Summary
我们提出了基于过滤的方案，以将高质量的细胞核与交联的小鼠骨骼肌分离，其中我们消除了超离心的需要，使其易于应用。我们显示从核制备的染色质适用于染色质免疫沉淀和可能的染色质免疫沉淀测序研究。
Abstract
染色质免疫沉淀（ChIP）是确定蛋白质结合染色质DNA的有效方法。然而，富含纤维的骨骼肌由于技术上难以隔离高质量的细胞核而且对肌原纤维的污染最小，因此一直是ChIP的挑战。以前的方案尝试在交联之前纯化细胞核，这导致在延长的细胞核制备过程中DNA-蛋白质相互作用发生改变的风险。在目前的方案中，我们首先交联从小鼠收集的骨骼肌组织，并将组织切碎并超声处理。由于我们发现超速离心不能使用交联肌肉组织将原核与肌原纤维分开，我们设计了一个顺序的过滤程序，以获得没有显着肌原纤维污染的高质量细胞核。我们随后使用超声波仪制备了染色质，并且使用抗BMAL1抗体的ChIP测定显示强大的昼夜节律结合目的基因启动子的BMAL1模式。该过滤方案构成了将高质量细胞核与交联骨骼肌组织隔离的一种易于应用的方法，允许对昼夜节律和其他时间敏感性研究进行一致的样品处理。结合下一代测序（NGS），我们的方法可以部署用于骨骼肌功能的各种机械和基因组研究。
Introduction
骨骼肌在生理和行为中起重要作用。多核肌纤维由肌原纤维组成，其中肌动蛋白和肌球蛋白形成称为sarcomeres的功能单位以产生收缩力。骨骼肌也是身体中最大的代谢器官，占餐后葡萄糖摄入量的80％以上，调节胰岛素反应和代谢体内平衡1,2 。肌肉生理和代谢受到昼夜节律钟的限制，内在的生物计时器3,4,5,6。例如， Bmal1的骨骼肌特异性缺失，核心昼夜节律钟成分之一，导致骨骼肌中胰岛素抵抗和葡萄糖摄取减少，发现动物发生2型糖尿病7 。一世此外，骨骼肌也越来越被认为是内分泌器官8 ，分泌肌动蛋白以调节全身代谢和生理学。机械研究需要完全了解骨骼肌中的这些调节功能。
ChIP是描述DNA结合蛋白启动子募集的有力方法。最初开发了ChIP以鉴定染色质DNA 9,10上的核小体组织。据报道，使用甲醛，硫酸二甲酯或紫外线照射（UV） 11,12来交联蛋白质和染色质DNA的各种方法。甲醛交联是最常用的，保存染色质结构和DNA-蛋白相互作用9,13,14 。交联色谱通过超声处理切片并用针对感兴趣的特定DNA结合蛋白15,16的抗体进行免疫沉淀。近年来，已经开发了ChIP-sequencing（ChIP-seq），一种将ChIP与NGS相结合的方法，用于询问全基因组转录因子结合17 ，并且在某些情况下监测时间过程18,19,20的动态变化。例如，昼夜节律ChIP-seq研究已经显示出昼夜节律时钟组分和组蛋白标记物的基因组结合的高度编排的序列，其在整个〜24小时昼夜循环中驱动时间上精确的基因表达18 。
大多数可用的ChIP协议设计用于软组织（ 例如肝，脑等 ），并且很少已经出版用于硬组织，包括ke伸肌在富含纤维的骨骼肌中均匀化并分离高质量细胞核21是技术上的挑战，特别是对于需要交联的ChIP实验。在最近的肌肉ChIP研究22中 ，卫星细胞与肌纤维分离，并且通过涉及组织消化的延长的过程从两种细胞类型制备细胞核。在分离的核上进行甲醛交联之前，整个过程需要大约三个小时才能完成。虽然这种方法避免了交联肌纤维，这使得肌肉组织更有效地进行高效均匀化，并且能够产生高质量的细胞核，但是从组织收集到细胞核交联的显着的时间滞后引起了DNA变化的风险蛋白质相互作用。相比之下，大多数研究在实验治疗或组织收集后立即进行交联，以保存实时DNA-蛋白质n约束12 。在交联前核分离的第二个缺点是它排除了时间敏感的应用，例如通常以3-4小时间隔发生的昼夜样本采集。没有交联核，分离需要在解剖后立即进行，而交联样品可以在整个时间过程完成后一起处理，从而确保更大的实验一致性。
还报道了与未交联的骨骼肌分离核的其它方案。两项研究描述了使用梯度超速离心将细胞核与剩余的肌原纤维和细胞碎片分开23,24 。虽然蔗糖或胶体梯度超速离心对未交联的肌肉组织有效，但我们的实验表明，交联后，梯度超速离心不能将细胞从细胞分离出来ebris在梯度上。
因此，我们开发了一种使用交联的小鼠骨骼肌组织分离高质量核的方法。而不是梯度超速离心，我们设计了一种串联过滤方法来有效地将细胞核与碎片分离。经超声处理后，染色质样品成功应用于ChIP研究，显示BMAL1蛋白与靶启动子结合的昼夜节律模式。我们的方法可以广泛适用于肌肉组织的各种机械研究。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
动物护理在机构动物护理和使用委员会（IACUC）指南下进行，并且程序是根据得克萨斯州休斯敦大学健康科学中心批准的动物方案进行的。
从交联骨骼肌中分离核
- 称重和切碎后肢骨骼肌，从大约20周龄的C57BL / 6雄性小鼠分离，在冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，如先前详细描述的22所述 。
注意：我们通常从一只小鼠获得1.0 - 1.5 g骨骼肌。- 将切碎的骨骼肌组织放入含有10mL PBS的50mL锥形管中。
- 在4℃下以300xg离心5分钟。
- 通过抽吸小心清除PBS上清液。
- 通过使用具有1,2,3和4mL水的参考管估计每个50mL管中的颗粒体积。
- 添加7卷冰冷的1％甲醛在PBS中，并使用探针组织匀浆器在冰上匀化样品（ 参见表材料 ）。
注意：可选：均质程序可在冷藏室进行。 - 通过在室温下孵育10分钟将样品交联。
- 通过加入1M甘氨酸使终浓度为0.125M的交联反应骤冷，并在室温下孵育5分钟。
- 在4℃下将样品以3,000xg离心5分钟。通过抽吸去除上清液。
- 用含有新鲜蛋白酶抑制剂（0.2mM苯甲基磺酰氟（PMSF））的10mL冰冷碱性缓冲液（pH7.3的10mM HEPES-KOH，10mM EDTA，10mM KCl，5mM MgCl 2，0.5mM DTT） ，和10μg/ mL亮抑酶肽）。在4℃下以3,000g离心5分钟，并通过抽吸小心地去除上清液。
- 将沉淀重悬于6mL裂解缓冲液（10mM HEPES-KOH，含有新鲜蛋白酶抑制剂（0.2mM PMSF和10μg/ mL亮抑酶肽）的H 7.3，10mM EDTA，10mM KCl，5mM MgCl 2，0.5mM DTT，1％Triton X-100）。
- 将样品转移到预先制备的15 mL Dounce匀浆器中，并在冰上孵育10分钟。在冰上均匀化每个样品，使用松散的杵进行15次缓慢的冲程，然后用紧密的杵将15次冲击以释放细胞核。
- 通过细胞过滤器（孔径：100μm）过滤匀浆（6 mL），并用4 mL裂解缓冲液冲洗。在4℃下将样品以1,000xg离心10分钟。重悬于5 mL冰冷的基础缓冲液中，用紧密的杵将其重复10次以释放细胞核。
- 用分光光度计（OD260 / OD280）取出20μL的DNA浓度测定等分试样，必要时用台盼蓝进行显微镜观察（见下文）（ 图 1A ）。
- 过滤悬浮液细胞过滤器（孔径：70μm），如上所述用2mL碱缓冲液再次冲洗管并过滤。
- 重复过滤步骤1.13，细孔过滤器逐渐减小孔径（40μm，30μm，20μm和10μm）。
注意：在步骤1.12-1.14中总共使用6孔径的过滤器。 - 在4℃下以1,000g离心10分钟。去除上清液，并将沉淀物重悬于500μL碱性缓冲液中。
- 测量如上所述的DNA浓度。
注意：从一只动物的两只后肢组合获得约200μg的核酸DNA。任选地，用台盼蓝染色（库存浓度0.4％，1:5稀释）显微镜观察保存20μL;核会染蓝色（ 图1B ）。 - 在4℃下以1,000g离心10分钟，弃上清。将沉淀物储存在-80°C。
超声处理
<OL>注：评估超声功效的实例如图2所示。
超声和定量评估
- 添加1.0μL的RNA酶A（500 U / mL RNA酶A：20,000 U / mL RNase T1）保存在50μL超声波样品中，37℃孵育30 min。
- 加入8μL蛋白酶K（10mg / mL），并在55℃下孵育30分钟。
- 通过DNA提取试剂盒收获DNA。
- 加入5卷结合缓冲液，应用于旋转柱，离心4,000 xg，10分钟。
- 将通过应用到同一列并再次离心。
- 用洗涤缓冲液洗涤两次，每次13,000 xg，1分钟。
- 离心再次以13,000 xg，1分钟干燥柱。
- 加入50μLH 2 O，离心13000 x g，1 min洗脱DNA。
- 将通过应用到同一列并再次离心。
- 用分光光度计（OD260 / OD280）定量DNA量。在0.8％凝胶上运行样品以评估超声产品的大小和量（1μg）（ 图2 ）。
注意：平均染色质产量约为〜20％。
ChIP
- 将以前保存的染色质在-80℃下解冻，并将染色质等分至〜100〜120μg/管。使用放射免疫沉淀测定（RIPA）缓冲液（20mM Tris-HCl（pH 7.4），150mM NaCl，1mM EDTA，1mM NaF，1mM Na 3 VO 4，1mM PMSF，1mM蛋白酶抑制剂混合物（PIC），0.1％脱氧胆酸盐w / v），1％Triton X-100）。
- 如果每组中有多个样品，则将等量的染色质DNA组合至最终量为100 - 120μg/样品。节省10％的输入。
- 加入BSA-pre-blocked（〜2 h，4℃）蛋白A / G琼脂糖（非鸡抗体）或IgY珠（鸡抗体）的40μL（RIPA缓冲液中的50％v / v浆液），并孵育在4℃下旋转3小时。
- 以1,000 xg，10分钟离心，小心地将上清液转移到新管中。
- 每1μg抗体加1μg抗体25-100μg染色质DNA。
- 以约15rpm在4℃下轻轻旋转过夜。
- 加入10μLBSA-预封闭（〜2 h，4°C）蛋白A / G琼脂糖（非鸡抗体）或IgY珠（鸡抗体）混合，并在冷藏室中旋转2 h。
- 洗珠如下。用1mL RIPA缓冲液洗涤3分钟两次，用1mL高盐缓冲液（20mM Tris-HCl（pH7.4），500mM NaCl，2mM EDTA，1mM PMSF，1％Triton X-100）洗涤3分钟两次，用1mL LiCl缓冲液（20mM Tris-HCl（pH7.4），250mM LiCl，2mM EDTA，1mM PMSF，1％脱氧胆酸钠，0.5％NP40）洗涤3分钟两次。
- 用1mL Tris-EDTA（TE）缓冲液（10mM Tris-HCl（pH7.4），1mM EDTA）洗涤3分钟一次。然后用洗脱缓冲液（20mM Tris-HCl，5mM EDTA和0.5％SDS）洗脱DNA。
- 以1,000 g离心1分钟，小心取出上清液。
- 用50μL洗脱缓冲液重悬珠。
- 孵化10min，65℃。
- 以12,000克离心5分钟。
- 将上清液转移到新管中，再加入50μL，再次以12,000 g离心5分钟。最终洗脱体积为100μL。
- 反向交联和DNA洗脱。
- 将洗脱的染色质在65℃孵育过夜。
- 加入1.0μLRNA酶A，37℃孵育30 min。
- 加入8μL蛋白酶K（10mg / mL），并在55℃下孵育30分钟。
- 通过使用PCR清洗试剂盒，根据制造商的方案，以50μL的洗脱体积收获DNA。
- 通过实时qPCR分析配置文件，如前所述25,26 。
注意：引物序列如图3所示 。数据以平均值±SEM表示（ 图3 ）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
这里我们在组织收集后立即进行甲醛交联，以保持实时的DNA-蛋白质相互作用。然而，我们发现通常用于细胞核分离的蔗糖或胶体梯度23,24在分离细胞核和肌原纤维方面无效（数据未显示）。原因可能是交联赋予核和肌原纤维相似的重力。因此，我们开发了一个串联过滤方法，以有效地从核部分去除大的肌原纤维和其他碎屑。经过100μm过滤后，仍有较大的组织碎屑和肌原纤维（ 图 1A ）。相比之下，在顺序过滤结束时，大部分大的组织碎片，完整的细胞和大的肌原纤维被成功地去除（ 图1B ）。
27或小鼠胚胎成纤维细胞（MEF） 28的超声处理，但在我们的经验中，它干扰了骨骼肌细胞核的超声处理，并导致广泛的涂片无效超声处理使用目前的方案，在SDS裂解缓冲液中悬浮后立即进行超声处理，我们观察到有效的超声处理与染色质以循环依赖的方式逐渐切碎，最终产生〜500bp的DNA片段（ 图2 ）。裂解缓冲液中的预孵育可以显着地破坏超声处理效率。
诈骗确定ChIP染色质制备的质量，我们检测了昼夜节律转录因子BMAL1的DNA结合，其分别在Zeitgeber时间（ZT）6和ZT18处显示结合峰和谷18,29。在ZT6和ZT18处收集C57B / 6J小鼠的骨骼肌样品，如上制备染色质样品。简言之，超声处理后，用BSA预先封闭的IgY珠粒预先清除切碎的染色质样品，然后在4℃下与抗BMAL1抗体孵育过夜。洗脱和纯化染色质后，我们进行RT-qPCR检测两个目标基因Nr1d1和Dbp 30的 E-Box元件上的BMAL1结合。我们检测到BMAL1与ZT6上的E盒元件的稳定结合，ZT18处的最小结合（ Nr1d1 ：0.452±0.022与0.039±0.002， Dbp -0.4：0.627±0.013对比0.062±0.009， Dbp+0.8：0.176±0.013对0.008±0.001， Dbp +2.4：0.466±0.010对0.122±0.014;所有值均为±SEM）（ 图3 ），验证了骨骼肌中时间敏感转录因子结合分析方案。
图1 ：顺序过滤有效去除组织碎片。 （A）在100μm过滤后显示样品的代表性图像。观察到大的组织和纤维碎片。 （B）连续过滤后显示样品的代表性图像。大纤维碎片被清除。仅观察到孤立的核和小肌原纤维碎片。使用10X，20X和40X放大倍数的光学显微镜拍摄照片。比例尺显示在右侧面板上。请点击此处查看此图的较大版本。
图2 ：通过10个循环超声处理逐步染色质粉碎。如在0.8％琼脂糖凝胶中显示的，将消化的染色质DNA超声处理至约500bp的10个循环，在150V下运行60分钟。右面板表示在冰冷的SDS裂解缓冲液中预孵育1小时后的较低的超声处理效率。 请点击此处查看此图的较大版本。
网络连接第3组：在ZT6和ZT18处收集的具有小鼠骨骼肌样品的BMAL1 ChIP的代表性qPCR结果。数据以平均值±SEM表示。 Dbp -0.4，+0.8和+2.4表示Dbp基因上E-Box元件的位置。 NC：IgY阴性对照。 BMAL1结合的时间模式与先前在ZT618周围显示BMAL1结合峰的结果一致。正向和反向引物如下。 Rev-erba：5'-GTAGACTACAAATCCCAACAATCCTG和5'-TGGAGCAGGTACCATGTGATTC; Dbp -0.4：5'-ACACCCGCATCCGATAGC和5'-CCACTTCGGGCCAATGAG; Dbp +0.8：5'-ATGCTCACACGGTGCAGACA和5'- CTGCTCAGGCACATTCCTCAT; Dbp +2.4：5'-TGGGACGCCTGGGTACAC和5'-GGGAATGTGCAGCACTGGTT。 请点击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在这里，我们描述了一种使用交联骨骼肌组织分离高质量细胞核的可靠方法。进行顺序过滤以有效地将细胞核与碎片分离，来自碟形换能器的超声波能量剪切染色质进行ChIP分析。结果显示BMAL1与靶启动子的昼夜节律时间特异性结合。
当交联发生时，ChIP可用于捕获基因组DNA上的实时蛋白质占用。为了利用这种潜力，我们旨在开发一种方法，允许在组织解剖时交叉骨骼肌，并简化细胞核分离而不进行梯度超速离心。由于与软组织如肝脏相比，纤维丰富的骨骼肌的均质化困难，我们在冰冷的PBS中切碎肌肉组织，然后将样品在甲醛缓冲液中匀化。淬火后，组织悬浮液离心并用冰冷的碱缓冲液冲洗，以清除任何剩余的甲醛。通过Dounce匀浆释放细胞核，依次过滤匀浆，逐渐去除细胞碎片和肌原纤维。我们设计了一系列过滤以最大限度地减少过滤器堵塞，这可能不利地影响产量。当顺序过滤完成时，只剩下非常短的肌原纤维。
超声处理和ChIP程序从以前的报告12中进行了改进，包括超声处理时间和SDS缓冲液量。碟形超声波清洗机允许在冷水浴中将玻璃小瓶中的样品暴露于集中式超声波。与探头超声波探头相比，该超声波发生器控制样品温度以避免过热，也可防止样品交叉污染。如果使用探针超声波仪器，则需要根据经验确定最佳超声波条件。我们也减少了t的SDS缓冲液，因为肌肉染色质的产量低于肝脏12 。几种方案28,31,32包括在超声处理之前在冰上或在室温下孵育。然而，根据我们的经验，在冰上预孵育没有提高超声处理效率。事实上，在某些情况下，超声处理受到损害。残留的肌原纤维可能在培养期间纠缠染色质DNA并减弱超声功能。在SDS裂解缓冲液中核悬浮后立即进行超声处理，我们成功地获得渐进的染色质片段化，增加超声波循环（ 图2 ）。
我们用ChIP qPCR验证了染色质的质量。 如图3所示，BMAL1启动子占有率在ZT6时是鲁棒的，在ZT18处是最小的，与先前显示的BMAL1大约一致dian启动子结合18 。该功能测定证实了核和染色质的质量。近年来，NGS的快速发展为ChIP应用开辟了新的视野，ChIP-seq可以高灵敏度定量询问基因组结合17 。特别是对于ChIP-seq，需要高质量的细胞核和染色质来一致地捕获蛋白质 - DNA相互作用。本文描述的程序可能构成使用骨骼肌的ChIP-seq研究的宝贵资源。值得注意的是，ChIP-seq库准备需要额外的措施来提高信号分辨率，如基于PAGE的尺寸选择18 。
总之，我们开发了一种基于过滤的方案，从交联骨骼肌制备高质量的细胞核。我们消除了超速离心的需要，使其易于应用。除了感兴趣的基因的ChIP，核和染色质如上所述，可以广泛适用于ChIP-seq研究。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
我们感谢Karyn Esser，Nobuya小池和Noheon Park提供有用的建议。这项工作部分由NIH / NIGMS（R01GM114424）向S.-HY和Robert A.Welch基金会（AU-1731）和NIH / NIA（R01AG045828）向ZC提供支持
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Fisher Scientific | 15250061 | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| Protease K | Sigma Aldrich | 3115887001 | |
| Chicken Anti-BMAL1 antibody | Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318 - 579, and IgY was affinity purified using the same antigen. | ||
| Chicken IgY Precipitating Resin | GenScript | L00405 | |
| Equipment | |||
| KINEMATICA Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-178 | |
| 15 mL Dounce tissue grinder | Whearton | 357544 | |
| Falcon Cell Strainers 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| Falcon Cell Strainers 70 µm | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Falcon Cell Strainers 40 µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| pluriStrainer 30 µm | PluriSelect | 43-50030-03 | |
| pluriStrainer 20 µm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| pluriStrainer 10 µm | PluriSelect | 43-50010-03 | |
| Covaris S2 Focused-ultrasonicator | Covaris | Model S2 | |
| Labquake | Thermo Scientific | C415110 | |
| CCD Microscope Camera | Leica Microsystems | DFC3000 G | |
| Reagent Kit | |||
| DNA extraction kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| Buffers | |||
| All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich |
References
- Bouzakri, K., et al. siRNA-based gene silencing reveals specialized roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in glucose and lipid metabolism in human skeletal muscle. Cell Metab. 4 (1), 89-96 (2006).
- Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J.
- Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets. Nat Chem Biol. 3 (10), 630-639 (2007).
- Harfmann, B. D., Schroder, E. A., Esser, K. A. Circadian rhythms, the molecular clock, and skeletal muscle. J Biol Rhythms. 30 (2), 84-94 (2015).
- Nohara, K., Yoo, S. H., Chen, Z. J. Manipulating the circadian and sleep cycles to protect against metabolic disease. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 35 (2015).
- Harfmann, B. D., et al. Muscle-specific loss of Bmal1 leads to disrupted tissue glucose metabolism and systemic glucose homeostasis. Skelet Muscle. 6, 12 (2016).
- Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Jackson, V. Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent. Cell. 15 (3), 945-954 (1978).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Takahashi, J. S., et al. ChIP-seq and RNA-seq methods to study circadian control of transcription in mammals. Methods Enzymol. 551, 285-321 (2015).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
- Chen, Z., Manley, J. L. Core promoter elements and TAFs contribute to the diversity of transcriptional activation in vertebrates. Mol Cell Biol. 23 (20), 7350-7362 (2003).
- Menet, J. S., Abruzzi, K. C., Desrochers, J., Rodriguez, J., Rosbash, M. Dynamic PER repression mechanisms in the Drosophila circadian clock: from on-DNA to off-DNA. Genes Dev. 24 (4), 358-367 (2010).
- Miki, T., Matsumoto, T., Zhao, Z., Lee, C. C. p53 regulates Period2 expression and the circadian clock. Nat Commun. 4, 2444 (2013).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Koike, N., et al. Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals. Science. 338 (6105), 349-354 (2012).
- Zhou, J., Yu, W., Hardin, P. E. ChIPping away at the Drosophila clock. Methods Enzymol. 551, 323-347 (2015).
- Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat Rev Genet. , (2016).
- Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L.
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Isolation of nuclei from skeletal muscle satellite cells and myofibers for use in chromatin immunoprecipitation assays. Methods Mol Biol. 798, 517-530 (2012).
- Wilkie, G. S., Schirmer, E. C. Purification of nuclei and preparation of nuclear envelopes from skeletal muscle. Methods Mol Biol. 463, 23-41 (2008).
- Hahn, C. G., Covault, J. Isolation of transcriptionally active nuclei from striated muscle using Percoll density gradients. Anal Biochem. 190 (2), 193-197 (1990).
- Jeong, K., et al. Dual attenuation of proteasomal and autophagic BMAL1 degradation in Clock Delta19/+ mice contributes to improved glucose homeostasis. Scientific reports. 5, 12801 (2015).
- Nohara, K., et al. Ammonia-lowering activities and carbamoyl phosphate synthetase 1 (Cps1) induction mechanism of a natural flavonoid. Nutrition & metabolism. 12, 23 (2015).
- Zhang, L., Rubins, N. E., Ahima, R. S., Greenbaum, L. E., Kaestner, K. H. Foxa2 integrates the transcriptional response of the hepatocyte to fasting. Cell Metab. 2 (2), 141-148 (2005).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
- Kondratov, R. V., et al. BMAL1-dependent circadian oscillation of nuclear CLOCK: posttranslational events induced by dimerization of transcriptional activators of the mammalian clock system. Genes Dev. 17 (15), 1921-1932 (2003).
- Ripperger, J. A., Schibler, U. Rhythmic CLOCK-BMAL1 binding to multiple E-box motifs drives circadian Dbp transcription and chromatin transitions. Nat Genet. 38 (3), 369-374 (2006).
- Laplante, M., et al. DEPTOR cell-autonomously promotes adipogenesis, and its expression is associated with obesity. Cell Metab. 16 (2), 202-212 (2012).
- Blechman, J., Amir-Zilberstein, L., Gutnick, A., Ben-Dor, S., Levkowitz, G. The metabolic regulator PGC-1alpha directly controls the expression of the hypothalamic neuropeptide oxytocin. J Neurosci. 31 (42), 14835-14840 (2011).
