Abstract
Однослойная культура клеток не адекватно моделировать поведение в естественных условиях тканей, который включает в себя сложные межклеточные и клетка-матрица взаимодействий. Трехмерные технологии (3D) культивирования клеток являются недавнее нововведение разработано для устранения недостатков культуры прикрепленных клеток. В то время как несколько способов генерации аналогов ткани в пробирке, были разработаны, эти методы часто сложны, дороги , чтобы установить, требуют специализированного оборудования, и , как правило , ограничены совместимостью только с определенными типами клеток. Здесь мы описываем быстрый и гибкий протокол для агрегацию клеток в многоклеточных 3D сфероидов одинакового размера, который совместим с ростом различных опухолевых и нормальных клеточных линий. Мы используем различные концентрации в сыворотке крови и метилцеллюлозы (MC), чтобы способствовать анкерное-независимого сфероид поколения и предотвратить образование монослоев клеток в высоко воспроизводимым образом. Оптимальные условия для Individual клеточные линии могут быть достигнуты путем регулировки MC или сывороточные концентрации в сфероида пластового среде. 3D-сфероиды, сгенерированные могут быть собраны для использования в широком диапазоне применений, в том числе клеточных сигналов или исследований экспрессии генов кандидата скрининга лекарственных средств, или в изучении клеточных процессов, таких как инвазии опухолевых клеток и миграции. Протокол также легко адаптировать для создания клоновых сфероидов из одиночных клеток, и могут быть адаптированы для оценки анкерное-независимый рост и anoikis резистентность. В целом, наш протокол обеспечивает легко изменяемый способ генерирования и использования 3D сфероиды клеток для того , чтобы Повторим 3D микроокружение тканей и смоделировать рост в естественных условиях нормальных и опухолевых клеток.
Introduction
Биологически соответствующая оценка поведения опухолевых клеток является сложной задачей с использованием традиционных двумерных (2D) методологии клеточной культуры, отчасти потому , что они не могут адекватно отразить микросреды клеток нашли в естественных условиях. Альтернативные подходы , включающие компоненты внеклеточного матрикса в культуре (например, Бойденом камерные анализах) являются более физиологически представитель естественных условиях окружающей среды ткани в. Тем не менее, они могут быть ограничены оценкой индивидуального поведения клеток, и не резюмировать комплекса в комбинации прижизненного клеточного матрикса и межклеточных взаимодействий , которые способствуют росту ткани или опухоли 1, 2, 3.
Использование многоклеточных сфероидов является недавний подход , который более точно воспроизводит компактную архитектуру роста в естественных условиях клетки 1,4. Сфероидов может быть использован для исследования клетка-матрица взаимодействия нормальных клеток, но могут также выступать в качестве аналогов опухолевые для моделирования характеристик прогрессии опухоли, такие как рост метастазов или резистентности к лекарственным препаратам 4.
Сфероиды могут быть образованы путем пролиферации отдельных клеток , внедренных в матрицу 5, или более быстро, способствуя агрегации нескольких ячеек , чтобы сформировать один кластер клеток (например, висячей капли, методы центрифугирования) 6, 7. Существующие методы агрегации клеток может потребовать дорогостоящих материалов или специализированного оборудования. Кроме того, эти сфероиды имеют широкий диапазон размеров и морфологией и может быть трудно производить в больших количествах, что делает сравнения между условиями роста или лечения сложных. И, наконец, сфероиды, генерируемые этими способами может быть трудно отделить от белковый extracellular матрица, в которой они включены для использования в других приложениях.
Здесь мы описываем надежную и легко изменяемый методологии агрегации клеток для быстрого формирования последовательно размерных сфероидов клеток с использованием коммерчески доступного U-дно электролизера водоотталкивающий пластины и инертную адгезионный матрицу, метилцеллюлоза. После образования эти многоклеточные сфероиды легко выделены для использования в широком диапазоне применений. Протокол также легко адаптировать для создания сфероидов посредством пролиферации клеток, которые могут быть использованы для оценки других клеточных процессов. Здесь мы покажем вторжение клеток анализы, количественно с помощью иммунофлуоресценции окрашивания, а также анализ anoikis, в качестве примера применения этих двух различных протоколов формирования сфероида.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Все реагенты и расходные материалы перечислены в списке материалов.
1. Сфероид производства по Cell Aggregation
- Метил раствор целлюлозы: Приготовьте 100 мл 100 мг / мл метилцеллюлозы.
- Тепло 50 мл сверхчистой Н 2 О до 80 ° С. Добавить 10 г порошка метилцеллюлозы и перемешивать до тех пор, пока частицы равномерно распределены.
- Довести до конечного объема холодной сверхчистого H 2 O и перемешивают при 4 ° С до тех пор , пока раствор станет прозрачным, палевого цвета, и не содержит видимых твердых частиц.
- Проход через фильтр с размером 0,45 мкм, чтобы удалить нерастворенные твердые вещества. Приготовленный раствор может быть аликвоты и хранили при 4 ° С в течение до 12 месяцев.
Примечание: Метилцеллюлоза служит не цитотоксические, инертным, суспендирующим агентом для улучшения адгезии клетка-клетка и препятствует образованию липкого монослое клеток. Метилцеллюлоза растворим в воде и может быть смыта следующие СФЕРподъязычная поколение.
- Сфероид формирование среднего
Примечание: Подготовка сфероид образования среде непосредственно перед использованием. Не храните.- Развести метильную раствор целлюлозы до 1-5 мг / мл в соответствующей культуральной среде.
- Проход через фильтр с размером пор 0,22 мкм для стерилизации и удаления нерастворенных твердых веществ.
- Фосфатный буферный солевой раствор Дульбекко (PBS) ,
- Развести до 1х и проходить через фильтр 0,45 мкм перед его использованием. Приготовленный раствор можно хранить неопределенно долго при комнатной температуре.
- Производство Cell сфероида (рисунок 1)
Примечание: Подготовьте все реагенты заранее. Важно, чтобы избежать загрязнения растворов пыли, волокон или других нерастворимых частиц. Присутствие этих загрязнителей отрицательно скажется на сфероид образование. Питательная среда и другие решения должны быть пропущены через фильтр 0,45 мкм, чтобы удалить эти частицы, когда позскорее. Избегайте использования хлопковых фильтрованное пипеток при передаче решений, поскольку они могут вводить дополнительные волокна.- Культуру клеток монослоев до 70% слияния в соответствующей культуральной среде с добавлением 10% сыворотки. Отберите культуральной среды и промыть 1x PBS для удаления мусора. Добавить 3 мл трипсин-ЭДТА (0,05% трипсина) диссоциации буфера до 10 см клеточной культуральной чашки с, и инкубировать клетки при 37 ° С и 5% CO 2.
- Проверьте клетки под микроскопом при 10-кратным увеличением, чтобы подтвердить отрыв. Нейтрализовать буфера диссоциации 7 мл культуральной среды сывороткой.
- Центрифуга клеточной суспензии при 500 мкг в течение 10 мин, чтобы мягко пеллетах клетки.
- Удалить супернатант. Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл среды формирования сфероида с использованием P1000 пипетки с наконечником фильтра.
Примечание: Клеточная суспензия должна быть свободна от комков.- Для растирают осадок клеток, нажмите кончиком пипетки к нижней части трубки под небольшим углом в то время какпипеткой стричь осадок клеток. Избегайте растирания более 3 - 5 раз, так как это может привести к повреждению клеток. Пипетка медленно и не высылать все содержимое наконечника пипетки, чтобы избежать образования пузырьков.
- Граф клеток с использованием гемоцитометра и разбавленной суспензии клеток до 1 × 10 4 клеток / мл.
Примечание: Номер ячейки могут быть оптимизированы для создания сфероидов различных размеров. Трипанового синего окрашивания поврежденных клеток могут быть использованы для подтверждения жизнеспособности клеток ресуспендировали. - Суспензию клеток Передача в стерильную незапыленную многоканальной пипеткой резервуара и использовать подсказки фильтра для Распределить 100 мкл в каждую лунку 96-луночного U-образным дном ячейки гидрофобизирующие пластины.
- Промойте резервуар с фильтрованной сверхчистых H 2 O , чтобы удалить пыль и волокна.
- Смешайте суспензии клеток периодически в то время как высева, чтобы предотвратить клетки оседать на дно резервуара. Для того, чтобы избежать создания пузырьков, используйте обратную технику пипетирования при перемешивании и dispensinг.
- Передача пластин в инкубаторе тканевых культур (37 ° C и 5% CO 2) и проверять ежедневно для сфероида формирования. Клетки должны оседать на дно каждой лунки в течение 6 ч и обычно слипаются в сфероид в течение 24-48 ч (рисунок 2).
- Для подтверждения успешного формирования сфероида, используйте кончик p10 и осторожно пипеткой среду над сфероида, наблюда под микроскопом при 10-кратным увеличением. Правильно сформированные сфероиды ослабит от пластины и валика, подтверждающие их 3D-структуру.
Примечание: метилцеллюлоза и сывороточные концентрации должны быть определены путем титрования для каждой клеточной линии, чтобы получить образование одного сфероида на лунку. Условия Оптимизированные таким образом для выбранных клеточных линий приведены в таблице 1, а примеры сфероидов образуются на фигуре 2В. Spheroids можно выращивать дольше, чем указано, но, поскольку они становятся больше, они становятся все более труднымдля обработки без фрагментации. Если клетки образуют монослой, спутниковые сфероиды или не оседают на дно колодца, концентрация метилцеллюлозы и сыворотке крови , возможно , должны быть дополнительно скорректированы для формирования оптимального сфероида (рис 3B). Не используйте сфероиды , содержащие загрязняющие вещества , такие как волокна или пыль (рис 3А). Предварительно образованные сфероиды можно лечить с помощью соединений, представляющих интерес, таких как факторы роста, пятна живых клеток или ингибиторов для анализа.
2. Сфероид Invasion Анализ (Рисунок 4)
- Обезврежено коллаген
- Охлаждают все жидкости до 4 ° С и держать на льду при работе с коллагеном для предотвращения нежелательной полимеризации.
- Подготовить свежие 0,1 М и 0,01 М растворы NaOH и свежим 0,1 М HCl в сверхчистых H 2 O. переправлены все решения через 0,22 мкм фильтры.
- Смешайте бычьего коллагена 1-го типа (3,1 мг / мл), запаса 0,01 М NaOH и 10х PBS (8: 1: 1 соотношение по объему) и доведения рН до 7,4 с помощью холодной 0,1 М NaOH и HCl. Конечная концентрация коллагена составляет 2,5 мг / мл.
- Подготовьте достаточное количество нейтрализованного коллагена, чтобы заполнить емкость формирования изображения на глубину 2-3 мм. Минимум 100 мкл требуется для каждой лунки 8-луночного культуры тканей камеры слайд, перечисленных в списке материалов.
- Вложение сфероидов в коллаген (Рисунок 4)
- Смазать дно каждой лунки 8-луночного тканевой культуры камеры слайде с минимумом 50 мкл нейтрализованного коллагена.
- чтобы избежать образования пузырьков в коллагене Используйте обратную технику пипетирования. Используйте кончик пипетки, чтобы распространить коллаген равномерно по всей поверхности скважины.
Примечание: Этот базовый слой коллагена будет держать сфероидов в суспензии и, как правило, толщиной 1-2 мм. Базовый слой минимизирует образование мениска на верхнем слое коллагена. Если базовый слой слишком тонок, сфероиды могут вступать в контакт с дном камеры и скольженияобразуют монослой клеток.
- чтобы избежать образования пузырьков в коллагене Используйте обратную технику пипетирования. Используйте кончик пипетки, чтобы распространить коллаген равномерно по всей поверхности скважины.
- Установите камеру слайд, и 35 мм блюдо культуры ткани , заполненный ультрачистой H 2 O, в 10 см блюдо культуры ткани в. Инкубируют при 37 ° С до тех пор, пока коллаген полимеризуется, как правило, через 1 час. Хранить оставшиеся нейтрализованы коллагена на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: водоналивные 35 мм блюдо будет обеспечивать влажность и предотвратить высыхание. Камера слайд должен оставаться в этой камере влажности в течение всего анализа. Коллаген базовый слой может быть оставлен полимеризоваться на ночь. Более длинные инкубирование обычно приводит к более жестким гелем. - С помощью фильтра наконечник p1,000, собирают предварительно сформированные сфероиды (этап 1.4.7) из 96-луночный U-образным дном ячейки гидрофобизирующие пластины в 1,5 мл оснастке верхние трубки. Пипетка медленно и избежать повторных или интенсивное пипеткой, чтобы минимизировать жидкость-стрижку сфероидов. Несколько сфероиды могут быть объединены в одну пробирку для передачи в одну лунку 8-луночного культурального ткани камеры слайд.
- Центрифуга собранные сфероидов в таблETOP микроцентрифужных при 2000 мкг в течение 2-5 сек и удалить супернатант с помощью пипетки P200. Избегайте центрифугирование дольше, чем это необходимо, так как это может привести к сфероиды распадаться или слипаются.
Примечание: После того, как пипеткой от большей части надосадочной жидкости, трубка может быть обращена тщательно над чистым бумажным полотенцем, чтобы фитиль от избытка жидкости. Не позволяйте сфероиды высохнуть. - Используя широкий кончик отверстие P200, аккуратно ресуспендируют сфероидов в 50 мкл нейтрализованного коллагена. Сделайте это для каждой трубки собранных сфероидов перед любыми сфероиды передаются в камеру слайде. Keep сфероидов, которые не были ресуспендировали в нейтрализованного коллагена на льду до готовности к передаче в камеру слайдов.
- Удалить камеру слайд из инкубатора и осторожно пипеткой сфероида-коллагеновый смесь поверх базового слоя коллагена. Инкубировать при 37 ° С и 5% CO 2 , пока коллаген не полимеризуется.
- Не обойтись все содержимое пипетки, чтобы избежать образования пузырьков. DropwISE пипетирования снижает вероятность нарушения коллагена базового слоя.
- Медленно добавить как минимум 100 мкл подогретого культуральной среды, содержащей желаемые хемоаттрактанты, ингибиторы или другие виды лечения в каждую лунку камеры слайде. Коллаген слой, содержащий сфероиды могут порваться, если жидкость пипеткой на него слишком энергично. Питательная среда может быть медленно распределяли вниз сторону колодца, чтобы избежать нарушения коллагена.
- Выдержите в камере слайд при 37 ° С и 5% CO 2 , чтобы позволить проникновению клеток. Инвазии клеток в окружающую коллагена можно наблюдать с помощью светлопольному или флуоресцентной визуализации и количественно оценивали с помощью различных методов, использующих эпифлуоресцентной, конфокальный или световой микроскопии листа.
- Смазать дно каждой лунки 8-луночного тканевой культуры камеры слайде с минимумом 50 мкл нейтрализованного коллагена.
3. Количественное Вторжение: Светлое Микроскопия
- Через определенные интервалы времени, установленного, образ коллагена встраиваемый сфероидов увеличением в 10 раз с помощью микроскопа (светлого шаг 2.2.8).
ПРИМЕЧАНИЕ:долгосрочные эксперименты живых клеток, стадию нагретый микроскопом и СО 2 регулируется камера может быть использована для поддержания сфероидов при температуре 37 ° С и 5% СО 2 в то время как изображения. - Количественно инвазивность с помощью программного обеспечения, таких как ImageJ для измерения количества клеток, вторгающихся в окружающую коллагена, а среднее расстояние захвачена в каждый момент времени.
4. Количественное Invasion: флуоресцентной микроскопией с живой Stain Cell
- После этапа 2.2.8, дополняют среду в камере слайды с флуоресцентным красителем, таких как DAPI, кальцеина AM или других клеток отслеживания соединения, соответствующей линии клеток в соответствии с инструкциями изготовителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для количественного определения инвазивности, однородное окрашивание по всему сфероида не является существенным. Для применений, требующих более глубокого проникновения красителя, более длинные инкубацию (> 3 ч) может быть необходимым. - Удалите пятна и заменить 500 мкл теплой 1x PBS. Вcubate при 37 ° С в течение 10 мин, чтобы удалить избыток пятно. Повторите минимум в два раза.
- С помощью флуоресцентного микроскопа, приобретают оптических срезов через вторгшихся сфероидов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное воздействие лазерного света должно быть сведено к минимуму во время повторяющихся изображений, чтобы ограничить фототоксичности и фотообесцвечивания. - С помощью программного обеспечения, таких как ImageJ, чтобы сформировать Z-проекцию, которая может быть использована для количественного определения общей площади сфероида, число вторгшихся клеток, а также расстояния захвачена в коллагеновой матрице.
- В качестве примера, для количественного определения вторжения, регулировать порог изображения, чтобы исключить фон, выделяя только сфероида и вторжения клетки, и измеряют их площадь. Площадь оригинального сфероида можно вычесть из этой суммы для количественного определения инвазивности.
5. Количественное Вторжение: Иммунофлуоресценции
Примечание: Все растворы и буферы должны быть пропущены через фильтр с размером пор 0,45 мкм перед использованием, чтобы удаливе мусора, которые могут негативно повлиять на окрашивание.
- Готовят PBS + промывочный буфер. Приготовьте 1х PBS и добавляют CaCl 2 и MgCl 2 до конечной концентрации 0,1 мМ. Не автоклава буфер после CaCl 2 и MgCl 2 добавляют. Решение может быть стерилизовали с помощью фильтра и хранили при комнатной температуре.
- Подготовьте нейтральный буферный формалин (НСБ) фиксации буфера. Добавить 5 капель 1 М NaOH до 0,6 г параформальдегида. Довести до 20 мл PBS + и инкубировать при 60 ° С до тех пор , пока параформальдегид растворяется (примерно 1 час). Охлаждают до комнатной температуры и доведения рН до 7,4 с помощью 1 М HCl.
Примечание: НСБ фиксации буфера следует готовить непосредственно перед использованием. - Готовят бычий сывороточный альбумин (БСА) блокирующего буфера. Растворите БСА в PBS + 3% вес / об. Решение может быть стерилизовали через фильтр и хранят при температуре 4 ° С в течение нескольких дней, но лучше всего приготовить свежую. Не нагревайте.
- Подготовка пермеабилизирующего буфера. Развести Triton X-100до 0,2% об / об в PBS +.
Примечание: пермеабилизирующего буфера следует готовить непосредственно перед использованием. - Необязательно, подготовить Mowiol монтажную среду. Комбинат 2,4 г Mowiol, 6 г глицерина, и 6 мл сверхчистой H 2 O. перемешивают в течение 3 ч в ротатор при комнатной температуре. Добавить 12 мл 0,2 М Трис-Cl (рН 8,5). Инкубируют при перемешивании при 50 ° С в течение 10 мин.
- Центрифуга при 5000 мкг в течение 15 мин для осаждения нерастворимого материала. Добавить анти-отбеливающим агентом, таким как 2,5% DABCO. Хранить в 500 мкл аликвотах при -20 ° С.
- Иммунофлуоресценции окрашивание сфероидов (рис 5)
Примечание: С помощью пипетки медленно добавлять или удалять жидкости из камеры слайде. Избегайте использования аспиратора, так как это может нарушить слой коллагена.- Подготовить сфероидов и встроить в коллагеновых заполненные камеры слайдов, как описано в разделах 1 до 2.
Примечание: Коллаген аутофлуоресценция может быть сведено к минимуму с помощью тонких слоев или небольших объемов Collagen. - Удалить столько культуральной среды как можно дальше от каждой камеры слайда.
- Сполоснуть слой коллагена с помощью 500 мкл PBS + буфера для промывки , чтобы удалить остатки среды.
- Добавить 500 мкл свежей PBS + промывочного буфера в каждую лунку и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 5 мин , чтобы вымыть сфероидов. Повторите дважды.
- Заменить PBS + промывочного буфера с 500 мкл буфера НСБ фиксации. Выдержите при комнатной температуре в течение 20 - 25 мин.
- Удалить НСБ фиксации буфера и промойте 500 мкл PBS + промывочного буфера. Промыть в течение 5 мин со свежим PBS + промывочного буфера минимум 3 раза.
Примечание: Фиксированный сфероиды можно хранить при температуре 4 ° С в свежем PBS + промывочного буфера в течение нескольких дней. 0,01% азида натрия может быть добавлен к промывочным буфером для ингибирования роста микроорганизмов во время хранения. - Заменить PBS + промывочный буфер 500 мкл буфера пермеабилизации. Инкубируют при комнатной температуре в течение 10-15 мин.
- Необязательно, удалить BSA блокирующий буфер. Используя скальпель или ножницы, акцизные сфероидов и окружающую 3 мм площадь х 3 мм от коллагеновой слоя. Используя широкий кончик отверстие P1000, выбивать вырезанную блок коллагена путем промывки осторожно свежего блокирующего буфера БСА. Перенести коллагеновый блок в 1,5 мл трубки.
- Центрифуга при 2000 х г в течение 2 мин и удалить супернатант. Трубка может быть тщательно перевернутой над чистым бумажным полотенцем, чтобы фитиль от избытка жидкости.
- Подготовить сфероидов и встроить в коллагеновых заполненные камеры слайдов, как описано в разделах 1 до 2.
- Добавьте первичные антитела к сфероидов и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 ч. Добавьте достаточный объем первичного антитела таким образом, что весь коллаген слой равномерно погружен в воду. Необязательные действия, описанные выше (5.6.8.1-5.6.8.2), как правило, позволяют использовать меньшие объемы антител.
- Погрузитесь камеры слайд в контейнере, по меньшей мере , 10 мл PBS + промывной BUFфер в течение 10 мин, чтобы вымыть. Повторите минимум в два раза.
- Необязательно, если сфероиды вырезали из коллагена слоя ранее (этап 5.6.8.1), добавить минимум 1 мл PBS + промывочного буфера в 1,5 мл трубки и осторожно перемешивать. Дайте впитаться в течение как минимум 10 мин.
- Удалить столько PBS + промывочный буфер , как можно и повторить промывку PBS + промывочный буфер как минимум в два раза. Центрифуга при 2000 мкг в течение нескольких минут, чтобы осадить коллагена блок.
Примечание: Чистые наружные поверхности камеры слайде, протерев 70% -ным этанолом, прежде чем погружаясь в промывочный буфер.
- Повторите шаги 5.6.9-5.6.10 с использованием соответствующих вторичных антител.
Примечание: Если сфероиды окрашивали непосредственно в сосуде формирования изображения, переходите к шагу 5.6.13. - Необязательно, если сфероиды вырезали из коллагена слоя ранее (этап 5.6.8.1), чистые стеклянные слайды и конфокальной микроскопии совместимых с покровные с 70% этанола.
- Удалить столько промывочный буфер как можно дальше от блока коллагена и ресуспендируют в сверхчистых H 2 O. Выполните этот шаг непосредственно перед монтажом. Не оставляйте запятнанные блоки вымачивания в воде.
- Использование тонких щипцов с наконечниками, возьмитесь край коллагена блока и передачи на стекло.
- С помощью щипцов для удержания коллагена в месте, используйте чистую ватный тампон, чтобы впитывать лишнюю жидкость из коллагена блока, убедившись в том, чтобы не коснуться коллагена напрямую.
Примечание: Если коллаген застревает к ватным тампоном она может быть аккуратно удалена или с помощью щипцов или окунанием в воде.
- Используя обратную технику пипетирования, Распределить 100 мкл Mowiol монтажной среды на блок коллагена и место покровное над образцом.
- Используйте ватный тампон или бумажное полотенце, чтобы впитывать лишнюю Mowiol монтажную среду и воду из-под покровное.
- Разрешить Mowiol гистологическая среда затвердевать в течение ночи при 4 °C. Уплотнение края покровного с лаком для ногтей.
- Изображение окрашивали сфероиды с помощью конфокальной или флуоресцентной микроскопии для наблюдения локализации белков , представляющих интерес, формирование инвазивных структур и т.д. (рис 5B, 5C).
Примечание: Бейцованное сфероиды должны быть защищены от света, чтобы предотвратить фотообесцвечивания.
6. Анализ Anoikis
Примечание: сфероида протокол формирования легко адаптирован для количественного анкерное-независимый рост и устойчивость к anoikis в различных типах клеток.
- Посев клеток для anoikis анализа (рисунок 6)
- Следуйте инструкциям по сфероида производства в разделе 1.4, но использовать как минимум 30 мг / мл метилцеллюлозы для подготовки сфероид формирования среды.
Примечание: при нагревании, 30 мг / мл метилцеллюлоза должна производить густой гель, который содержит клетки в суспензии. - Инкубируйте клетки в течение нескольких дней до нескольких недель и вРегулярно ОФЭКТ при 10-кратным увеличением с помощью микроскопа. Клетки, которые сопротивляются anoikis должны размножаться и образовывать колонии.
- Количественно anoikis путем измерения количества и размера колоний, образованных в каждую лунку.
Примечание: После того, как образуются колонии, они могут быть промыты для удаления метилцеллюлоза и использовали для анализов сфероида на основе, как это описано.
- Следуйте инструкциям по сфероида производства в разделе 1.4, но использовать как минимум 30 мг / мл метилцеллюлозы для подготовки сфероид формирования среды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы опишем гибкий и эффективный метод для генерации дискретных сфероиды с использованием клеток отталкивающие пластин и сфероидами средств массовой формации, дополненные MC. При соответствующих условиях МС и сывороткой, отдельные клетки оседать и сцепленных вместе, в центре скважины, чтобы сформировать сфероиды с минимальным присоединением к нижней части скважины. При использовании этого протокола, сфероиды были получены из различных клеточных линий (Фигура 2В). Титрование MC и концентрации в сыворотке крови необходимо для каждой клеточной линии, чтобы определить оптимальные условия, при которых только один сфероид формируется, что является достаточно прочным, чтобы позволить манипуляции без фрагментацию. Оптимально, сфероиды были от 200 до 500 мкм в диаметре, и состоял из плотно прилипшие клетки с минимальным остатков клеток. Сфероидов выжила бережное обращение без повреждений, что позволяет им собирать и использовать в самых разнообразных анализов.
(рис 3а), что привело к агрегатам мертвых клеток. При наличии пыли или других загрязнений волокна, множественный или неправильной формы клеточных скоплений, которые были слабо агрегированных образованных и полученный сфероиды легко оторвались друг от друга, когда обрабатываются. Сфероид образование также зависит от субоптимальных концентраций MC или сыворотке крови в формировании сфероид среды (рис 3B). В нашем тестировании, многие клеточные линии были способны прилипать к клеточной гидрофобизирующие пластин при отсутствии, или при низких концентрациях, МС, и привело к образованию сфероида , окруженного монослое клеток (фигура 3В-II). BxPC-3 рост клеток в неоптимальных условиях МС показана в качестве примера. В общем случае, более высокие концентрации MC предотвращено клеток прилипанию к колодцу, но слишком высокая концентрация MC снижается межклеточную адгезию и предотвратили клеткиоседание на дно скважины, что приводит к образованию рыхлых агрегатов и многочисленных спутников сфероидов (фигура 3В-I). Концентрация сыворотки также зависит выживаемость клеток и клеток-клеток и клеток-пластическое адгезию и необходимо быть оптимизированы для различных клеточных линий. Для получения клеточных линий, таких как НСТ-116 и PANC-1, слишком высокая концентрация сыворотки приводило к чрезмерной клеточной пролиферации и производства крупногабаритных сфероидов, которые были легко повреждены при обработке, или продвигаемых клеточную адгезию к пластику хорошо и образование монослоя ( Фигура 3В-III). Интересно отметить, что эффекты недостаточной сыворотки различались между клеточными линиями. выживание НСТ-116 клеток была снижена и сфероиды, образованные были маленькими, содержащий большую часть мертвых клеток в условиях низкой сыворотке. В противоположность этому , клетки PANC-1 были жизнеспособными в отсутствие сыворотки, но стала более плотное сцепление, и образуется множество агрегатов, а также клеточный монослой (фигура 3В-IV, V).
Модификация описанного сфероида протокола формирования, в котором отдельные клетки суспендируют в более высокой концентрации, MC (30 мг / мл) может быть использован для контроля сопротивления anoikis. При этих концентрациях МС, среда по-прежнему могут быть переданы с помощью пипетки в то время как прохладный, но утолщен в твердый гель при 37 ° С. Anoikis-резистентные клетки ресуспендировали в эту среду остались в суспензии и пролиферируют в течение 2-4 недель, образуя взвешенном сфероидов различных размеров (рис 6б). Анкерные-зависимые клетки не образуют сфероидов в этих условиях. Мы были в состоянии дать количественную оценку anoikis устойчивость путем подсчета онемелиэр сфероидов образуются в каждую лунку.
Рисунок 1: Обзор протокола Формирование 3D сфероида. Клетки, выращенные в монослойной культуре диссоциируют, подсчитывали, осаждали, и ресуспендировали в сфероида пластовой среде, дополненной метилцеллюлозы (МЦ) и в сыворотке крови (I-IV). Суспензию высевают в U-образным дном ячейки гидрофобизирующие пластины при желаемой плотности, чтобы обеспечить образование сфероидов желаемого размера (V), и планшет инкубируют производить отдельный, дискретный клеточный сфероид в каждую лунку (VI). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Оптимизированная сфероида условия образования.(A) Сфероид образование в оптимальных условиях для клеток SH-SY5Y. 1000 клеток засевали в U-образным дном клеток гидрофобизирующие пластин в среде с 5% сыворотки и 1 мг / мл МС агрегируются в компактные сфероиды в течение 24 часов. (B) Типичные изображения сфероидов , образованных различными клеточными линиями в оптимальных условиях , приведенных в таблице 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Сфероид Формирование субоптимальных условиях. (A) сфероидов образуются в присутствии примесей. Микробное загрязнение привело к гибели клеток и слабо агрегированных сфероидов. При наличии нерастворимых примесей, таких как пыль или волокна, клетки, прилипших к этим материалам и не AGGREGел. (Б) образование Сфероид в неоптимального формирования сфероида среды. BxPC-3 клетки высевают в присутствии избытка MC (10 мг / мл), образованный множеством спутниковых сфероиды (I), в то время как недостаточное MC (0 мг / мл) приводило к клеточных агрегатов, которые приклеивают к забое скважины и образовывали монослой (II ). Аналогичные результаты наблюдались для других испытанных клеточных линий (не показаны). Избыток сыворотки (20%) привело к увеличению НСТ-116, пролиферации клеток и монослой образованием (III). Недостаточная сыворотка (0%) имели эффекты клеточной линии конкретных пределах от гибели клеток в НСТ-116 (IV) к образованию спутников сфероидов в Рапс-1 (v). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Вторжение Анализ Использование сфероидов. (A) Оуerview из сфероида анализа вторжения. Сосуд формирования изображения, предварительно покрытых слоем нейтрализованного коллагена и инкубировали полимеризоваться коллаген (I-II). Предварительно сформированный сфероиды собирают в 1,5 мл пробирки и снова суспендируют в нейтрализованного коллагена (III-VI). Сфероида-коллагеновый смесь накладывается на коллагеновой базового слоя и инкубировали полимеризоваться коллаген (VII-VIII). Среда роста, содержащий требуемые соединения затем наложены на полимеризованной сфероида-коллагеновый слой и инкубировали, чтобы позволить вторжение клеток (IX-X). (В) В присутствии хемоаттрактанту, клетки показаны вторжение в окружающую матрицу коллагена из внедренного PANC-1 сфероида в указанные моменты времени. Каждая панель показывает фазовый контраст изображения, полученного с использованием объектива 10X. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: иммунофлуоресценции Окрашивание коллагеном внедренных сфероиды. (A) Обзор протокола для иммунофлуоресцентного окрашивания сфероидов. Встроенные сфероиды моют, фиксированный (НСБ), и блокировали (БСА) непосредственно в сосуде формирования изображения. Сфероидов могут быть окрашены непосредственно, либо вырезают и окрашивают в меньшем объеме, например в 1,5 мл трубки. Spheroids следует мыть с избытком буфера после каждого пятна, чтобы свести к минимуму фоновой флуоресценции. Запятнанные сфероиды могут быть отображены непосредственно в сосуде или монтируется под покровным для визуализации и хранения. (B) иммунофлуоресценции изображения клетки сфероида УМП-1 , встроенного в коллагена и ивазированной в течение 24 ч. (C) Изображения , показывающие фаллоидином окрашенных клеток типичны областей , указанных в B. Каждая панель показывает 20 мкм Z-проекция ( с шагом 0,2 мкм) , полученные с использованием объектива 60X: клетки внутри сфероида бODY приблизительно 20 мкм от поверхности (1), клетки, выступающем коллагена (2), и клетки, вторгшиеся через коллаген (3). Шкала баров = 25 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6: Сфероид Формирование Anoikis анализа. (A) Обзор протокола для anoikis анализа. Клетки получают, как описано на фигуре 1, но ресуспендировали в среде сфероида формации, содержащей как минимум 30 мг / мл MC, который образует толстый слой для хранения отдельных клеток в суспензии и предотвращения агрегации клеток (I-II). Суспензию клеток высевали в U-образным дном клеток гидрофобизирующие планшеты и инкубировали (III-IV). Взвешенные клетки могут быть проверены для сфероида формирования путем пролиферации, что указывает на сопротивление anoikis. (
| Клеточная линия | МС (мг / мл) | Сыворотка (%) | Примерный инкубационный время |
| SH-SY5Y | 1 | 5 | 24 часа |
| BxPC-3 | 5 | 5 | От 3 до 5 дней |
| PANC-1 | 5 | 5 | От 5 до 7 дней |
| НСТ-116 | 3 | 10 | От 2 до 4 дней |
| TT | 1 | 10 | От 7 до 10 дней |
| TPC-1 | 3 | 5 | От 1 до 2 дней |
Таблица 1: Оптимальная Сфероид Формирование состава среды и инкубирование Времена для ПРОВЕРЯЕМЫЕ клеточных линий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы представляем быстрый и гибкий способ получения 3D сфероиды клеток для моделирования архитектуры тканей в естественных условиях с использованием недорогих и широко доступных реагентов. Наш протокол использует не-цитотоксических и адгезионный свойства MC 8, 9 , чтобы опосредовать агрегацию клеток и сводят к минимуму образование монослой клеток. В отличие от матриц на основе белков, выделенных из животных источников, МС инертен, не содержит факторы роста, и легко удаляется путем промывки, что позволяет изолировать сфероидов для использования в различных приложениях без наличия остаточной матрицы. Наш протокол использует быструю агрегацию последовательных числа клеток для создания гомогенного размера сфероидов, позволяя прямые сравнения сфероидов, выращенных при различных экспериментальных условиях. Этот метод может быть адаптирован для смешанных культур для моделирования роста опухоли естественных условиях путем объединения фиксированных числа множественных ассоциированных с опухолью типов клеток (например , фибробласты, лейкоциты, клетки стромы) , чтобы более точно представлять окружающую среду опухоли.
Модификации наших клеток с использованием протокола высевают в высоких концентрациях MC может быть сделано для мониторинга анкерное-независимый рост клеток, способных размножаться в виде суспензии, и может быть использовано в качестве анализа anoikis (раздел 6), чтобы определить или количественно оценить трансформацию клеток. Spheroids, порожденные нашим протоколом идеально подходят для таких приложений, как скрининг лекарственных средств, что позволяет сравнение роста клеток, обмен веществ, выживание и инвазивности между условиями лечения. Изолированные сфероиды также могут быть встроены в внеклеточного матрикса, такие как коллаген, для анализа и количественной оценки клеток инвазивность в 3D-микросреды (раздел 2.2, рис 4) , что более точно моделирует в естественных условиях роста опухоли. Кроме того, наш протокол может быть использован для выделения больших количеств сфероидов из матрицы MC для белка или РНК-препарата, что позволяет USERS для оценки клеточного сигнала или изменения экспрессии генов в ответ на лечение или условий роста.
Наш протокол формирования сфероид требует оптимизации в сыворотке крови и концентрации МС, а количество клеток, посеянных на каждой клеточной линии. Клеточная линия-специфические характеристики, такие как жизнеспособность клеток, клетка-клетка и клетка-пластик липкости, может существенно повлиять на легкость, с которой образуются сфероиды. В целом, клеточные линии с плохой жизнеспособности в монослойной культуре требуется более высокие концентрации сыворотки, чтобы способствовать формированию сфероид, в то время как более высокие концентрации MC были предпочтительны для Высокоадгезивный клеточных линий. Поэтому мы рекомендуем титрование сыворотки и MC быть выполнены, чтобы определить оптимальные условия для выживания клеток (концентрация в сыворотке крови), при одновременной минимизации монослой и образование спутника сфероид (концентрация MC). Эти условия должны приводить к образованию одного дискретного сфероида на лунку без спутников. Оптимальный размер для сфероидаанализ зависит от приложения и зависит от количества клеток, высевают и концентрации сыворотки (этап 1.4.7). Посев меньше клеток , тем меньше размер агрегатов, которые более легко равномерно окрасить, но не может быть воспроизведено в естественных условиях клетка-клетка и клетка-микросреда взаимодействий. Увеличение числа клеток , посеянных генерирует более крупные сфероиды, которые могут содержать физиологически представительную гипоксической сердечника 10 , которые могут влиять на поведение клеток и изменить интерпретации рост или выживание анализов. Однако, когда слишком большой, сфероиды могут быть хрупкими и легко ломаются друг от друга или повреждены во время изоляции. Большие сфероиды также гораздо сложнее визуализировать без специализированных платформ визуализации для оптического секционирования (например , свет листа флуоресцентного микроскопа) или путем встраивания или cryosectioning и окрашивание сечений через сфероида 11. Мы рекомендуем размер целевой сфероиде 200-500 мкм для гибкости илегкость обработки для большинства приложений. В целом, это имеет решающее значение для оптимизации условий для формирования сфероида как в клеточной линии конкретной и специфической для приложения образом.
Сфероида производства протоколы требуют особого внимания, чтобы избежать загрязнения сфероидов пыли и других частиц. Клетки придерживаться пыли и других нерастворимых загрязняющих веществ, что приводит к неправильной формы, свободно присоединенными клеток агрегаты непригодными для использования в анализах (Рисунок 3A). Источники загрязнения могут быть сведены к минимуму путем передачи всех растворов через фильтр 0,45 мкм, промывая монослой клеток с отфильтрованной среды до диссоциации (этап 1.4.1), и промывание многоканальную пипетку резервуары фильтрованной сверхчистой водой непосредственно перед использованием (Этап 1.4.6.1). Кроме того, ватные фильтруется серологических пипеток, которые могут пролить волокна в виде растворов, следует избегать. Хотя это и не критично, пыль может быть дополнительно уменьшена путем пропускания dissociatе изд клетки через клеточный фильтр 100 мкм перед посевом (этап 1.4.6). Улетучивание среды является дополнительным техническим фактором, особенно для инкубации раз превышающие 1 неделю, например, те , которые требуются определенные клеточные линии для сфероида формирования (Таблица 1) или во время anoikis анализов (раздел 6). Испарение может быть сведено к минимуму путем высева клеток в лунках в центральной области мульти-луночных планшетах, заполняя периметр скважин сверхчистой водой и неплотно герметизации краев пластины или ограждающих пластину в увлажненной камере.
сфероиды 3D клеток являются полезной моделью для изучения как нормальной и опухолевой поведения клеток и физиологии. Наш протокол является быстрым и экономичным способом для генерации последовательно размера 3D сфероидов клеток, которые могут быть использованы в ассортименте анализов и приложений. Эти сфероиды представляют собой ценные инструменты для определения характеристик роста опухоли и микроокружения взаимодействий, а также модели для прeclinical оценка новых видов лечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffers | |||
| 10x Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| Calcium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 21114 | Used for PBS+ wash buffer; Do not autoclave PBS+ wash buffer upon addition of calcium chloride |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | M1028 | Used for PBS+ wash buffer; Do not autoclave PBS+ wash buffer upon addition of magnesium chloride |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Spheroid Formation | |||
| 96-well U-bottom Cell-Repellent Plate | Greiner Bio-One | 650970 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | D5546 | For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines |
| F12K Medium | Thermo Fisher Scientific | 2112722 | For culturing TT cell line |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | Filter prior to use to remove particulate contaminants |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M7027 | Prepare in water to 100 mg/mL |
| Roswell Park Memorial Institute Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | Dissociation buffer |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Invasion Assay | |||
| Bovine Type I Collagen | Corning Incorporated | 354231 | Stock 3.1 mg/mL; Maintain on ice when in use |
| DMEM Phenol Red Free Low Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11054-20 | Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium |
| Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-10 | Chemoattractant |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Immunofluorescence Microscopy | |||
| #1.5 Coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72225-01 | For mounting excised spheroids |
| Alexa-Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | Used to stain actin at 1:200 |
| Bovine Serum Albumin | Bioshop Canada Incorporated | ALB001 | Used in BSA blocking buffer |
| Dabco 33-LV | Sigma-Aldrich | 290734 | Antifade |
| Glycerol | Bioshop Canada Incorporated | GLY001 | Used in MOWIOL mounting medium |
| ImageJ Software | Freeware, NIH | - | Used for image analysis |
| Microslides | VWR International | 48312-024 | For mounting excised spheroids |
| MOWIOL 4-88 | EMD-Millipore | 475904 | Used in MOWIOL mounting medium |
| Paraformaldehyde | EMD-Millipore | PX0055-3 | Used in fixation buffer |
| Triton X-100 | Bioshop Canada Incorporated | TRX777 | Used in permeabilization buffer |
References
- Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. A. Two-dimensional vs. three-dimensional in vitro tumor migration and invasion assays. Methods Mol Biol. 986 (986), 227-252 (2013).
- Albini, A., Noonan, D. M. The 'chemoinvasion' assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).
- Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture. Methods Mol Biol. 695, 17-39 (2011).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. (51), (2011).
- Handschel, J. G., et al. Prospects of micromass culture technology in tissue engineering. Head Face Med. 3, 4 (2007).
- Stuckhoff, A. P., DelValle, L. Neuronal Cell Culture Methods and Protocols Vol. 1078 Methods in Molecular Biology. Amini, S., White, M. K. 1078, Humana Press. 119-132 (2013).
- Stewart, G. J., Wang, Y., Niewiarowski, S. Methylcellulose protects the ability of anchorage-dependent cells to adhere following isolation and holding in suspension. Biotechniques. 19 (4), 598-604 (1995).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biol. 10, 29 (2012).
- Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional. Anal. Biochem. 437 (1), 17-19 (2013).
