Summary
Wij presenteren een protocol op basis van filtratie om hoogwaardige kernen te isoleren van de cross-linked museskeletspier waarbij we de behoefte aan ultracentrifugatie hebben verwijderd, waardoor het gemakkelijk toepasbaar is. We laten zien dat chromatine bereid uit de kernen geschikt is voor chromatine immunoprecipitatie en waarschijnlijk chromatin immunoprecipitatie sequencing studies.
Abstract
Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) is een krachtige methode om eiwitbinding aan chromatine DNA te bepalen. Vezelrijke skeletspier is echter een uitdaging voor ChIP door technische moeilijkheden in isolatie van hoogwaardige kernen met minimale verontreiniging van myofibrillen. Vorige protocollen hebben geprobeerd nuclei te zuiveren alvorens te verbinden, wat het risico op veranderde DNA-eiwitinteractie tijdens het langdurige nucleaire bereidingsproces oplevert. In het huidige protocol hebben we eerst het skeletspierweefsel dat uit muizen is verzameld, versterkt en de weefsels werden gehakt en gesoneerd. Aangezien we ontdekten dat ultracentrifugatie niet in staat was kernen uit myofibrillen te scheiden met behulp van verknoopt spierweefsel, hebben we een sequentiële filtratieprocedure ontwikkeld om kwalitatief hoogstaande kernen te verkrijgen zonder significante myofibrilverontreiniging. Vervolgens bereidden we chromatine door gebruik te maken van een ultrasonicator, en ChIP assays met anti-BMAL1 antilichaam onthulde robuuste circadiaanse bindingPatroon van BMAL1 om genpromotoren te targeten. Dit filtratieprotocol vormt een gemakkelijk toepasbare methode om kwalitatief hoogwaardige kernen te isoleren uit kruisgebonden skeletspierweefsel, waardoor consistente monstervoorbereiding voor circadiaanse en andere tijdgevoelige studies mogelijk is. In combinatie met volgende generatie sequencing (NGS) kan onze methode worden ingezet voor diverse mechanistische en genomische studies die zich richten op de spierfunctie.
Introduction
Skeletspieren spelen belangrijke rol in fysiologie en gedrag. De multi-nucleated spiervezel bestaat uit myofibrillen waar actine en myosine functionele eenheden vormen die sarcomeren noemen om contractiele kracht te genereren. Skeletspier is ook het grootste metabolische orgaan in het lichaam, met als resultaat> 80% postprandiale glucose-inname en het reguleren van insuline respons en metabolische homeostase 1 , 2 . Spierfysiologie en metabolisme worden nauw geregeld door de circadiaanse klok, een intrinsieke biologische timer 3 , 4 , 5 , 6 . Bijvoorbeeld, de skeletspierspecifieke deletie van Bmal1 , een van de kerncircadische klokcomponenten, resulteerde in insulineresistentie en verminderde glucoseopname in de skeletspier, en de dieren bleken type 2-diabetes te ontwikkelen 7 . ikN aanvulling wordt de skeletspier ook steeds meer gewaardeerd als een endocriene orgaan 8 , die myokines uitscheidt om systemisch metabolisme en fysiologie te reguleren. Mechanistische studies zijn nodig om deze regulerende functies in de skeletspieren volledig te begrijpen.
ChIP is een krachtige aanpak voor het werven van DNA-bindende eiwitten. ChIP werd aanvankelijk ontwikkeld om nucleosoomorganisatie op chromatine DNA 9 , 10 te identificeren. Verschillende methoden zijn sindsdien gemeld aan crosslink-eiwitten en chromatine-DNA met behulp van formaldehyde, dimethylsulfaat of ultraviolette bestraling (UV) 11 , 12 . Formaldehyde verknoping is de meest gebruikte, conserverende chromatine structuur en DNA-eiwit interacties 9 , 13 , 14 . Cross-linked chromatografieIn wordt gesnipperd door sonicatie en immunoprecipiteerd met antilichaam tegen het specifieke DNA bindende eiwit van belang 15 , 16 . In de afgelopen jaren is ChIP-sequencing (ChIP-seq), een methode die ChIP combineert met NGS, ontwikkeld om genoom-brede transcriptiefactorbinding 17 te ondervragen en in sommige gevallen dynamische veranderingen te bewaken over een tijdschool 18 , 19 , 20 . Bijvoorbeeld hebben circadiaanse ChIP-seq-studies een zeer georkestreerde sequentie van genomische binding van circadiaanse klokcomponenten en histonmarkers aangetoond, die tijdelijk nauwkeurige genexpressie in de 24 uur circadiacyclus 18 verricht .
De meeste beschikbare ChIP-protocollen zijn ontworpen voor zachte weefsels ( bijv. Lever, hersenen, enz. ) En zeer weinig zijn gepubliceerd voor harde weefsels, waaronder skeleTal spier. Het is technisch uitdagend om vezelrijke skeletspieren te homogeniseren en hoogwaardige kernen 21 te isoleren, vooral voor ChIP-experimenten die kruisverbindingen vereisen. In een recente ChIP-studie 22 van de spier werden satellietcellen gescheiden van myofibers, en kernen werden bereid uit beide celtypes door middel van een langdurige procedure waarbij weefselvertering bestond. Het gehele proces duurde ongeveer drie uur om te voltooien voordat formaldehyde verknoping werd uitgevoerd op geïsoleerde kernen. Terwijl deze procedure vermijdt spiervezels crosslinken, waardoor spierweefsel nog meer vuurvast is tegen efficiënte homogenisatie en in staat was hoge kwaliteitskernen te produceren, veroorzaakt de significante tijdsverlaging van weefselverzameling naar nucleïne-crosslinking het risico op veranderd DNA -proteïne interactie. In tegenstelling hiermee hebben de meeste studies onmiddellijk na experimentele behandeling of weefselverzameling crosslinking uitgevoerd om de real-time DNA-protei te behoudenN bindend 12 . Een tweede nadeel van nucleïneisolatie voor kruisverbindingen is dat het tijdsgevoelige toepassingen voorkomt, zoals circadiaanvangsverzameling die typisch voorkomt bij intervallen van 3 - 4 uur. Zonder de kernen te verbinden, moet de isolatie direct na dissectie doorgaan, terwijl de cross-linked monsters samen kunnen worden verwerkt nadat de volledige tijdsoort is afgerond, waardoor de experimentele consistentie groter wordt.
Andere protocollen voor nucleïneisolatie van ongekruiste skeletspier zijn ook gemeld. Twee studies beschrijven het gebruik van gradiënt-ultracentrifugatie om scheidende kernen te scheiden van overgebleven myofibrillen en celresten 23 , 24 . Terwijl sukrose of colloïdale gradiënt ultracentrifugatie effectief is met ongekruiste spierweefsels, hebben onze experimenten aangetoond dat na de verknoping van de gradiënt de gradiënt ultracentrifugatie niet in staat was kernen van cel d te scheidenEbris op de gradiënt.
We hebben daarom een procedure ontwikkeld om kwalitatief hoogwaardige kernen te isoleren met behulp van kruisgebonden spierweefsels van het skelet. In plaats van de ultracentrifugatie van de gradiënt, hebben we een seriefiltreringsmethode ontwikkeld om de kernen van puin effectief te scheiden. Na ultrasonicatie werden de chromatinmonsters succesvol toegepast voor ChIP-studies, die een circadiaan patroon van BMAL1-eiwitbinding aan doelpromotors toonden. Onze methode kan breed toepasselijk zijn op diverse mechanistische studies van spierweefsels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierenzorg werd uitgevoerd in het kader van de richtlijnen voor de instandhouding van dierenartsen en gebruikscommissie (IACUC), en de procedures werden uitgevoerd volgens een dierprotocol dat door het University of Texas Health Science Center in Houston is goedgekeurd.
1. Nucleaire isolatie van de cross-linked skeletspier
- Weef- en maalvleesklier-skeletspier, geïsoleerd uit ongeveer 20 weken oude C57BL / 6 mannelijke muizen, in ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zoals eerder beschreven in het voorgaande 22 .
OPMERKING: We krijgen meestal 1,0 - 1,5 g skeletspier van één muis.- Plaats gemalen skeletspierweefsel in een 50 ml conische buis die 10 ml PBS op ijs bevat.
- Centrifugeer bij 300 xg bij 4 ° C gedurende 5 minuten.
- Verwijder PBS supernatant zorgvuldig door aspiratie.
- Schat pelletvolume in elke 50 ml buis door gebruik te maken van referentiebuizen met 1, 2, 3 en 4 ml water.
- Voeg 7 volumes vanIjskoud 1% formaldehyde in PBS en homogeniseer de monsters op ijs met behulp van een sondeweefselhomogenisator (zie tabel van materialen ).
OPMERKING: Optioneel: De homogenisatieprocedure kan in een koude kamer worden uitgevoerd. - Verbind het monster door incuberen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Blus de kruisverbindingsreactie door de toevoeging van 1 M glycine tot een uiteindelijke concentratie van 0,125 M en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer de monsters bij 3 000 xg gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder de supernatant via aspiratie.
- Spoel met 10 ml ijskoude base buffer (10 mM HEPES-KOH bij pH 7,3, 10 mM EDTA, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT) bevattende vers toegevoegde proteaseremmers (0,2 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) , En 10 ug / ml leupeptine). Centrifugeer bij 3 000 g gedurende 5 min bij 4 ° C en verwijder het supernatant zorgvuldig door aspiratie.
- Resuspendeer de pellet in 6 ml lysisbuffer (10 mM HEPES-KOH op pH 7,3, 10 mM EDTA, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 1% Triton X-100) die vers toegevoegde protease remmers bevatten (0,2 mM PMSF en 10 ug / ml leupeptine).
- Breng het monster over naar een voorverpakte 15 mL Dounce homogenizer en incubeer 10 minuten op ijs. Ontleed elk monster op ijs met 15 trage strepen met losse stamper, gevolgd door 15 strepen met strakke stamper om de kernen vrij te geven.
- Filtreer het homogenaat (6 ml) door de celfilter (poriegrootte: 100 μm) en spoel met 4 ml lysisbuffer. Centrifugeer de monsters bij 1000 xg gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Resuspendeer in 5 ml ijskoude basisbuffer en doei 10 keer met strakke stamper om kernen vrij te geven.
- Verwijder een aliquot van 20 μL voor DNA-concentratiemeting met een spectrofotometer (OD260 / OD280) en microscopische observatie met trypanblauw indien nodig (zie hieronder) ( Figuur 1A ).
- Filter de ophanging doorEen celsuur (poriënmaat: 70 μm), spoel de buis af en filter opnieuw met 2 ml base buffer zoals hierboven.
- Herhaal de filtratie zoals in stap 1.13 met cilinders van geleidelijk gereduceerde poriegrootte (40 μm, 30 μm, 20 μm en 10 μm).
OPMERKING: In totaal werden stromers met 6 poriëngroottes gebruikt in stappen 1.12-1.14. - Centrifugeer bij 1000 g bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Verwijder supernatant en resuspendeer de pellet in 500 μl base buffer.
- Meet de DNA-concentratie zoals hierboven.
OPMERKING: Ongeveer 200 μg nucleair DNA werd verkregen uit het combineren van beide achterste ledematen van één dier. Optioneel, bespaar 20 μL voor microscopische observatie met trypan blue staining (voorraadconcentratie 0,4%, 1: 5 verdunning); Kernen zullen blauw vlek ( figuur 1 B ). - Centrifugeer bij 1000 g bij 4 ° C gedurende 10 minuten en wrijf de supernatant af. Bewaar pellet bij -80 ° C.
2. Sonication
<ol>OPMERKING: een voorbeeld voor het evalueren van de efficiëntie van de geluidsisolatie wordt weergegeven in figuur 2 .
3. Evaluatie van Sonication en Quantitation
- Voeg 1.0 toeΜL RNase A (500 U / ml RNase A: 20.000 U / ml RNase T1) aan de opgeslagen 50 μl gesoneerde monsters en incuberen gedurende 30 min bij 37 ° C.
- Voeg 8 μl protease K (10 mg / ml) toe en incubeer 30 min bij 55 ° C.
- Oog het DNA door gebruik te maken van een DNA-extractie kit.
- Voeg 5 volumes bindende buffer toe, doe het aan de spoelkolom en centrifugeer bij 4.000 xg, 10 min.
- Breng de doorgang door op dezelfde kolom en centrifugeer opnieuw.
- Was met wasbuffer tweemaal bij 13.000 xg, 1 min.
- Centrifugeer opnieuw bij 13.000 xg, 1 min om de kolom te drogen.
- Voeg 50 μl H20 toe en centrifuge bij 13.000 xg, 1 min om DNA te elueren.
- Breng de doorgang door op dezelfde kolom en centrifugeer opnieuw.
- Kwantificeer de hoeveelheid DNA met een spectrofotometer (OD260 / OD280). Doe monsters op 0,8% gels om de grootte en hoeveelheid (1 μg) van de geonicideerde producten te beoordelen ( Figuur 2 ).
OPMERKING: De gemiddelde chromatine opbrengst is ongeveer ~ 20%.
4. ChIP
- Doe de eerder opgeslagen chromatine op -80 ° C en doei de chromatine tot ~ 100 - 120 μg per buis. Verdun 1:10 met radioimmunoprecipitatietest (RIPA) buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 1x Protease-inhibitorcocktail (PIC), 0,1% Na-deoxycholaat W / v), 1% Triton X-100).
- Als er meerdere monsters in elke groep zijn, combineer u gelijke hoeveelheden chromatine DNA tot de uiteindelijke hoeveelheid van ~ 100 - 120 μg / monster. Bespaar 10% als invoer.
- Voeg 40 μL (50% v / v slurry in RIPA buffer) toe van BSA-voorgeblokkeerde (~ 2 uur, 4 ° C) Proteïne A / G agarose (niet-Kip antilichaam) of IgY kralen (Kip antilichaam) en incubeer op Een rotator gedurende 3 uur bij 4 ° C.
- Centrifugeer bij 1.000 xg, 10 minuten en zorg voorzichtig over de supernatant naar nieuwe buizen.
- Antilichamen toevoegen aan 1 μg antilichaam per ~25 - 100 μg chromatine DNA.
- Draai zachtjes bij 4 ° C overnacht bij ongeveer 15 rpm.
- Voeg 10 μl BSA-voorgeblokkeerde (~ 2 uur, 4 ° C) eiwit A / G agarose (non-Chicken antilichaam) of IgY-kralen (Kippen-antilichaam) mengen en draai in de koude kamer gedurende 2 uur.
- Was kralen als volgt. Wassen met 1 ml RIPA-buffer gedurende 3 minuten tweemaal, wassen met 1 ml hoge zoutbuffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% Triton X-100) gedurende 3 min. , Wassen met 1 ml LiCl-buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 250 mM LiCl, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% Na-deoxycholaat, 0,5% NP40) gedurende 3 min.
- Was gedurende 1 minuut met 1 ml Tris-EDTA (TE) buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA). Dan eluteer DNA met elueringsbuffer (20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA en 0,5% SDS).
- Centrifugeer bij 1.000 g, 1 min en verwijder de supernatant zorgvuldig.
- Resuspendeer de kraal met 50 μl elutiebuffer.
- Incubeer voor 10Min bij 65 ° C.
- Centrifugeer bij 12.000 g gedurende 5 minuten.
- Breng de supernatant over naar een nieuwe buis, voeg nog eens 50 μL toe en centrifugeer nog eens bij 12.000 g gedurende 5 minuten. Het uiteindelijke elutie volume zal 100 μl zijn.
- Reverse crosslinking en DNA-elutie.
- Incubeer het geëlueerde chromatine overnacht bij 65 ° C.
- Voeg 1,0 μl RNase A toe en incubeer gedurende 30 min bij 37 ° C.
- Voeg 8 μl protease K (10 mg / ml) toe en incubeer 30 min bij 55 ° C.
- Oog het DNA door gebruik te maken van een PCR opruimingsset met elutievolume bij 50 μL volgens het protocol van de fabrikant.
- Analyseer de profielen met real-time qPCR zoals eerder beschreven 25 , 26 .
OPMERKING: De primer sequenties staan in figuur 3 legenda . Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM ( Figuur 3 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier hebben we onmiddellijk na het weefselverzameling formaldehyde-cross-linking uitgevoerd om real-time DNA-eiwit interactie te behouden. We vonden echter dat sucrose of colloïdale gradiënt, die gewoonlijk wordt gebruikt voor nucleïne-isolatie 23 , 24 , niet effectief was bij het scheiden van kernen uit myofibrillen (gegevens niet getoond). De oorzaak kan zijn dat crosslinking dezelfde zwaartekracht verleent aan kernen en myofibrillen. Daarom ontwikkelden we een seriefiltratieproces om effectief grote myofibrillen en andere rommel uit de kernfractie effectief te verwijderen. Na 100 μm filtratie waren er nog steeds grote weefselresten en myofibrillen ( Figuur 1 A ). Ter vergelijking, aan het eind van de opeenvolgende filtratie, werden de meeste grote weefselresten, intacte cellen en grote myofibrillen succesvol verwijderd ( Figuur 1 B ).
27 of muizenembryonale fibroblast (MEF) 28 , in onze ervaring heeft het interfereren met sonicatie van skeletspierkernen en resulteerde in brede verkleuring, wat aangeeft Ineffectieve sonicatie. Door gebruik te maken van het huidige protocol met onmiddellijke sonicatie na suspensie in SDS lysisbuffer, waargenomen efficiënte sonicatie met chromatine geleidelijk op cyclusafhankelijke wijze geknipperd en uiteindelijk 500 bp DNA-fragmenten produceren ( Figuur 2 ). Pre-incubatie in de lysisbuffer heeft de efficiëntie van de sonicatie op significante wijze aangetast.
Om te conDe kwaliteit van de chromatinpreparatie voor ChIP bevestigen, hebben we DNA-binding van de circadiaire transcriptiefactor BMAL1 onderzocht, die bindende piek en trog bij Zeitgeber-tijd (ZT) 6 en ZT18 respectievelijk 18 , 29 vertoonden. Skeletspiermonsters uit C57B / 6J-muizen werden verzameld bij ZT6 en ZT18, en chromatinemonsters werden bereid zoals hierboven. Kort na na het soniceren werden gescheurde chromatine monsters vooraf gescreend met IgY kralen die vooraf geblokkeerd zijn met BSA gevolgd door incubatie met anti-BMAL1 antilichaam bij 4 ° C overnacht. Na elutie en zuivering van chromatine, hebben we RT-qPCR uitgevoerd om BMAL1 binding op E-Box elementen van twee doelgenen, Nr1d1 en Dbp 30 te detecteren . We hebben robuuste binding van BMAL1 gedetecteerd op de E-box elementen bij ZT6 en minimale binding bij ZT18 ( Nr1d1 : 0,452 ± 0,022 versus 0,039 ± 0,002, Dbp -0,4: 0,627 ± 0,013 versus 0,062 ± 0,009, Dbp+0,8: 0,176 ± 0,013 vs. 0,008 ± 0,001, Dbp +2,4: 0,466 ± 0,010 vs. 0,122 ± 0,014; Alle waarden zijn gemeen ± SEM) ( Figuur 3 ), het valideren van het protocol voor tijdgevoelige transcriptiefactor bindende analyse in de skeletspier.
Figuur 1 : Sequentiele Filtrering Effectief Verwijderd Weefsel Debris. (A) Representatieve beelden die monsters tonen na 100 μm filtratie. Groot weefsel en vezel rommel worden waargenomen. (B) Representatieve beelden die monsters tonen na seriële filtratie. Grote vezelafval werden verwijderd. Alleen geïsoleerde kernen en kleine myofibrilfragmenten worden waargenomen. Foto's werden genomen met behulp van een lichtmicroscoop bij 10X, 20X en 40X magnifications. Schaalstaven worden getoond aan de rechterkant van de panelen.Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2 : Progressieve Chromatinvergroting via 10 cycli van Sonication. Tien cycli van sonicatie met verteerd chromatine-DNA tot ~ 500 bp, zoals geopenbaard in een 0,8% agarosegel, rijdt bij 150 V gedurende 60 minuten. Het rechter paneel duidt op een lagere sonication efficiëntie na pre-incubatie in ijskoude SDS lysis buffer gedurende 1 uur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
FiGure 3 : Representatieve qPCR resultaten voor BMAL1 ChIP met muisskeletspiermonsters verzameld bij ZT6 en ZT18. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Dbp -0.4, +0.8 en +2.4 wijzen op locaties van de E-Box elementen op het Dbp gen. NC: negatieve controle met IgY. Het tijdelijke patroon van BMAL1 binding is consistent met eerdere resultaten die BMAL1 bindende piek bij rond ZT6 18 tonen . De voorwaartse en omgekeerde primers zijn als volgt. Rev-erba: 5'-GTAGACTACAAATCCCAACAATCCTG, en 5'-TGGAGCAGGTACCATGTGATTC; Dbp -0,4: 5'-ACACCCGCATCCGATAGC en 5'-CCACTTCGGGCCAATGAG; Dbp +0,8: 5'- ATGCTCACACGGTGCAGACA, en 5'-CTGCTCAGGCACATTCCTCAT; Dbp +2,4: 5'- TGGGACGCCTGGGTACAC, en 5'- GGGAATGTGCAGCACTGGTT. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een robuuste methode waarbij crosslinked skeletspierweefsels werden gebruikt om hoge kwaliteit kernen te isoleren. Sequentiële filtratie werd uitgevoerd om de kernen effectief te scheiden van puin en ultrasone akoestische energie van schotelvormige transducer scheurde de chromatine voor ChIP analyse. De resultaten toonden circadia-tijdspecifieke binding van BMAL1 aan doelpromotoren.
ChIP kan worden gebruikt om real-time eiwit bezetting op genomisch DNA vast te leggen wanneer kruisverbindingen plaatsvinden. Om te profiteren van dit potentieel, streven we ernaar een methode te ontwikkelen om kruisbinding van de skeletspier toe te passen op het moment van weefseldissectie en om de nucleïneisolatie te stroomlijnen zonder ultracentrifugatie van de gradiënt. Vanwege de moeilijkheid van homogeniseren van vezelrijke skeletspieren in vergelijking met zachte weefsels zoals lever, hebben we spierweefsel in ijskoud PBS gehakt en het monster vervolgens in een formaldehydebuffer gehomogeniseerd. Na het blussen, weefsel suspensie waS gecentrifugeerd en gespoeld met ijskoude basisbuffer om eventuele resterende formaldehyde te spoelen. Nuclei werden vrijgegeven door Dounce-homogenisatie, en de homogenaten werden achtereenvolgens gefiltreerd om geleidelijk de celafval en myofibrillen te verwijderen. We hebben de reeks filtratie ontworpen om filter verstopping te minimaliseren, die de opbrengst nadelig zou kunnen beïnvloeden. Alleen zeer korte myofibrillen bleven wanneer de sequentiële filtratie werd voltooid.
De sonication- en ChIP-procedures werden aangepast uit een eerdere rapport 12 met modificaties inclusief sonication timing en SDS buffer hoeveelheid. De schotelvormige sonicator zorgt voor blootstelling aan gecentraliseerde ultrasone golf voor monsters in glazen flesjes in een koud waterbad. Vergeleken met probe sonicators, deze sonicator controleert de monster temperatuur om oververhitting te vermijden, en voorkomt ook kruisverontreiniging van het monster. Als probe sonicators worden gebruikt, moeten optimale sonicatie condities empirisch worden bepaald. We hebben ook de amoun verminderdT van SDS buffer omdat de opbrengst van spierchromatine lager is dan in lever 12 . Verscheidene protocollen 28 , 31 , 32 omvatten incubatie op ijs of bij kamertemperatuur voorafgaand aan sonicatie. In onze ervaring heeft de pre-incubatie op ijs echter niet de efficiëntie van de sonication verbeterd. In feite was de sonication in sommige gevallen gecompromitteerd. Het is mogelijk dat residuele myofibrillen het chromatine-DNA verstrikt raken tijdens incubatie en verzwakte sonicatie-werkzaamheid. Met onmiddellijke sonicatie na nucleus-suspensie in SDS-lysisbuffer slaagden we erin om progressieve chromatinfragmentatie te verkrijgen met toenemende sonicatiecycli ( Figuur 2 ).
Wij valideren de kwaliteit van chromatine met ChIP qPCR. Zoals getoond in Figuur 3 was de bezettingsgraad BMAL1-promotor robuust bij ZT6 en minimaal bij ZT18, consistent met eerder weergegeven BMAL1 circaDian promotor binding 18 . Deze functionele test bevestigde de kwaliteit van kernen en chromatine. In de afgelopen jaren heeft de snelle ontwikkeling in NGS een nieuwe horizon geopend voor ChIP-applicatie, waarbij ChIP-seq kwantitatief de genomische binding met hoge gevoeligheid 17 kan ondervragen. Voornamelijk voor ChIP-seq zijn kwalitatief hoogstaande kernen en chromatine nodig om de eiwit-DNA-interactie consequent vast te leggen. De hierin beschreven procedure kan een waardevolle bron vormen voor ChIP-seq studies met behulp van skeletspier. Van opmerking vereist ChIP-seq-bibliotheekvoorbereiding extra maatregelen om de signaaloplossing te verbeteren, zoals PAGE-based size selection 18 .
Ten slotte ontwikkelden we een protocol gebaseerd op filtratie om hoogwaardige kernen uit kruisgebonden skeletspier te bereiden. We verwijderen de behoefte aan ultracentrifugatie, waardoor het gemakkelijk toepasbaar is. Naast ChIP voor genen die interessant zijn, worden de kernen en chromatine prEpared zoals beschreven kan in grote mate van toepassing zijn op ChIP-seq studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We bedanken Karyn Esser, Nobuya Koike en Noheon Park voor behulpzaam advies. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH / NIGMS (R01GM114424) aan S.-HY, en de Robert A. Welch Foundation (AU-1731) en NIH / NIA (R01AG045828) naar ZC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Fisher Scientific | 15250061 | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| Protease K | Sigma Aldrich | 3115887001 | |
| Chicken Anti-BMAL1 antibody | Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318 - 579, and IgY was affinity purified using the same antigen. | ||
| Chicken IgY Precipitating Resin | GenScript | L00405 | |
| Equipment | |||
| KINEMATICA Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-178 | |
| 15 mL Dounce tissue grinder | Whearton | 357544 | |
| Falcon Cell Strainers 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| Falcon Cell Strainers 70 µm | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Falcon Cell Strainers 40 µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| pluriStrainer 30 µm | PluriSelect | 43-50030-03 | |
| pluriStrainer 20 µm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| pluriStrainer 10 µm | PluriSelect | 43-50010-03 | |
| Covaris S2 Focused-ultrasonicator | Covaris | Model S2 | |
| Labquake | Thermo Scientific | C415110 | |
| CCD Microscope Camera | Leica Microsystems | DFC3000 G | |
| Reagent Kit | |||
| DNA extraction kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| Buffers | |||
| All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich |
References
- Bouzakri, K., et al. siRNA-based gene silencing reveals specialized roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in glucose and lipid metabolism in human skeletal muscle. Cell Metab. 4 (1), 89-96 (2006).
- Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J.
- Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets. Nat Chem Biol. 3 (10), 630-639 (2007).
- Harfmann, B. D., Schroder, E. A., Esser, K. A. Circadian rhythms, the molecular clock, and skeletal muscle. J Biol Rhythms. 30 (2), 84-94 (2015).
- Nohara, K., Yoo, S. H., Chen, Z. J. Manipulating the circadian and sleep cycles to protect against metabolic disease. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 35 (2015).
- Harfmann, B. D., et al. Muscle-specific loss of Bmal1 leads to disrupted tissue glucose metabolism and systemic glucose homeostasis. Skelet Muscle. 6, 12 (2016).
- Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Jackson, V. Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent. Cell. 15 (3), 945-954 (1978).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Takahashi, J. S., et al. ChIP-seq and RNA-seq methods to study circadian control of transcription in mammals. Methods Enzymol. 551, 285-321 (2015).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
- Chen, Z., Manley, J. L. Core promoter elements and TAFs contribute to the diversity of transcriptional activation in vertebrates. Mol Cell Biol. 23 (20), 7350-7362 (2003).
- Menet, J. S., Abruzzi, K. C., Desrochers, J., Rodriguez, J., Rosbash, M. Dynamic PER repression mechanisms in the Drosophila circadian clock: from on-DNA to off-DNA. Genes Dev. 24 (4), 358-367 (2010).
- Miki, T., Matsumoto, T., Zhao, Z., Lee, C. C. p53 regulates Period2 expression and the circadian clock. Nat Commun. 4, 2444 (2013).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Koike, N., et al. Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals. Science. 338 (6105), 349-354 (2012).
- Zhou, J., Yu, W., Hardin, P. E. ChIPping away at the Drosophila clock. Methods Enzymol. 551, 323-347 (2015).
- Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat Rev Genet. , (2016).
- Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L.
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Isolation of nuclei from skeletal muscle satellite cells and myofibers for use in chromatin immunoprecipitation assays. Methods Mol Biol. 798, 517-530 (2012).
- Wilkie, G. S., Schirmer, E. C. Purification of nuclei and preparation of nuclear envelopes from skeletal muscle. Methods Mol Biol. 463, 23-41 (2008).
- Hahn, C. G., Covault, J. Isolation of transcriptionally active nuclei from striated muscle using Percoll density gradients. Anal Biochem. 190 (2), 193-197 (1990).
- Jeong, K., et al. Dual attenuation of proteasomal and autophagic BMAL1 degradation in Clock Delta19/+ mice contributes to improved glucose homeostasis. Scientific reports. 5, 12801 (2015).
- Nohara, K., et al. Ammonia-lowering activities and carbamoyl phosphate synthetase 1 (Cps1) induction mechanism of a natural flavonoid. Nutrition & metabolism. 12, 23 (2015).
- Zhang, L., Rubins, N. E., Ahima, R. S., Greenbaum, L. E., Kaestner, K. H. Foxa2 integrates the transcriptional response of the hepatocyte to fasting. Cell Metab. 2 (2), 141-148 (2005).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
- Kondratov, R. V., et al. BMAL1-dependent circadian oscillation of nuclear CLOCK: posttranslational events induced by dimerization of transcriptional activators of the mammalian clock system. Genes Dev. 17 (15), 1921-1932 (2003).
- Ripperger, J. A., Schibler, U. Rhythmic CLOCK-BMAL1 binding to multiple E-box motifs drives circadian Dbp transcription and chromatin transitions. Nat Genet. 38 (3), 369-374 (2006).
- Laplante, M., et al. DEPTOR cell-autonomously promotes adipogenesis, and its expression is associated with obesity. Cell Metab. 16 (2), 202-212 (2012).
- Blechman, J., Amir-Zilberstein, L., Gutnick, A., Ben-Dor, S., Levkowitz, G. The metabolic regulator PGC-1alpha directly controls the expression of the hypothalamic neuropeptide oxytocin. J Neurosci. 31 (42), 14835-14840 (2011).
