Summary
提出了在使用自动的免疫-MALDI (iMALDI) 技术的复杂生物体液蛋白质定量的协议。
Abstract
质谱 (MS) 是量化复杂样品中的蛋白质与优秀测定特异性由于每个目标分子质量电荷比直接检测的最常用的技术之一。然而，基于 MS 的蛋白质组学，像大多数其他分析技术，有偏向于测量高丰度分析物，所以它难实现检测限制的低吴/毫升或 pg/mL 的复杂样品和这许多的浓度范围是疾病相关蛋白等人血浆的关键问题之一。为协助低丰度分析物的检测，免疫富集，只纳入测定浓缩和纯化前 MS 测量，显著提高了检测灵敏度分析物。在这项工作，免疫-Matrix-Assisted 激光解吸电离 (iMALDI) 技术是提出了一种定量的蛋白质和肽的关键问题之一，基于免疫浓缩制成的小珠，紧接着 MALDI 质谱测量不事先洗脱。抗多肽抗体是对磁珠，官能化和培养与样品。洗完后，珠子直接转嫁 MALDI 靶板和信号测定 (MALDI Tof) 仪器 MALDI 时间后矩阵解的方法已被应用于珠。样品制备程序简化相比其他免疫色谱-质谱测定和 MALDI 测量是快速。整个样品制备自动化与液体处理系统，以提高的测定的重现性和更高的吞吐量。在这篇文章，iMALDI 法用于确定肽血管紧张素我 (Ang 我) 用于临床作为读出的血浆肾素活性的筛选原发性醛固酮增多 (PA) 的血浆中的浓度。
Introduction
质谱技术已经成为不可或缺的工具，在定量蛋白质组学。质谱分析可以确定目标蛋白质或多肽的群众，因此所得的分析物信号可以高度特异性相比于免疫分析。两种电离方法，电喷雾串联质谱和 MALDI，常被用于检测蛋白质和多肽1，，23，4。在基于 MS 蛋白质定量的主要挑战在于复杂样品在吴/毫升或 pg/mL 的浓度在高丰度蛋白低丰度蛋白的检测及血浆中发现很多候选人蛋白质生物标志物在这范围之内5。这个问题很大程度上造成的人类蛋白质组6复杂性与本质上宽动态范围。
为了克服这些检测，免疫色谱-质谱方法已充实目标蛋白质或多肽从样品溶液在固体的表面，紧接着洗脱物和 MS 测量7，8,9,10.通过免疫浓缩物都从复杂样品纯化，因此从其他分子离子抑制影响降至最低。各种固体支架间磁珠是目前使用最广泛那样高的抗体结合能力的优势和易用性的处理。磁珠与不同的 functionalizations 和大小有被开发和商业化免疫沉淀实验。到目前为止，免疫浓缩制成的小珠已经配套与电喷雾电离 (ESI) 和 MALDI 质谱蛋白质和多肽的测量。稳定同位素标准和捕获由抗多肽抗体 (SISCAPA) 技术，在样品中的蛋白质消化，紧接着孵化与抗体包裹小珠免疫富集。在"古典"SISCAPA，捕获的 proteotypic 多肽是从珠、 洗脱，由液相色谱-质谱 (LC-MS)，或直接输注 ESI 多反应监测-质谱 (ESI-MRM-MS)11，12来衡量。免疫富集 MRM 检测灵敏度提高 3-4 个数量级，达到低吴/mL 范围13。
与电喷雾质谱相比，质谱速度更快，并且不涉及清洗和重新平衡的 LC 列所以没有携带量和污染的问题，使它更加适合高通量研究14。免疫 MALDI 技术得到了我们的实验室要结合质谱免疫富集的敏感和具体量化的多肽和蛋白质 （基于 proteotypic 多肽定量）15，16 ，17。免疫富集，珠 MALDI 靶板上沉积、 矩阵解的方法添加到珠子，和干燥后板是准备 TOF 质谱分析。从珠肽洗脱不执行作为一个单独的步骤，但亲和绑定物洗脱 MALDI 基质解决方案时将其添加到珠点，从而简化样品制备和样品损失最小化。IMALDI 技术已被应用于各种应用程序18，19，最近经过自动化和用于测量血管紧张素我 (和我) 测定血浆肾素活性 (PRA)20。本议定书将演示用于执行自动化的 iMALDI 测定的过程。以 PRA 测定为例，间天 CVs 的少于 10%已通过自动化，与每一天20744 样品的检测能力。
IMALDI PRA 测定表明这份手稿在不需要蛋白质的消化，作为靶分子 (Ang 我) 是一种肽 1295.7 大分子量。在哪里是必要的蛋白质的消化和肽用作完整的蛋白质代孕其他试剂，选定的肽对 iMALDI 应该是独特和特定于目标蛋白，与大量超过 800 的大，所以它可以很容易区分 c从 MALDI 基质溶液的化学噪声。抗多肽抗体所需的多肽免疫富集。IMALDI 试验测量 PRA 的协议包括四个步骤： 1) 昂代我在人血浆;2） 免疫富集昂我使用抗体包被珠;3） 珠转交 MALDI 靶板和添加矩阵解法;和 4） 信号采集20名 MALDI TOF MS 和数据分析。
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Protocol
试剂如下所述的数额基于 20 病人血浆样品的测量。议定书 》 提出了以下如下准则的维多利亚大学 ' s 人类研究伦理委员会。
1.昂代我人血浆中
- 解冻血浆样品 (≥ 200 微升) 在一个房间里温度水浴 5 分钟，然后把样品直到完全融化的冰上。
- 每个样品的浓度手动来分离 1.1 毫升深孔板 （样板） 井和离心 10 分钟在 2 ° C 和 1278 x g.离心机板转移 200 微升
- 使用自动化的液体处理系统连续稀释 500 fmol/微升 Ang I NAT 标准溶液准备与鸡卵清白蛋白的六个校准器解决方案 (0.1、 0.2、 0.6、 1.9、 5.7，17.2 fmol/微升)。
- 的每个校验仪对这一代人很好，和 125 µ L 移液管 200 微升缓冲区来样来板。
注意： 在磷酸盐缓冲的液 (PBS) 缓冲区需要新鲜准备实验日 CEWA. - 使用自动化的液体处理系统，在一个新的盘拌 125 µ L 的等离子体上清液或 125 µ L 的 PBS CEWA 25 微升的昂我代缓冲区，包含 1 M 三、 0.2 毫米乙二胺四乙酸 (EDTA) 和 1 毫米苯甲基磺酰氟 (PMSF)。
注： 准备 Ang 我代缓冲区由搅拌 1 M 三/0.2 毫米 EDTA 缓冲溶液 (适应 pH 5.5 使用醋酸) 和 PMSF 解决方案 （在甲醇中的 100 毫米）。两种解决方案都可以被存储到 1 个月在 4 ° C.混合两个解决方案日实验。 - 自动转移到 96 孔板，3 复制每个解决方案，每井 34 微升的解决方案。孵化在 37 ° C 为 3 h.板
2。免疫富集的昂我使用抗体包裹小珠
- 上磁珠 G 蛋白抗体
注： 抗体与珠的共轭手动术 3 h 昂我代期一天的实验。其他分析物，共轭的珠子可能能够存储在 PBS 缓冲含有 0.015%章 (PBSC) 在 4 ° C 为三个月或更长时间，取决于性能和稳定性的抗体。- 珠浆 （足够测量 20 样品和制作 6 点标准曲线） 的转让 110 微升到 1.5 毫升管。洗珠七次 1 毫升的 25%乙腈/外周血干细胞，与三次 1 毫升的外周血干细胞。使用磁性表座颗粒之间每清洗一步珠。在去年华盛顿后移除洗涤缓冲液
注： 洗 7 倍 25%乙腈/外周血干细胞是删除不兼容的 MS 添加剂中珠浆，如吐温-20 的关键。如果所选的珠子有没有这种添加剂，可能不需要此广泛洗涤步骤。 - 重珠悬在 110 µ L 的外周血干细胞，并添加的抗 Ang 110 µ L 我抗体 (最后抗体浓度： 100 微克/毫升)。吹打，混合的珠子和解决方案，然后孵化它们在室温下 1 h，旋转在 8 rpm。
- 洗珠 3 次 1 毫升的外周血干细胞，并在中央政治局常委会的 1100年微升。
注： 如果任何珠解决方案孵化期间流入的管帽，降速使用台式离心机在 2680 x g.解决方案 - 手动将珠解决方案转移到 96 孔板 （珠标准板）。使用自动化的液体处理系统对分装至同一 96 孔板，每井 120 微升珠
- 珠浆 （足够测量 20 样品和制作 6 点标准曲线） 的转让 110 微升到 1.5 毫升管。洗珠七次 1 毫升的 25%乙腈/外周血干细胞，与三次 1 毫升的外周血干细胞。使用磁性表座颗粒之间每清洗一步珠。在去年华盛顿后移除洗涤缓冲液
- 免疫富集在珠子上
- 3 h 昂我代期间，放在孵化盘后10 分钟终止代昂 I.冰
- 自动稀释 100 倍 SIS 肽原液 (10 皮摩尔/μ L) 用 PBS 缓冲，并进一步自动分装到 96 孔板 PCR 板稳定 isoptope 标准肽稀释。将 1.5 微升的 （含 100 fmol） 的稳定同位素标准 (SIS) 肽溶液转移到孵化板每个井和混合与血浆样品或 PBS 缓冲区中的 CEWA.
- 自动将孵化盘的内容转移到珠解决方案，每井 10 毫升，混合。
- 以 8 rpm 旋转，同时孵化在 4 ° C 1 h 板。
- 珠子三次自动用 5 毫米碳酸氢铵 (AmBic) 溶液冲洗，每次洗涤井每 100 μ L。在最后一次冲洗后, 重 7 微升 5 毫米 AmBic 解决方案在每口井的悬珠。使用一块磁铁把珠拉到底部后最后华盛顿州
3。转移到 MALDI 靶板和添加矩阵解法珠
- 转让 7 微升的珠浆自动到 MALDI 靶板上配有现货 2 600 微米。让珠子干涸。
注意： 一个小的 USB 供电风扇可以用来加速干燥过程珠。 - 自动添加 2 µ L 的 α-氰基-4-羟基肉桂酸 （本病）-从好到现场对靶板每个样本矩阵的矩阵解法 （包含 3 毫克/毫升本病、 1.8 毫克/毫升柠檬酸铵、 70%乙腈和 0.1%三氟乙酸）.
4。信号采集的 MALDI TOF MS 和数据分析
- 分析样品点与 MALDI TOF 仪器使用积极的反射模式。执行内部校准、 数据平滑和特定供应商的软件自动基线减法。
注意： 选择的模式 （正/负线性/反射） MALDI TOF 测量取决于目标多肽或蛋白质。 - 计算相对响应比 （Nat/SIS 强度比），并进行比较的标准曲线确定的李安我每个样品中的浓度。计算方程 (1)，在那里的 PRA δ t Ang 我代 表示的时间用于生成 Ang I.
PRA = [昂我] / δ t Ang 我代 （1)
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Representative Results
李安的测量自动化的 iMALDI 程序我是图 1中所示。关于抗肽磁珠，丰富了目标肽 （内源性肽或从消化蛋白质肽） 和珠子然后转给 MALDI 测量的靶板。整个过程就简化相比需要更多肽洗脱步骤其他免疫色谱-质谱技术。IMALDI 检测自动化允许高通量分析的大量样品间天变异系数 (CV 10 20以下)。代表性的光谱测定人血浆样品中的我图 2中所示的李安获得。SIS 肽功能作为多肽定量内部标准。PRA 值从 188 病人样本与自动化的 iMALDI 测定与获得的使用临床的 LC-MS 程序17 PRA 值的相关性如图 3所示。这两种方法有相关系数是 0.98;通过使用不同的内部标准，在这两种方法，或使用不同的抗体，在 iMALDI 程序20，可能造成斜坡之间的区别。测定方法和测定精度的线性范围是中图 4和图 5所示。
图 1:自动的 iMALDI PRA 测定过程流示意图。改编自参考20，具有权限。请点击这里查看此图的大版本。
图 2:代表谱的 NAT 和 SIS 昂我肽从人血浆样品测量。
图 3:PRA 相关值从 188 患者样本测量 iMALDI 和 LC-MS。改编自参考20，具有权限。
图 4:IMALDI PRA 测定在反射器 (A) 和 (B) 线性模式中的线性范围。改编自参考20，.同意请点击这里查看此图的大版本。
图 5:盘中精度 (A) 和日间精度 (B) 的 iMALDI PRA 测定血浆池与低、 中、 高 PRA 值。改编自参考20，具有权限。请点击这里查看此图的大版本。
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Discussion
相比传统的基于 MS 蛋白质定量，iMALDI 使用抗体来丰富分析物和净化他们从复杂的样品，因此使它能够量化的蛋白质或多肽在低浓度时。IMALDI 协议的关键一步是目标肽免疫富集。为此目的，应选择具有高特异性和亲和力抗体。在 SISCAPA，报道在 10-9米或更好的抗体亲和力将需要实现高灵敏度低吴/毫升21。此外，与高的抗体结合能力的珠子是首选最优浓缩。
它也是重要生成相对"干净"谱的靶分子与最小背景水平。高信号的信噪比可以通过广泛珠洗后免疫富集一步实现。此外，我们发现，洗珠点对靶板后添加和干燥矩阵解的方法可以大大减少噪声信号，从而改善信号的信噪比。
IMALDI PRA 测定表明这项工作不需要蛋白质水解过程步骤，我是李安的靶分子肽。为了量化样品中的蛋白质分子，蛋白通常消化成肽免疫富集之前, 尽管含抗原表位多肽，可以在捕获的蛋白22，23上执行消化。在这种情况下，现有的蛋白质消化协议可以轻松地插入 iMALDI 工作流。 根据消化缓冲区，除盐的步骤可能需要之前捕获的肽对珠，避免干扰肽抗体结合。
类似于其他免疫色谱-质谱方法，生产抗多肽抗体是 iMALDI 检测方法的发展中的重大挑战。最近，三 X 蛋白质组学技术得到了生产可以针对每粘结剂24多肽的亲和性粘合剂。这可能会降低成本的抗多肽抗体，并有助于使用单一的孵化的同时多路复用检测方法的发展。另外，抗体片段25或合成适配26可成为备选的完整抗体的使用也会更容易生产的优势。综合适配据显示背景水平低于完整抗体时用于亲和富集26。
iMALDI 技术与 MALDI 质谱，启用快速、 高通量蛋白质肽分析中大量的复杂样品，具有较高的灵敏度和特异性结合的免疫分析方法的优点。不同于其他免疫色谱-质谱方法后免疫捕获、 肽不洗脱在管内，这个目标，但珠携带物转嫁给 MALDI 靶板的质谱分析，, 从而避免由于其吸附到塑料肽的损失管。与广泛应用蛋白质组学工具如印迹或酶联免疫吸附法相比，只有一个抗体需要 iMALDI，大大降低了检测开发时间和成本。我们取得群体反应性抗体检测中下限是检测的相当传统的 ELISA，生理范围内。抗体和质量电荷比提供双重选择过程，确保检测的高特异性。IMALDI 的应用并不限于 PRA 测定，但可用于任何蛋白表达定量和甚至量化的复杂样品中的蛋白质修饰。值得注意的是，自动化的高吞吐量 iMALDI 可能是强大的临床工具的发现和验证的蛋白质生物标志物在各种疾病，由于目前用于细菌在诊所的台式 MALDI 仪器的存在标识。
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Disclosures
C.H.B 拥有专利的 iMALDI 技术。
Acknowledgments
我们感谢金融支持从加拿大基因和基因组不列颠哥伦比亚省 (204PRO) 的操作和技术发展 (214PRO) 通过基因组创新网络 (GIN)。我们感谢研究所的麦吉尔大学健康中心拍摄 MALDI TOF 仪用于药物发现平台。H.L.是感谢支持从国家科学和工程研究理事会的加拿大 (NSERC) 博士后。C.H.B 非常感谢支持从前缘养老基金 （叶）。C.H.B.是感谢支持从在麦吉尔大学 （加拿大，魁北克，蒙特利尔） 分子肿瘤学的西格尔麦吉尔椅子。M.X.C.和 C.H.B.都很感激支持沃伦 Y.索珀慈善信托基金和阿尔文 · 西格尔家族基金会往犹太医院 （蒙特利尔，魁北克，加拿大）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Healthy control human plasma | Bioreclamation | HMPLEDTA2 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Ammonium citrate dibasic | Sigma Aldrich | 09833 | |
| CHAPS (>=98%) | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Albumin from chicken egg white (>98%) | Sigma Aldrich | A5503 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | EDS | |
| Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma Aldrich | 78830 | |
| Trifluoroacetic acid | Thermo Fisher Scientific | 85172 | LC-MS grade |
| acetonitrile | Fluka | 34967 | LC-MS grade |
| water | Fluka | 39253 | LC-MS grade |
| acetic acid | Fluka | 320099 | LC-MS grade |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Roche Diagnostics | 3118169001 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 10003D | 2.8 μm, 30 mg/mL |
| anti-Ang I goat polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-7419 | |
| Nat and SIS Ang I | synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre | ||
| Automated liquid handling system | Agilent | 16050-102 | Agilent Bravo robotic workstation |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Invitrogen DynaMag-2 magnet |
| Tube rotator | Theromo Scientific | 400110Q | Labquake Tube Rotator |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | DynaMag-96 side skirted magnet |
| Magnet | VP Scientific | 771RM-1 | used to pull the beads to the bottom of the well |
| MALDI-TOF | Bruker | Bruker Microflex LRF instrument |
References
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