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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

ऊतकों और Organoids इंजीनियरिंग के लिए Microfluidic Bioprinting Vascularized

Published: August 11, 2017 doi: 10.3791/55957
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,3
1Division of Engineering in Medicine, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3Division of Pharmacology, Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences, Utrecht University
* These authors contributed equally

Summary

हम एक microfluidic bioprinting एक microfibrous नाड़ी बिस्तर, जहाँ एक माध्यमिक सेल प्रकार आगे vascularized ऊतकों और organoids उत्पन्न करने के लिए इस microfibrous संरचना के बीचवाला अंतरिक्ष में वरीयता प्राप्त किया जा सकता है इंजीनियरिंग के लिए रणनीति पर आधारित एक सामान्यीकृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

Abstract

Vascularized ऊतक इंजीनियरिंग संरचनाएँ और organoids ऐतिहासिक रूप से चुनौतीपूर्ण रहा है। यहाँ हम एक उपन्यास एक पाड़ hydrogel microfibers इंटरलेसिंग बहुपरत साथ उत्पन्न करने के लिए microfluidic bioprinting पर आधारित विधि का वर्णन। चिकनी को प्राप्त करने के लिए bioprinting, एक कोर-म्यान microfluidic printhead कोर के प्रवाह और म्यान प्रवाह द्वारा, किया crosslinking समाधान से extruded एक समग्र bioink सूत्रीकरण युक्त बनाया गया था और bioprinter पर लगे। Alginate साथ जेलाटीन methacryloyl (GelMA) सम्मिश्रण, द्वारा तात्कालिक ईओण crosslinking की उपस्थिति में आए एक polysaccharide divalent आयनों, स्थायी स्थिरीकरण को प्राप्त करने के लिए GelMA घटक के एक माध्यमिक photocrosslinking द्वारा और उसके बाद का चयन करें, एक microfibrous पाड़ इस bioprinting की रणनीति का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात, endothelial कोशिकाओं के अंदर bioprinted microfibers समझाया vasculature संस्कृति के दौरान 16 दिनों के लिए जैसी लुमेन-संरचनाओं की तरह फार्म कर सकते हैं। Endothelialized microfibrous पाड़ आगे के रूप में एक संवहनी बिस्तर क्रमिक microfibers के बीचवाला अंतरिक्ष में माध्यमिक सेल प्रकार के बीज बोने की क्रिया के माध्यम से एक vascularized ऊतक का निर्माण करने के लिए उपयोग किया जा सकता। Microfluidic bioprinting vascularized ऊतकों में उच्च फिडेलिटी की सुविधाजनक इंजीनियरिंग में एक सामान्यीकृत रणनीति प्रदान करता है।

Introduction

ऊतक इंजीनियरिंग लक्ष्य कार्यात्मक ऊतक के विकल्प बदलें, पुनर्स्थापित करें, या उन घायल या बीमार मानव शरीर1,2,3,में4, अक्सर एक वांछित सेल प्रकार, और संयोजन के bioactive अणुओं5,6, biomaterials7,8,9,10के माध्यम से बढ़ाने के लिए उपयोग किया जा सकता उत्पन्न करने के लिए। हाल ही में, ऊतक इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकी भी तेजी से इन विट्रो में ऊतक और अंग मॉडल है कि अपने इन विवो समकक्षों, दवा विकास, पारंपरिक अति सरलीकृत planar सेल संस्कृतियों11,12,13,14,15,16,17,18,19के प्रतिस्थापन में जैसे अनुप्रयोगों के लिए के महत्वपूर्ण कार्यों की नकल उत्पन्न करने के लिए अपनाया गया है। दोनों स्थितियों में, जटिल microarchitecture और सौपानिक संरचना मानव ऊतकों की पुनरावृत्ति करने की क्षमता10इंजीनियर ऊतकों की कार्यक्षमता को सक्षम करने में महत्वपूर्ण है, और vascularization फ़ील्ड20,21,22,23के लिए सबसे बड़ी चुनौतियों में से एक प्रस्तुत करता है के बाद से विशेष रूप से, एक नाड़ी नेटवर्क इंजीनियर के ऊतकों में एकीकृत करने के लिए तरीके की मांग कर रहे हैं।

तारीख करने के लिए, तरीकों की एक किस्म विकसित किया गया है इस संबंध में8सफलता के विभिन्न डिग्री के साथ इंजीनियर ऊतक संरचनाओं में रक्त वाहिका संरचनाओं का निर्माण करने के प्रयास में। उदाहरण के लिए, स्व-संयोजन endothelial कोशिकाओं के microvascular नेटवर्क24की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है; angiogenic वृद्धि कारक के वितरण निरंतर neovascularization25,26लाती है; संवहनी जनक कोशिकाओं के उपयोग और endothelial कोशिका विकास और विधानसभा24,27pericytes की सुविधा; पाड़ गुण डिजाइनिंग vascularization28,29के सटीक मॉडुलन सक्षम बनाता है; और सेल शीट प्रौद्योगिकी संवहनी layering30के सुविधाजनक हेरफेर के लिए अनुमति देता है। फिर भी, इन रणनीतियों vasculature, अक्सर यादृच्छिक वितरण एक इंजीनियर के ऊतकों का निर्माण और इस प्रकार सीमित reproducibility व्यक्ति के भीतर रक्त वाहिकाओं के लिए अग्रणी के स्थानिक patterning को नियंत्रित करने की क्षमता प्रदान करना नहीं। पिछले कुछ वर्षों के दौरान bioprinting तकनीकों इस तरह एक चुनौती, उच्च विश्वस्तता और reproducibility की जटिल ऊतक पैटर्न एक स्वचालित या अर्द्ध स्वचालित तरीके से31,32,33में जमा करने की उनकी अद्वितीय बहुमुखी प्रतिभा के कारण का समाधान की दिशा में सक्षम बनाने के एक वर्ग के रूप में उभरा है। बलि bioprinting34,35,36,37,38, एम्बेडेड bioprinting39,4140,, और है खोखले संरचना bioprinting/biofabrication42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53 सभी संवहनी या vascularized ऊतकों पैदा करने की व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया।

वैकल्पिक रूप से, एक microfluidic bioprinting रणनीति microfibrous scaffolds के निर्माण के लिए हाल ही में विकसित किया गया है, जहां एक संकर bioink alginate की रचना और जेलाटीन methacryloyl (GelMA) एक गाढ़ा printhead और एक कैल्शियम क्लोराइड (CaCl2) समाधान के कोर के माध्यम से वितरित किया गया था printhead54,55के बाहरी म्यान प्रवाह के माध्यम से किया गया। सह बाहर निकालना दो प्रवाहों alginate घटक का तत्काल भौतिक crosslinking के लिए स्थायी स्थिरीकरण बहु परत microfibrous पाड़ के बाद photocrosslinking सुनिश्चित किया, जबकि microfiber गठन, को सक्षम करने के लिए अनुमति दी। का नोट, endothelial कोशिकाओं के भीतर bioprinted microfibers समझाया पैदा करना और microfibers जो मजाक उड़ाया है संवहनी बिस्तर54,55लुमेन-संरचनाओं की तरह संभालने के peripheries की ओर स्थानांतरित करने के लिए पाए गए। इन bioprinted, endothelialized नाड़ी बिस्तर बाद में के साथ पॉपुलेटेड हो सकता है आगे vascularized ऊतकों55का निर्माण करने के लिए माध्यमिक कोशिका प्रकार वांछित। इस प्रोटोकॉल इस तरह गाढ़ा नोजल डिजाइन, जो ऊतक इंजीनियरिंग और organoid मॉडलिंग में संभावित अनुप्रयोगों के लिए vascularized ऊतकों के सुविधाजनक निर्माण सुनिश्चित करके सक्षम ऐसे एक microfluidic bioprinting की रणनीति का एक विस्तृत प्रक्रिया प्रदान करता है।

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Protocol

नवजात चूहे में इस प्रोटोकॉल का उपयोग cardiomyocytes एक सुस्थापित प्रक्रिया56 संस्थागत पशु की देखभाल और ब्रिघम और महिलाओं के अस्पताल उपयोग समिति द्वारा स्वीकृत किया गया है के बाद 2 दिन पुरानी Sprague-Dawley चूहों से अलग थे।

1. Bioprinter के इंस्ट्रूमेंटेशन

  1. एक छोटे कुंद सुई (उदाहरण के लिए, 27 G, 1 इंच) डुएल-परत, गाढ़ा microfluidic printhead का निर्माण करने के लिए म्यान के रूप में एक बड़ा कुंद सुई (उदाहरण के लिए, 18 G, ½ इंच) के केन्द्र में प्रमुख के रूप में सम्मिलित करें; सुनिश्चित करें कि कोर सुई थोड़ा फैला हुआ है (~ 1 मिमी) की बाहरी कवच (चित्र 1A) तुलना में अब। लेकिन उचित आकार के आवश्यक spacers अस्थायी टिप और गाढ़ा संरेखण की सहायता करने के लिए प्रति बैरल पक्षों पर आंतरिक/सुइयों के बीच sandwiched हो कर सकते हैं, तो संरेखण आमतौर पर मैन्युअल रूप से निकाला जाता है। Epoxy गोंद के साथ बैरल के जंक्शन सील और संरेखण spacers टिप की ओर से जब लागू निकालें।
  2. लिहाजा केंद्रीय सुई की नली में एक और सुई (23 ग) सम्मिलित करें।  तब एक छेद बैरल बाहरी सुई के किनारे पर जनरेट करें और आकार में छेद सील epoxy गोंद के साथ के बाद, मिलान के एक धातु कनेक्टर सम्मिलित करें।
  3. Inlets के printhead bioink और crosslinking समाधान के इंजेक्शन के लिए एक डुएल-चैनल सिरिंज पंप करने के लिए व्यक्तिगत रूप से, दो परमवीर चक्र ट्यूबों के माध्यम से कनेक्ट। एक प्लास्टिक धारक poly(methyl methacrylate) (PMMA) की बनाया का उपयोग एक bioprinter के सिर पर तनों माउंट।
    नोट: Bioprinter चयन उपलब्धता पर निर्भर करता है। हमारे मामले में, हम सफलतापूर्वक इस सेटअप कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध bioprinters पर परीक्षण किया है। हालांकि, एक x-y-z motorized चरण सुविधाएँ किसी भी bioprinter सिद्धांत रूप में, इस microfluidic printhead के एकीकरण सक्षम होना चाहिए।

2. Bioprinting Microfibrous नाड़ी बिस्तर

  1. Alginate (4 w/v%, कम चिपचिपापन), जिलेटिन (GelMA, 1-2 w/v%) methacryloyl57,58और photoinitiator Irgacure 2959 का एक मिश्रण का उपयोग कर bioink कर (0.2 - 0.5 wt.%) 25 मिमी 2-[4-(2-hydroxyethyl) piperazin-1-yl में भंग] ईथेन sulfonic एसिड (HEPES बफ़र, पीएच 7.4) युक्त 10 vol.% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)।
  2. 10 vol.% crosslinking वाहक द्रव रूप में FBS युक्त HEPES बफ़र में 0.3 M CaCl2 के एक समाधान बनाने।
  3. Bioprinting, के तुरंत पहले मानवीय नाल नस endothelial कोशिकाओं (HUVECs) 5-10 मिनट के लिए 0.05 w/v% trypsin द्वारा उपचार का उपयोग बोतल दिए से अलग कर देना, और कक्षों में 5-10 × 106 कक्षों/एमएल की एकाग्रता पर bioink resuspend. निलंबन समरूप वितरण सुनिश्चित करने के लिए धीरे धीरे 5 से 10 बार pipette.
  4. Bioink/crosslinking 5 µL/एमएल की एक ही प्रवाह दरों पर एक डुएल-चैनल सिरिंज पंप का उपयोग तरल पदार्थ का इंजेक्शन प्रारंभ करें। जब तक वे को स्थिर करने के लिए 1 मिनट के लिए लगातार चलने के लिए प्रवाह की अनुमति कर सकते हैं। बाद में, printhead की आवाजाही आरंभ bioprinter लगभग 4 मिमी/s (चित्र 1बी) के जमाव रफ्तार को नियंत्रित करने के द्वारा। इन गति ठीक की जरूरत हो सकता है इष्टतम bioprinting सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक नए सेटअप के साथ ट्यूनिंग। Bioprinting प्रक्रिया आम तौर पर कमरे के तापमान (21-25 ° C) पर आयोजित किया जाता है, लेकिन इस तापमान परिवर्तित किया जा सकता है। Bioprinting प्रक्रिया तेजी से ईओण जमाना alginate घटक की है और एक microfibrous पाड़ (चित्र 1बी) के जमाव के लिए अनुमति चाहिए।
  5. पाड़ bioprinted होने के बाद, रासायनिक जमाना आगे photocrosslinking GelMA घटक है, में लगभग 5-10 मेगावाट/सेमी2 यूवी प्रकाश (360-480 एनएम) के द्वारा 20-30 s (चित्र 1सी) के लिए प्राप्त करने के।
  6. Bioprinting और crosslinking के बाद, धीरे से पाड़ फॉस्फेट-बफ़र्ड नमकीन (PBS अतिरिक्त CaCl2को निकालने के लिए) के साथ कुल्ला। संस्कृति HUVECs से लदी microfibrous पाड़ endothelial कोशिका वृद्धि मध्यम (ईजीएम) के 16 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5 vol.% सीओ2 पर एक मशीन में मध्यम साथ में कम से कम हर 2 दिन बदल गया। Morphologies एक खुर्दबीन के नीचे HUVECs की संस्कृति की अवधि के दौरान निगरानी।

3. Vascularized के ऊतकों का निर्माण

  1. HUVECs peripheries पाड़ लुमेन की तरह संरचनाओं (चित्र 1घ) फार्म में microfibers के लिए माइग्रेट है के बाद, पाड़ पुनर्प्राप्त और धीरे से एक hydrophobic सतह (जैसे, polymethylsiloxane [PDMS] के एक स्लैब) की सतह पर जगह है। ध्यान से सभी मध्यम केशिका बल के साथ पाड़ के बीचवाला अंतरिक्ष से निकालने के लिए बाँझ फ़िल्टर कागज के एक टुकड़े का उपयोग करें।
  2. तुरंत एक बूंद (लगभग 20-40 µL) 1-10 × 106 कक्षों/एमएल पाड़ पाड़ (चित्र 1E) के पूरे बीचवाला अंतरिक्ष घुसपैठ करना चाहिए जो, ऊपर के एक घनत्व पर मध्यम में एक माध्यमिक सेल प्रकार (जैसे, cardiomyocytes) के निलंबन के जोड़ें। (37 ° C, 5 vol.% CO2, 95% सापेक्षिक आर्द्रता) 0.5 - कक्षों पर अलग-अलग microfibers का पालन करने के लिए अनुमति देने के लिए 2 एच के लिए एक मशीन में ऐसी कोई कॉन्फ़िगरेशन सेते हैं। छोटी बूंद आकार कि कोई नजर वाष्पीकरण मनाया जाता है यह सुनिश्चित करने के लिए अवधि पर नजर रखने।
  3. धीरे scaffolds जब तक वांछित vascularized ऊतक का गठन किया है किसी भी गैर-समर्थक कोशिकाओं और संस्कृति निर्माण में उपयुक्त माध्यम निकालने के लिए एक PBS स्नान में झटकों से धो लें।

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Representative Results

Microfluidic bioprinting रणनीति प्रत्यक्ष बाहर निकालना bioprinting microfibrous scaffolds कम चिपचिपापन bioinks54,55का उपयोग के लिए अनुमति देता है। के रूप में चित्रा 2मेंएक, एक पाड़ के एक आकार 6 × 6 × 6 मिमी के साथ सचित्र3 युक्त > microfibers की 30 परतों bioprinted 10 मिनट के भीतर किया जा सकता है। तत्काल ईओण crosslinking alginate घटक CaCl2 के साथ के बाद शारीरिक photocrosslinking GelMA bioprinted microfibrous पाड़ की दीर्घकालिक स्थिरता सुनिश्चित की शीर्ष और पक्ष आंकड़े 2B और 2 सीमें दिखाए गए दृश्य में दर्शाई के रूप में घटक की जबकि bioprinting प्रक्रिया के दौरान उत्कृष्ट संरचनात्मक अखंडता के लिए अनुमति दी। इस स्थिति में, bioprinting प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट शर्तों के तहत हासिल की microfibers व्यास, जो वृद्धि अतिरिक्त समय के साथ थोड़ा सूजन होता में लगभग 100-150 सुक्ष्ममापी थे।

Bioprinting प्रक्रिया, bioink, ईओण crosslinking, और photocrosslinking, के microfluidic बाहर निकालना सहित काफी समझाया HUVECs की व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं किया। कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत उच्च उपयोगिता बनाए रखने सकता > 80% (चित्रा 2D) सभी इन कार्यविधियों के पूरा होने के बाद। रिपोर्ट पिछले54,55के रूप में, HUVECs सकता है धीरे-धीरे पैदा करना और दिन 0 (चित्रा 2ई) में शुरू में यादृच्छिक वितरण से microfibers peripheries लुमेन-संरचनाओं की तरह दिन 16 पोस्ट-bioprinting संस्कृति (चित्रा 2F) में पर मान लें करने के लिए microfibers के लिए में माइग्रेट करें। ऐसे किसी व्यवहार के लिए HUVECs मनाया endothelial कोशिकाओं की आंतरिक इंटरफ़ेस संचालित प्रवृत्ति के रूप में अच्छी तरह से पोषक तत्वों और ऑक्सीजन से microfibers उनके अंदरूनी55,59में आसपास की उच्च उपलब्धता के कारण होने की संभावना थी।

Microfibrous पाड़ ऊतक इंजीनियरिंग के लिए एक स्वसंपूर्ण मंच के रूप में भी कार्य कर सकते हैं। Myocardium ऊतक के एक उदाहरण के रूप में उपयोग, नवजात चूहे cardiomyocytes थे 5 × 106 कक्षों/एमएल की एक घनत्व पर एक bioprinted पाड़ के मध्यवर्ती स्थान पर वरीयता प्राप्त, और में Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (10 vol.% FBS साथ पूरक DMEM) सुसंस्कृत। माध्यम हर दिन में पहले 2-3 दिनों तक पिटाई, cardiomyocytes शुरू कर दी जिसके बाद हर 2-3 दिन55,60,,6162मध्यम थी केवल ½ विमर्श बदल गया था। कक्षों उनके सहज और सिंक्रनाइज़ किए गए सेल स्रोत और scaffolds55के कॉन्फ़िगरेशन के आधार पर 9-28 दिन तक के लिए की धड़कन बनाए रखने सकता है। पाड़ पर परिपक्व cardiomyocytes भी confocal प्रतिदीप्ति छवियों में सचित्र रूप में कार्यात्मक हृदय biomarkers की मजबूत अभिव्यक्ति sarcomeric α-actinin (चित्र 3B) और connexin-43 (चित्र 3सी) सहित चित्र 3में, पता चला है।

Endothelial कोशिकाओं और माध्यमिक सेल प्रकार के संयोजन, एक vascularized ऊतक आगे का निर्माण किया जा सकता है। फिर से, संवहनी बिस्तर में एक bioprinted microfibrous पाड़ संस्कृति का मोटे तौर पर 16 दिनों के बाद का गठन किया है के बाद myocardium एक उदाहरण के रूप में, का उपयोग कर, नवजात चूहे cardiomyocytes बाद में पाड़ के बीचवाला अंतरिक्ष में वरीयता प्राप्त थे। संवर्धन और एक आम मध्यम में परिपक्वता की 1:1 की मात्रा राशन EGM:DMDM की रचना करने के बाद, एक endothelialized उपयोग ऊतक सहज और तुल्यकालिक धड़कन55का प्रदर्शन का गठन किया जा सकता है। एकल-विमान confocal प्रतिदीप्ति छवियों आंकड़ा 4 में आगे दोनों प्रकार के सेल, microfibers (चित्र 4ख) की सीमाओं में मुख्य रूप से मौजूद HUVECs के साथ और cardiomyocytes microfibers (चित्रा 4C) के एक्सटीरियर आसपास के सह-अस्तित्व का पता चला।

Figure 1
चित्रा 1 : Microfluidic Bioprinting Vascularized ऊतक पैदा करने के लिए रणनीति Constructs.
(A) समग्र bioink और CaCl2के सह बाहर निकालना के लिए कोर-म्यान समाक्षीय printhead के डिजाइन। (B-E) Schematics एक vascularized ऊतक की निर्माण प्रक्रिया दिखाने का निर्माण। यह आंकड़ा उल्लेख55से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2 : Bioprinting Microfibrous नाड़ी बिस्तर.
(A) एक bioprinted 30-परत microfibrous पाड़ दिखा तस्वीर। (बी, सी) माइक्रोग्राफ एक bioprinted पाड़ पृष्ठ के ऊपर और साइड विचार। (D) व्यवहार्यता की एक bioprinted microfibrous पाड़ में लादेन HUVECs. हरे और लाल रहते हैं और मृत कोशिकाओं, क्रमशः संकेत मिलता है। (ई, एफ) ग्रीन fuorescent (GFP) प्रोटीन के संगठन दिखा प्रतिदीप्ति माइक्रोग्राफ-0 दिन में bioprinted microfibers में HUVECs और दिन 16 पोस्ट bioprinting, क्रमशः। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
आंकड़ा 3 : Cardiomyocytes Bioprinted Microfibrous पाड़ पर का क्रमिक विकास.
प्रतिदीप्ति माइक्रोग्राफ नाभिक (A) , (B) sarcomeric α-actinin, (C) connexin-43, और (D) बीतने दिखाई जा रही हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4 : Endothelialized उपयोग ऊतक का निर्माण.
प्रतिदीप्ति माइक्रोग्राफ नाभिक (A) , (B) GFP-HUVECs, (C) एफ-actin दोनों HUVECs और cardiomyocytes, और (D) बीतने के दिखा रहा है। इनसेट में D endothelialized उपयोग ऊतक के एक निचले-आवर्धन छवि से पता चलता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक Dataset.
जी-कोड एक नमूना फ़ाइल bioprinting के लिए एक 6 × 6 मिमी2 वर्ग जाली से सटे microfibers के बीच 220 माइक्रोन रिक्ति के साथ।

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Discussion

सह-अक्षीय printhead का निर्माण सफल microfluidic bioprinting कोर और म्यान से crosslinking एजेंट से दोनों bioink के साथ-साथ वितरण के लिए अनुमति देने के लिए की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करता है। जबकि इस प्रोटोकॉल में एक उदाहरण printhead 27 G सुई कोर और एक 18 G सुई के रूप में के रूप में शेल का उपयोग कर बनाया गया था, यह आसानी से सुई के विभिन्न आकारों का उपयोग संयोजन की एक किस्म के लिए बढ़ाया जा सकता है। हालांकि, सुई के आकार, जो प्रवाह की मात्रा में परिवर्तन में परिणाम प्रत्येक चरण में दिया, में परिवर्तन दोनों bioink और crosslinking (दो सिरिंज पंप का उपयोग कर के बजाय एक डुएल-चैनल एक व्यक्तिगत समायोज्य) एजेंट, और संभवतः भी bioprinter द्वारा किए गए बयान गति के प्रवाह दरों के आगे अनुकूलन की आवश्यकता होगी।

पैरामीटर (सुई आकार, प्रवाह दरें और निक्षेपण गति) में वर्तमान प्रोटोकॉल का संयोजन bioprinted microfibers एक व्यास लगभग 120 माइक्रोन के साथ तुरंत बयान, जो मोटे तौर पर 150 सुक्ष्ममापी करने के लिए मध्यम55में equilibration के बाद प्रफुल्लित होगा के बाद का नेतृत्व किया। रूप microfibers की परतों के बीच स्थान नहीं था, में एक ऐसे आकार के bioprinted संरचनाओं की परत मोटाई के लिए भी मोटे तौर पर बराबर होती है। Bioprinted microfibers के व्यास सभी तीन पैरामीटर54,63के एक समारोह है; printhead के कोर सुई और bioink के प्रवाह की दर के आकार के आकार म्यान सुई, crosslinking एजेंट, और जमाव गति के प्रवाह की दर के नकारात्मक सहसंबद्ध हैं जबकि microfibers के व्यास के साथ microfibers के व्यास के साथ सहसंबद्ध सकारात्मक हैं। Printhead और/या motorized मंच की आवाजाही पर नियंत्रण के मनमाने ढंग से संरचनाओं54,55microfibrous scaffolds के जमाव के लिए की अनुमति होगी।

इसके अलावा, निर्माण bioink के रूप में अच्छी तरह से bioprinting की प्रोफाइल बदल सकते हैं। उदाहरण के लिए, alginate और GelMA की मात्रा थोड़ा विशिष्ट अनुप्रयोगों के अनुसार किया जा modulated के कर सकते हैं, और यह bioink, polyethylene glycol-यांत्रिकी bioprinted microfibers40के बढ़ जाती है कि tetraacrylate (PEGTA) के रूप में अतिरिक्त सामग्री मिश्रण करने के लिए संभव है। यूवी crosslinking भी bioprinted microfibers, जो आगे54एम्बेडेड endothelial कोशिकाओं के व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं के केंद्र के यांत्रिक गुण निर्धारित करता है। रिपोर्ट में इस प्रोटोकॉल पैरामीटर HUVECs के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया था। हालांकि, यह अनुमान है कि, प्रत्येक endothelial कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के लिए crosslinking पैरामीटर में microfibers लुमेन के गठन को प्राप्त करने के लिए पुन: अनुकूलित किया जा करने के लिए की आवश्यकता होगी।

Bioprinted नाड़ी बिस्तर पर एक माध्यमिक सेल प्रकार बीज के लिए, यह पाड़ hydrophobic सतह का एक टुकड़ा पर जगह है और ज्यादातर मध्यम पाड़ के बीचवाला अंतरिक्ष में निकाल दिया जाता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है। यह छोटी बूंद मुक्त खड़े और पाड़ के पाठ्यक्रम के दौरान के बीज बोने की क्रिया, encapsulating के साथ microfibrous संरचना microfibers की सतह पर संलग्न कोशिकाओं की संख्या को अधिकतम करने में कोशिका निलंबन तत्काल घुसपैठ की अनुमति होगी। हालांकि 5 × 106 कक्षों/एमएल में cardiomyocytes के एक अपेक्षाकृत उच्च घनत्व में वर्तमान प्रोटोकॉल उपयोग ऊतकों के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया गया था, ऐसे घनत्व मनमाने ढंग से विशिष्ट ऊतक प्रकार से मेल करने के लिए tuned किया जा सकता। यह भी एक humidified वातावरण, जो बाँझ पानी भरने से महसूस किया जा कर सकते हैं बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है या PBS (अर्थात्, आस-पास के कुओं या PDMS स्लैब के आसपास अंतरिक्ष में), पाड़ के आसपास यह सुनिश्चित करने के बीज बोने की क्रिया के लिए माध्यम की छोटी राशि बोने की अवधि से अधिक नहीं कि लुप्त हो जाना।

सारांश में, हम vascularized के ऊतकों की सुविधाजनक निर्माण के लिए microfluidic bioprinting का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान की है। इस रणनीति में, एक कोर-म्यान सह-अक्षीय printhead म्यान से कोर और crosslinking एजेंट से एक संकर bioink के साथ-साथ बाहर निकालना सक्षम करने के लिए उपयोग किया जाता है। सह बाहर निकालना, पर bioink तुरंत इसकी alginate घटक एक स्तरित microfibrous पाड़ bioprinter के आंदोलन द्वारा प्रोग्राम के रूप में बनाने के लिए भौतिक crosslinking से होकर गुजरती है, पूरे निर्माण है, जबकि रासायनिक photocrosslinked दीर्घकालिक स्थिरता की अनुमति दें करने के लिए GelMA घटक के लिए आगे। Endothelial कोशिकाओं में microfibers bioprinting की प्रक्रिया के दौरान जिक्र पैदा करना और peripheries पाड़ मोड़ में एक संवहनी बिस्तर लुमेन-संरचनाओं की तरह, संभालने के लिए माइग्रेट कर सकते हैं। एक माध्यमिक सेल प्रकार बीज बोने की क्रिया द्वारा, एक vascularized ऊतक का निर्माण बाद में उत्पन्न किया जा सकता। इस microfluidic bioprinting रणनीति अद्वितीय है, और सुविधाजनक रूप से जिगर, कंकाल मांसपेशियों के रूप में ऊतक प्रकार की एक किस्म के लिए बढ़ाया जा सकता है, और myocardium के अलावा कैंसर में वर्तमान प्रोटोकॉल, वांछित कोशिका प्रकार के तार्किक संयोजन द्वारा सचित्र और विशेष रूप से bioprinted microfibrous scaffolds के पैटर्न डिजाइन। Vascularized ऊतक संरचनाओं के साथ एक ऐसी विधि का उत्पादन में vivo ऊतक पुनर्जनन या इन विट्रो में ऊतक मॉडलिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित microfluidic bioprinting रणनीति के साथ जुड़े कई सीमाएं हैं। सबसे पहले, bioprinted microfibers के व्यास hydrogel मैट्रिक्स के प्रसार बैरियर के कारण कुछ सौ micrometers CaCl2 समाधान कुशलता से crosslink कोर में alginate घटक के लिए करने के लिए सीमित है। पीढ़ी कम शारीरिक crosslinking घनत्व बहुपरत संरचना अस्थिर करना होगा। दूसरा, शारीरिक crosslinking के एजेंट CaCl2 समाधान के कुछ endothelial कोशिका प्रकार है कि HUVECs, जैसे कि endothelial जनक कक्षों से अधिक कमजोर कर रहे हैं पर नकारात्मक प्रभाव डालती सकता है। व्यवहार्यता endothelial कोशिका प्रकार की एक व्यापक विविधता के लिए एक ऐसी bioprinting विधि का उपयोग कर के अतिरिक्त जांच की आवश्यकता हो सकती। Endothelial कोशिकाओं लुमेन-संरचनाओं की तरह microfibers के भीतर फार्म कर सकते हैं, जबकि तीसरा, इन microfibers की कोर छिड़काव को सक्षम करने के लिए खोखले नहीं हैं। इसलिए, पोषक तत्वों और ऑक्सीजन अभी भी मुख्य रूप से bioprinted scaffolds में बीचवाला अंतरिक्ष के माध्यम से प्रदान की जाती हैं। बलि सामग्री के अनुकूलन photocrosslinkable घटक bioink64 के रूप में प्रौद्योगिकी के भविष्य के संस्करणों में इस समस्या को हल कर सकते हैं। वैकल्पिक रूप से, bioprinted खोखले ढांचे42,43,65,66,67,68 संवहनी बिस्तर के रूप में प्रत्यक्ष vascularized ऊतक का छिड़काव सुनिश्चित करने के लिए उपयोग किया जा सकता microfibrous constructs. अंतिम, नैदानिक आकार के ऊतकों की bioprinting अभी भी जो की संभावना उच्च throughput में विस्तृत पैमाने पर bioprinting को प्राप्त करने के लिए arrayed microfluidic printheads69 के डिजाइन को शामिल करके संबोधित कर सकते हैं चुनौतीपूर्ण, हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा।

Acknowledgments

लेखक राष्ट्रीय कैंसर संस्थान के राष्ट्रीय संस्थानों के स्वास्थ्य के लिए मार्ग स्वतंत्रता पुरस्कार (K99CA201603) स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alginic acid sodium salt from brown algae Sigma-Aldrich A0682 BioReagent, plant cell culture tested, low viscosity, powder
Gelatin type A from porcine skin Sigma-Aldrich G2500 Gel strength 300
Irgacure 2959 (2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) Sigma-Aldrich 410896 98%
HEPES buffer Sigma-Aldrich H0887 1 M, pH 7.0 - 7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Fetal bovine serum  Thermo Fisher Scientific 10438026 Qualified, heat-inactivated, USDA-approved regions
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C5080 BioXtra, ≥99.0%
Phosphate buffered saline Thermo Fisher Scientific 10010023 pH 7.4
Human umbilical vein endothelial cells Angio-Proteomie cAP-0001 Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)
GFP-expressing human umbilical vein endothelial cells Angio-Proteomie cAP-0001GFP GFP-Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cells (GFPHUVECs)
Endothelial cell growth medium Lonza CC-3162 EGM-2 BulletKit
Dulbecco’s Modified Eagle Medium  Thermo Fisher Scientific 12430054 High glucose, HEPES
Sylgard 184 silicone elastomer kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Clear 0.5 kg Kit
UV curing lamp system Excelitas Technologies OmniCure S2000 Spot UV Light Curing System with Intelligent UV Sensor

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Zhang, Y. S., Pi, Q., van Genderen, A. M. Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids. J. Vis. Exp. (126), e55957, doi:10.3791/55957 (2017).

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