de células invasoras en el colágeno circundante y la distancia media invadido en cada punto de tiempo.
4. Cuantificación de la invasión: microscopía de fluorescencia con manchas de células vivas
- Después de la etapa 2.2.8, complementar el medio en los portaobjetos de cámara con una mancha fluorescente tal como DAPI, calceína AM, u otro compuesto de seguimiento de celda apropiada para la línea celular según las instrucciones del fabricante.
NOTA: Para la cuantificación de invasividad, tinción homogénea en todo el esferoide no es esencial. Para aplicaciones que requieren una penetración más profunda de las manchas, las incubaciones más largas (> 3 h) puede ser necesario. - Quitar la mancha y reemplazar con 500 l de PBS 1x tibia. EnCubate a 37 ° C durante 10 min para eliminar el exceso de colorante. Repetir un mínimo de dos veces.
- El uso de un microscopio de fluorescencia, adquirir secciones ópticas a través de los esferoides invasores.
NOTA: La exposición prolongada a la luz láser debe reducirse al mínimo durante la exposición repetitiva a limitar la fototoxicidad y photobleaching. - Utilizar software como ImageJ para generar una Z-proyección, que puede ser utilizado para cuantificar el área total del esferoide, el número de células invasoras, y distancias invadieron en la matriz de colágeno.
- Como ejemplo, para cuantificar la invasión, ajustar el umbral de la imagen para excluir fondo, destacando sólo el esferoide y células invasoras, y medir su área. El área del esferoide original puede ser restado de este total para cuantificar la invasividad.
5. La cuantificación de la invasión: Inmunofluorescencia
NOTA: Todas las soluciones y tampones deben ser pasados a través de un filtro de 0,45 micras antes de su uso a remocinco restos, que puede afectar negativamente a la tinción.
- Preparar el tampón de lavado PBS +. Preparar 1x PBS y añadir CaCl 2 y MgCl 2 a una concentración final de 0,1 mM. No esterilizar en autoclave búfer después se añaden CaCl2 y MgCl2. Solución puede ser esterilizada por filtración y se almacena a temperatura ambiente.
- Prepare el buffer de la fijación en formalina tamponada neutra (NBF). Añadir 5 gotas de NaOH 1 M a 0,6 g de paraformaldehído. Llevar a 20 ml con PBS y se incuba a + 60 ° C hasta que se disuelve paraformaldehído (aproximadamente 1 h). Enfriar a temperatura ambiente y ajustar el pH a 7,4 con HCl 1 M.
NOTA: tampón de fijación NBF debe prepararse inmediatamente antes de su uso. - Preparar albúmina de suero bovino (BSA) tampón de bloqueo. Disolver BSA en PBS + a 3% w / v. Solución puede ser esterilizada por filtración y se almacenó a 4 ° C durante varios días, pero se prepara mejor fresco. No caliente.
- Preparar permeabilización buffer. Diluir Triton X-100a 0,2% v / v en PBS +.
NOTA: La permeabilización de amortiguación debe prepararse inmediatamente antes de su uso. - Opcionalmente, preparar el medio de montaje Mowiol. Combinar 2,4 g Mowiol, 6 g de glicerol, y 6 ml ultrapura H 2 O. mezclar durante 3 h en un rotador a temperatura ambiente. Añadir 12 ml de 0,2 M Tris-Cl (pH 8,5). Incubar con agitación a 50 ° C durante 10 min.
- Centrifugar a 5000 xg durante 15 min para sedimentar el material insoluble. Añadir agente anti-blanqueo, tales como DABCO 2,5%. Almacenar en 500 alícuotas a -20 ° C.
- La tinción de inmunofluorescencia de esferoides (Figura 5)
NOTA: Utilice una pipeta para añadir o eliminar líquidos lentamente a partir de diapositivas cámara. Evitar el uso de un aspirador, ya que esto puede alterar la capa de colágeno.- Preparar esferoides e incrustarlo en la cámara de diapositivas de colágeno llena, como se describe en las secciones 1 a 2.
NOTA: autofluorescencia El colágeno puede ser minimizado mediante el uso de capas finas o pequeños volúmenes de collagen. - Eliminar la mayor cantidad de medio de cultivo como sea posible de cada diapositiva cámara.
- Brevemente enjuague capa de colágeno con 500 l de tampón de lavado PBS + para eliminar medio residual.
- Añadir 500 l de PBS + tampón de lavado a cada pocillo y se incuba a 37 ° C durante 5 min para lavar esferoides. Repetir dos veces.
- Reemplazar + tampón de lavado PBS con 500 l de tampón de fijación NBF. Incubar a temperatura ambiente durante 20-25 min.
- Eliminar el tampón de fijación NBF y enjuague con 500 l de tampón de lavado PBS +. Lavar durante 5 minutos con PBS fresca + tampón de lavado de un mínimo de 3 veces.
NOTA: Se ha corregido esferoides se pueden almacenar a 4 ° C en tampón de lavado + PBS fresco durante varios días. 0,01% de azida de sodio puede ser añadido a la solución de lavado para inhibir el crecimiento microbiano durante el almacenamiento. - Reemplazar PBS + tampón de lavado con 500 l de tampón de permeabilización. Incubar a temperatura ambiente durante 10-15 min.
- Opcionalmente, eliminar el tampón de bloqueo BSA. El uso de bisturí o unas tijeras, esferoides especiales y el 3 mm alrededores x 3 mm de la capa de colágeno. Con una punta de taladro p1000 amplia, desalojar el bloque escindido del colágeno de un enjuague suavemente con tampón de bloqueo BSA fresco. Transferir el bloque de colágeno para tubo de 1,5 ml.
- Se centrifuga a 2.000 xg durante 2 minutos y retirar el sobrenadante. El tubo se puede invertir cuidadosamente sobre la toalla de papel limpia para absorber el exceso de líquido.
- Preparar esferoides e incrustarlo en la cámara de diapositivas de colágeno llena, como se describe en las secciones 1 a 2.
- Añadir anticuerpo primario a esferoides y se incuba a temperatura ambiente durante 1 h. Añadir un volumen suficiente de anticuerpo primario de tal manera que toda la capa de colágeno se sumerge de manera uniforme. Las etapas opcionales anteriores (5.6.8.1-5.6.8.2) típicamente permiten el uso de volúmenes más pequeños de anticuerpo.
- Sumergir cámara de diapositivas en un recipiente con al menos 10 ml de PBS + buf de lavadofer durante 10 min para lavar. Repetir un mínimo de dos veces.
- Opcional, en caso esferoides fueron extirpados de capa de colágeno anteriormente (Paso 5.6.8.1), añadir un mínimo de 1 ml de PBS + tampón de lavado al tubo de 1,5 ml y agitar suavemente. Dejar en remojo durante un mínimo de 10 min.
- Eliminar la mayor cantidad + tampón de lavado PBS como sea posible y repetir el lavado con PBS + tampón de lavado un mínimo de dos veces. Se centrifuga a 2.000 g durante varios minutos para sedimentar bloque de colágeno.
NOTA: Limpiar las superficies exteriores de la diapositiva cámara de limpieza con etanol al 70% antes de sumergirse en tampón de lavado.
- Repita los pasos 5.6.9-5.6.10 utilizando anticuerpo secundario apropiado.
NOTA: Si esferoides se tiñeron directamente en el recipiente de formación de imágenes, vaya al paso 5.6.13. - Opcional, en caso esferoides fueron extirpados de capa de colágeno anteriormente (paso 5.6.8.1), portaobjetos de vidrio limpio y compatible con cubreobjetos de microscopía confocal con un 70% de etanol.
- Eliminar la mayor cantidad de tampón de lavado como sea posible desde el bloque de colágeno y resuspender en ultrapura H 2 O. Realizar este paso inmediatamente antes del montaje. No deje bloques manchados remojo en agua.
- El uso de pinzas de punta fina, agarre borde de bloque de colágeno y traslado al portaobjetos de vidrio.
- Usando los fórceps para sostener el colágeno en el lugar, utilizar un hisopo de algodón limpio para absorber el exceso de líquido desde el bloque de colágeno, asegurándose de no tocar el colágeno directamente.
NOTA: Si el colágeno se atasca al hisopo de algodón que se puede quitar con cuidado, ya sea usando fórceps, o sumergiendo en agua.
- Utilizando una técnica de pipeteo inverso, dispensar 100 l medio de montaje Mowiol sobre el bloque de colágeno y lugar cubreobjetos sobre la muestra.
- Use un hisopo de algodón o toalla de papel para absorber el exceso de medio de montaje Mowiol® y agua de debajo del cubreobjetos.
- Permitir medio de montaje Mowiol para endurecer durante la noche a 4 °C. Sello bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas.
- Image esferoides teñidas utilizando confocal o microscopía de fluorescencia para observar la localización de proteínas de interés, la formación de estructuras invasoras, etc. (figuras 5B, 5C).
NOTA: manchado esferoides deben ser protegidos de la luz para evitar photobleaching.
6. Ensayo Anoikis
NOTA: El protocolo de formación de esferoides se adapta fácilmente para cuantificar el crecimiento independiente de anclaje y resistencia anoikis en una variedad de tipos de células.
- Siembra de las células para el ensayo de anoikis (Figura 6)
- Siga las instrucciones para la producción de esferoides en la sección 1.4 pero el uso de un mínimo de 30 mg / ml de metilcelulosa para preparar el medio la formación de esferoides.
NOTA: cuando se calienta, 30 mg / ml de metilcelulosa debe producir un gel espeso que mantiene las células en suspensión. - Se incuban las células durante varios días a semanas y enSPECT con regularidad en un aumento de 10X usando un microscopio. Las células que resisten la anoikis deben proliferar y formar colonias.
- Cuantificar anoikis midiendo el número y tamaño de las colonias formadas en cada pocillo.
NOTA: Una vez que se forman colonias, pueden ser lavadas para eliminar la metil celulosa y se usan para ensayos basados en esferoides, como se describe.
- Siga las instrucciones para la producción de esferoides en la sección 1.4 pero el uso de un mínimo de 30 mg / ml de metilcelulosa para preparar el medio la formación de esferoides.
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Representative Results
Se describe un método flexible y eficiente para generar esferoides discretos utilizando placas de células repelentes y medios de formación de esferoides suplementado con MC. Bajo las condiciones apropiadas de MC y el suero, las células individuales se depositan y se adhieren juntos en el centro del pozo para formar esferoides con adhesión mínima a la parte inferior también. Usando este protocolo, esferoides se generan a partir de una variedad de líneas de células (Figura 2B). Se requiere Titulación de MC y las concentraciones de suero para cada línea celular para identificar las condiciones óptimas que se forma sólo una única esferoide que es lo suficientemente robusto para permitir la manipulación sin fragmentar. De manera óptima, los esferoides fueron de entre 200 a 500 micras de diámetro, y consistieron en células estrechamente adherentes con restos de células mínima. Esferoides sobrevivieron manipulación suave y sin daños, lo que les permite ser recogida y usada en una amplia variedad de ensayos.
(Figura 3A), lo que resultó en los agregados de células muertas. En la presencia de polvo u otra contaminación de la fibra, múltiple o grupos de células de forma irregular que fueron sólo débilmente agregados formados, y los esferoides resultantes fácilmente rompió aparte cuando se manipula. La formación de esferoides también se vio afectada por concentraciones subóptimas de MC o suero en el medio la formación de esferoides (figura 3B). En nuestras pruebas, muchas líneas de células eran capaces de adherirse a las placas de células repelentes en ausencia, o en bajas concentraciones, de MC, y dieron como resultado la formación de un esferoide rodeado por una monocapa de células (Figura 3B-ii). el crecimiento de células BxPC-3 en condiciones subóptimas MC se muestra como un ejemplo. En general, las concentraciones más altas de MC impidieron las células se adhieran a la bien, pero una concentración demasiado alta de MC reducen la adhesión célula-célula, y las células impedidode depositarse en el fondo del pozo, lo que resulta en la formación de agregados sueltos y numerosos esferoides satélite (Figura 3B-i). La concentración de suero también afectó a la supervivencia celular, y célula-célula, y la adhesión de células de plástico y necesitaba ser optimizado para diferentes líneas celulares. Para las líneas de células tales como HCT-116 y PANC-1, una concentración demasiado alta de suero dio como resultado la proliferación celular excesiva y la producción de esferoides de gran tamaño que se dañan fácilmente por manipulación, o promueven la adhesión celular al plástico bien y la formación de una monocapa ( Figura 3B-iii). Curiosamente, los efectos de suero insuficiente diferían entre las líneas celulares. supervivencia de las células HCT-116 se redujo y los esferoides formados eran pequeñas, que contiene una gran proporción de células muertas en el suero baja. En contraste, las células PANC-1 eran viables en ausencia de suero, pero se hicieron más adherente, y forman múltiples agregados, así como una monocapa de células (Figura 3B-iv, v).
Una modificación del protocolo de formación de esferoides se describe, en la que las células individuales se suspendieron en una concentración más alta MC (30 mg / ml) se pueden utilizar para vigilar la resistencia a la anoikis. A estas concentraciones MC, medio todavía se puede transferir mediante una pipeta mientras fresco, pero se espesó en un gel sólido a 37 ° C. Células anoikis resistentes resuspendidas en este medio se mantuvo en suspensión y proliferaron durante un período de 2-4 semanas, la formación de esferoides en suspensión de diferentes tamaños (Figura 6B). células dependientes de anclaje no forman esferoides en estas condiciones. Hemos sido capaces de cuantificar la anoikis resistencia contando el entumecidaer de esferoides formado en cada pocillo.
Figura 1: Visión general de Protocolo de Formación 3D esferoide. Las células cultivadas en cultivo en monocapa se disocian, se contaron, se sedimentaron, y se resuspendieron en medio de la formación de esferoides suplementado con metilcelulosa (MC) y el suero (i-iv). La suspensión se sembró en una placa de células repelente de fondo en U en densidad deseada para permitir la formación de esferoides del tamaño deseado (v), y se incuba la placa para producir una sola, de esferoides de células discretas en cada pocillo (vi). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Optimizado Condiciones formación de esferoides.(A) la formación de esferoides en condiciones óptimas para las células SH-SY5Y. 1.000 células sembradas en placas de células repelente de fondo en U en medio suplementado con 5% de suero y 1 mg / mL MC agregan en esferoides compactos dentro de 24 h. (B) Imágenes representativas de esferoides formados por varias líneas celulares en condiciones óptimas que se muestran en la Tabla 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: la formación de esferoides Bajo condiciones subóptimas. Esferoides (A) formadas en la presencia de contaminantes. La contaminación microbiana resultó en la muerte celular y esferoides sin apretar agregados. En presencia de contaminantes insolubles, como el polvo o fibras, células adheridas a estos materiales y no AGGREGcomió. (B) la formación de esferoides en medio de la formación de esferoides subóptima. BxPC-3 células sembradas en presencia de exceso de MC (10 mg / ml) forman numerosos esferoides satélite (i), mientras que insuficiente MC (0 mg / ml) dieron lugar a agregados de células que se adhirieron al fondo del pozo y forman una monocapa (ii ). Se observaron resultados similares para otras líneas celulares ensayadas (no mostrados). El exceso de suero (20%) produjo un aumento de la formación de la proliferación celular y monocapa HCT-116 (iii). suero insuficiente (0%) tuvo efectos específicos de la línea de células que van de la muerte celular en HCT-116 (iv) para la formación de esferoides de satélite en PANC-1 (v). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La invasión de ensayo usando esferoides. (A) Overview de ensayo de invasión esferoide. El recipiente de formación de imágenes se pre-revestido con una capa de colágeno neutralizada y se incuba para polimerizar el colágeno (i-ii). esferoides pre-formado se recogen en tubos de 1,5 mL y se resuspendieron en colágeno neutralizado (III-VI). La mezcla esferoide-colágeno se superpone sobre la base de la capa de colágeno y se incuba para polimerizar el colágeno (vii-viii). El medio de crecimiento que contiene compuestos deseados se superpone entonces sobre la capa de esferoide-colágeno polimerizado y se incuba para permitir la invasión de células (ix-x). (B) En presencia de un quimioatrayente, se muestran las células invasoras en la matriz de colágeno que rodea de un incrustado PANC-1 esferoide en los puntos de tiempo indicados. Cada panel muestra una imagen de contraste de fase adquiridos utilizando un objetivo 10X. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: La tinción de inmunofluorescencia de esferoides empotrados-colágeno. (A) Descripción general del protocolo para la tinción de inmunofluorescencia de esferoides. esferoides empotrados se lavan, se fijan (MNB), y se bloquearon (BSA) directamente en el recipiente de formación de imágenes. Los esferoides se pueden teñir directamente, o escindieron y se tiñeron en un volumen más pequeño, tal como un tubo de 1,5 ml. Esferoides se deben lavar con el tampón en exceso después de cada mancha para minimizar la fluorescencia de fondo. esferoides manchados se pueden obtener imágenes directamente en el recipiente o montado bajo un cubreobjetos para la imagen y el almacenamiento. Imágenes (B) de inmunofluorescencia de un esferoide de células TPC-1 integrado en el colágeno y se deja invadir por 24 h. (C) Las imágenes que muestran las células teñidas con faloidina típica de las regiones indicadas en B. Cada panel muestra la proyección Z-20 micras (0,2 micras pasos) adquirió utilizando un objetivo 60X: Las células dentro del esferoide body aproximadamente 20 micras de la superficie (1), las células que sobresalen en colágeno (2), y las células que invaden a través de colágeno (3). Barras de escala = 25 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Ensayo de formación de esferoides Anoikis. (A) Descripción general del protocolo para el ensayo de anoikis. Las células se prepararon como se describe en la Figura 1, pero se vuelven a suspender en un medio de formación de esferoides que contiene un mínimo de 30 mg / mL MC que forma una capa de espesor para mantener las células individuales en suspensión y evitar la agregación de células (i-ii). La suspensión de células se sembraron en placas de células repelente de fondo en U y se incubaron (III-IV). Las células suspendidas se pueden monitorizar para la formación de esferoides de proliferación, lo que indica resistencia a la anoikis. (
| Línea celular | MC (mg / mL) | Serum (%) | de incubación aproximado hora |
| SH-SY5Y | 1 | 5 | 24 horas |
| BxPC-3 | 5 | 5 | 3 a 5 días |
| PANC-1 | 5 | 5 | 5 a 7 días |
| HCT-116 | 3 | 10 | 2 a 4 días |
| TT | 1 | 10 | 7 a 10 días |
| TPC-1 | 3 | 5 | 1 a 2 días |
Tabla 1: Optimal formación de esferoides de la composición del medio y de incubación Times por líneas celulares validados.
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Discussion
Presentamos un método rápido y flexible para la producción de esferoides de células 3D para modelar la arquitectura de los tejidos in vivo usando reactivos baratos y ampliamente disponibles. Nuestro protocolo explota las propiedades no citotóxicas y promotores de la adhesión de MC 8, 9 para mediar en la agregación de células y minimizar la formación de monocapa celular. A diferencia de matrices a base de proteínas aisladas a partir de fuentes animales, MC es inerte, no contiene factores de crecimiento, y se elimina fácilmente por lavado, lo que permite el aislamiento de esferoides para su uso en una variedad de aplicaciones sin la presencia de la matriz residual. Nuestro protocolo utiliza una agregación rápida del número de células consistentes para generar esferoides homogénea de tamaño, lo que permite comparaciones directas de esferoides cultivadas bajo diferentes condiciones experimentales. Este método puede ser adaptado para cultivos mixtos de modelar en el crecimiento tumoral in vivo mediante la combinación de números fijos de múltiples tipos de células asociados a tumores (por ejemplo, fibroblastos, leucocitos, células estromales) para representar con mayor precisión el ambiente del tumor.
Las modificaciones de nuestras células de protocolo usando sembradas en altas concentraciones de MC se pueden hacer para controlar el crecimiento independiente de anclaje de células capaces de proliferar en suspensión, y pueden emplearse como un ensayo anoikis (Sección 6) para identificar o cuantificar la transformación celular. Esferoides generados por nuestro protocolo son ideales para aplicaciones tales como la detección de drogas, lo que permite la comparación del crecimiento celular, el metabolismo, la supervivencia, y la invasividad entre las condiciones de tratamiento. Esferoides aisladas también pueden estar incrustadas en una matriz extracelular, tal como colágeno, para evaluar y cuantificar la invasividad celular en una 3D-microambiente (Sección 2.2, Figura 4) que los modelos más exactamente en el crecimiento tumoral in vivo. Además, nuestro protocolo se puede utilizar para aislar grandes cantidades de esferoides de la matriz de MC para la proteína o preparación de ARN, lo que permite uSers para evaluar cambios en la señal celular o la expresión de genes en respuesta a las condiciones de tratamiento o de crecimiento.
Nuestro protocolo de formación de esferoides requiere la optimización de suero y las concentraciones de MC, y el número de células sembradas para cada línea celular. características de las células de línea-específicas, tales como la viabilidad celular, célula-célula y la adhesividad de las células de plástico, pueden afectar significativamente a la facilidad con que se forman esferoides. En general, las líneas celulares con escasa viabilidad en cultivo en monocapa requieren mayores concentraciones séricas de promover la formación de esferoides, mientras más altas concentraciones de CM fueron los preferidos para las líneas celulares altamente adhesivas. Por lo tanto, se recomienda que las titulaciones de suero y MC realizar para determinar las condiciones óptimas para la supervivencia celular (concentración sérica), al tiempo que minimiza la formación de esferoides monocapa y por satélite (concentración MC). Estas condiciones deben resultar en la generación de un solo esferoide discreta por pocillo sin satélites. tamaño óptimo para esferoideanálisis es dependiente de la aplicación y se ve afectada por el número de células sembradas y concentración en suero (Paso 1.4.7). Siembra de las células produce un menor número de agregados más pequeños que son más fácilmente teñidas homogéneamente, pero no podrá reproducir in vivo célula-célula y las interacciones célula-microambiente. Aumentar el número de células sembradas genera esferoides más grandes, que pueden contener un núcleo hipóxico fisiológicamente representante 10 que puede afectar el comportamiento de células y alterar la interpretación de los ensayos de crecimiento o supervivencia. Sin embargo, cuando es demasiado grande, los esferoides pueden ser frágiles y se rompen con facilidad aparte o dañado durante el aislamiento. Esferoides más grandes también son mucho más difíciles de visualizar sin las plataformas de imágenes especializados para seccionamiento óptico (por ejemplo, lámina de microscopio de fluorescencia de luz) o mediante la incorporación o cryosectioning y tinción de las secciones transversales a través del esferoide 11. Se recomienda un tamaño de esferoides blanco de 200-500 micras de flexibilidad yfacilidad de manejo para la mayoría de aplicaciones. En general, es crítica para optimizar las condiciones para la formación de esferoides de una manera tanto específica línea celular y específica de la aplicación.
protocolos de producción de esferoides requieren especial atención para evitar la contaminación de esferoides por el polvo y otras partículas. Las células se adhieren al polvo y otros contaminantes insolubles, dando como resultado de forma irregular, sin apretar de células adherentes agregados inadecuado para su uso en los análisis (Figura 3A). Las fuentes de contaminación pueden reducirse al mínimo mediante el paso de todas las soluciones a través de un filtro de 0,45 micras, enjuagar la monocapa de células con medio de filtrado antes de la disociación (Paso 1.4.1), y aclarado depósitos pipeta multicanal con agua ultrapura se filtró inmediatamente antes del uso (Paso 1.4.6.1). Además, pipetas serológicas filtrada de algodón, que pueden arrojar fibras en soluciones, deben ser evitados. Aunque no es crítico, el polvo puede reducirse aún más mediante el paso dissociated células a través de un filtro de células de 100 micras antes de la siembra (Paso 1.4.6). La pérdida por evaporación de medio es una consideración técnica adicional, particularmente para tiempos de incubación superiores a 1 semana, tales como los requeridos por ciertas líneas de células para la formación de esferoides (Tabla 1) o durante ensayos de anoikis (Sección 6). La evaporación puede ser minimizado mediante la siembra de células en los pozos de la región centro de las placas de múltiples pocillos, llenando perímetro pozos con agua ultrapura, y sin apretar el sellado de los bordes de la placa o revestimiento de la placa en una cámara humidificada.
esferoides de células 3D son un modelo valioso para el estudio de tanto el comportamiento normal de las células y el tumor y la fisiología. El protocolo es un método rápido y económico para la generación de esferoides de células 3D constantemente de tamaño que se pueden utilizar en una variedad de ensayos y aplicaciones. Estos esferoides representan valiosas herramientas para la caracterización del crecimiento del tumor y el microambiente interacciones, así como modelos para prEvaluación eClinical de nuevas terapias.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffers | |||
| 10x Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| Calcium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 21114 | Used for PBS+ wash buffer; Do not autoclave PBS+ wash buffer upon addition of calcium chloride |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | M1028 | Used for PBS+ wash buffer; Do not autoclave PBS+ wash buffer upon addition of magnesium chloride |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Spheroid Formation | |||
| 96-well U-bottom Cell-Repellent Plate | Greiner Bio-One | 650970 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | D5546 | For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines |
| F12K Medium | Thermo Fisher Scientific | 2112722 | For culturing TT cell line |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | Filter prior to use to remove particulate contaminants |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M7027 | Prepare in water to 100 mg/mL |
| Roswell Park Memorial Institute Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | Dissociation buffer |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Invasion Assay | |||
| Bovine Type I Collagen | Corning Incorporated | 354231 | Stock 3.1 mg/mL; Maintain on ice when in use |
| DMEM Phenol Red Free Low Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11054-20 | Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium |
| Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-10 | Chemoattractant |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Immunofluorescence Microscopy | |||
| #1.5 Coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72225-01 | For mounting excised spheroids |
| Alexa-Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | Used to stain actin at 1:200 |
| Bovine Serum Albumin | Bioshop Canada Incorporated | ALB001 | Used in BSA blocking buffer |
| Dabco 33-LV | Sigma-Aldrich | 290734 | Antifade |
| Glycerol | Bioshop Canada Incorporated | GLY001 | Used in MOWIOL mounting medium |
| ImageJ Software | Freeware, NIH | - | Used for image analysis |
| Microslides | VWR International | 48312-024 | For mounting excised spheroids |
| MOWIOL 4-88 | EMD-Millipore | 475904 | Used in MOWIOL mounting medium |
| Paraformaldehyde | EMD-Millipore | PX0055-3 | Used in fixation buffer |
| Triton X-100 | Bioshop Canada Incorporated | TRX777 | Used in permeabilization buffer |
References
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- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).
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- Stewart, G. J., Wang, Y., Niewiarowski, S. Methylcellulose protects the ability of anchorage-dependent cells to adhere following isolation and holding in suspension. Biotechniques. 19 (4), 598-604 (1995).
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