Summary
Vi presenterer en filtreringsbasert protokoll for å isolere høykvalitets kjerner fra tverrbundet muskelskjelettmuskulatur hvor vi fjernet behovet for ultracentrifugering, noe som gjør det lett å anvende. Vi viser at kromatin fremstilt fra kjernene er egnet for kromatinimmunpresipitasjon og sannsynligvis kromatinimmunpresipitationssekvenseringsstudier.
Abstract
Kromatinimmunutfelling (ChIP) er en kraftig metode for å bestemme proteinbindingen til kromatin-DNA. Fiberrik skjelettmuskulatur har imidlertid vært en utfordring for ChIP på grunn av tekniske vanskeligheter i isolasjon av kjerne av høy kvalitet med minimal forurensning av myofibriller. Tidligere protokoller har forsøkt å rense kjerner før kryssbinding, noe som medfører risikoen for endret DNA-proteininteraksjon under den langvarige kjernepreparasjonsprosessen. I den nåværende protokollen krysset vi først skjelettmuskulaturvevet oppsamlet fra mus, og vevene ble hakket og sonikert. Siden vi fant at ultracentrifugering ikke var i stand til å separere kjerner fra myofibriller ved å bruke tverrbundet muskelvev, utviklet vi en sekventiell filtreringsprosedyre for å oppnå kvalitetskjerner uten betydelig myofibrilforurensning. Vi forberedte deretter kromatin ved å bruke en ultralydator, og ChIP-analyser med anti-BMAL1-antistoff avslørte robust sirkadisk bindingMønster av BMAL1 for å målrette genpromotorer. Denne filtreringsprotokollen utgjør en lett anvendelig metode for å isolere høykvalitets kjerner fra tverrbundet skjelettmuskulaturvev, slik at konsistent prosessbehandling for sirkadian og andre tidsfølsomme studier blir mulig. I kombinasjon med neste generasjons sekvensering (NGS) kan vår metode bli distribuert for ulike mekaniske og genomiske studier med fokus på skjelettmuskulaturfunksjon.
Introduction
Skeletmuskulaturen spiller viktige roller i fysiologi og oppførsel. Den multikernerte muskelfibre består av myofibriller hvor aktin og myosin danner funksjonelle enheter kalt sarkomerer for å generere kontraktilitet. Skjelettmuskulatur er også det største metabolske organet i kroppen, og står for> 80% postprandial glukoseinntak og regulerer insulinrespons og metabolisk homeostase 1 , 2 . Muskelfysiologi og metabolisme er nøye regulert av sirkadisk klokke, en egen biologisk tidsur 3 , 4 , 5 , 6 . For eksempel resulterte den skjelettmuskelspecifikke deletjonen av Bmal1 , en av kjernens sirkadiske klokomponenter , til insulinresistens og redusert glukoseopptak i skjelettmuskulaturen, og dyrene ble funnet å utvikle type 2-diabetes 7 . JegN tillegg blir skjelettmuskulaturen i stigende grad verdsatt som et endokrin organ 8 , som utskiller myokiner for å regulere systemisk metabolisme og fysiologi. Mekanistiske studier er nødvendig for å forstå disse regulatoriske funksjonene i skjelettmuskulaturen fullt ut.
ChIP er en kraftig tilnærming til å avgrense promotorrekruttering av DNA-bindingsproteiner. ChIP ble opprinnelig utviklet for å identifisere nukleosom organisasjon på kromatin DNA 9 , 10 . En rekke metoder har siden blitt rapportert til tverrbindingsproteiner og kromatin-DNA ved bruk av formaldehyd, dimetylsulfat eller ultraviolett bestråling (UV) 11 , 12 . Formaldehyd-kryssbinding er den mest brukte, konserverende kromatinstrukturen og DNA-protein-interaksjonene 9 , 13 , 14 . Tverrbundet kromatografiIn blir revet av sonikering og immunutfellet med antistoff mot det spesielle DNA-bindende protein av interesse 15 , 16 . I de senere år har ChIP-sekvensering (ChIP-seq), en metode kombinert med ChIP med NGS, blitt utviklet for å forhøre genomfattende transkripsjonsfaktorbinding 17 og i noen tilfeller for å overvåke dynamiske endringer over et tidsforløp 18 , 19 , 20 . For eksempel har sirkidiske ChIP-seq-studier avslørt en svært orkestrert sekvens av genomisk binding av sirkadiske klokomponenter og histon-markører, som driver temporært nøyaktig genuttrykk gjennom hele 24-timers sirkadisk syklus 18 .
De fleste tilgjengelige ChIP-protokoller er laget for myke vev ( f.eks. Lever, hjerne, etc. ), og svært få har blitt publisert for hardt vev inkludert skeleTal muskler. Det er teknisk utfordrende å homogenisere fiberrik skjelettmuskulatur og isolere høykvalitets kjerner 21 , spesielt for ChIP-eksperimenter som krever kryssbinding. I en nylig muskel-ChIP-studie 22 ble satellittceller separert fra myofibere, og kjerner ble fremstilt fra begge celletyper gjennom en forlenget prosedyre som involverer vevsfordøyelse. Hele prosessen tok omtrent tre timer å fullføre før formaldehyd-kryssbinding ble utført på isolerte kjerner. Mens denne prosedyren unngikk å krysse sammen muskelvev, noe som gjør muskelvevet enda mer ildfast mot effektiv homogenisering, og var i stand til å produsere høykvalitets kjerner, forårsaker den betydelige tidsforsinkelsen fra vevsinnsamling til kjerne-kryssbinding risikoen for endret DNA -proteininteraksjon. I motsetning til dette utførte de fleste studier kryssbinding umiddelbart etter eksperimentell behandling eller vevsinnsamling for å bevare sanntids DNA-proteiN bindende 12 . En annen ulempe ved kjerneisolasjon før kryssbinding er at den utelukker tidsfølsomme applikasjoner som sirkadisk prøveinnsamling som vanligvis forekommer i intervaller på 3-4 timer. Uten å koble sammen kjernene, trenger isolasjonen umiddelbart etter disseksjon, mens kryssbundne prøver kan behandles sammen etter at hele tidskurset er fullført, og dermed sikrer større eksperimentell konsistens.
Andre protokoller for kjerneisolasjon fra ukrosslinket skjelettmuskulatur har også blitt rapportert. To studier beskrev bruken av gradient-ultracentrifugering for å separere kjerner fra gjenværende myofibriller og celleavfall 23 , 24 . Selv om sukrose eller kolloidal gradient ultracentrifugering er effektiv med ukrossamlede muskelvev, viste våre eksperimenter at etter kryssbinding mislyktes gradient ultracentrifugering til å adskille kjerner fra celle dEbris på gradienten.
Vi utviklet derfor en prosedyre for å isolere høykvalitets kjerner ved å bruke tverrbundne muskelskjelettmuskler. I stedet for gradient ultracentrifugering, utviklet vi en seriefiltreringsmetode for effektivt å separere kjerner fra rusk. Etter ultralydbehandling ble kromatinprøvene anvendt med suksess for ChIP-studier som viste et sirkadisk mønster av BMAL1-proteinbinding til målpromotorer. Vår metode kan være bredt anvendelig for ulike mekanistiske studier av muskelvev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreomsorg ble utført under retningslinjene for institusjonell dyresorg og brukskomité (IACUC), og prosedyrene ble utført i henhold til en dyreprotokoll godkjent av University of Texas Health Science Center i Houston.
1. Nukleærisolasjon fra tverrbundet skjelettmuskel
- Skjelettmuskulatur, vei og hakkemasse, isolert fra ca. 20 uker gamle C57BL / 6 hannmus, i iskald fosfatbuffert saltvann (PBS) som beskrevet i detalj tidligere 22 .
MERK: Vi oppnår vanligvis 1,0 - 1,5 g skjelettmuskulatur fra en mus.- Plasser hakket skjelettmuskelvev i et 50 ml konisk rør inneholdende 10 ml PBS på is.
- Sentrifuger ved 300 xg ved 4 ° C i 5 min.
- Fjern forsiktig PBS-supernatanten ved aspirasjon.
- Beregn pelletvolum i hvert 50 ml rør ved å bruke referansørrør med 1, 2, 3 og 4 ml vann.
- Legg til 7 volumer avIskald 1% formaldehyd i PBS og homogenisere prøvene på is ved hjelp av en sondevevshomogenisator (se tabell over materialer ).
MERK: Valgfritt: Homogeniseringsprosedyren kan utføres i et kaldrom. - Tverrbind prøven ved å inkubere ved romtemperatur i 10 minutter.
- Avkjøl tverrbindingsreaksjonen ved tilsetning av 1 M glycin til en sluttkonsentrasjon på 0,125 M og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur.
- Sentrifuger prøvene ved 3000 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten via aspirasjon.
- Skyll med 10 ml iskald basebuffer (10 mM HEPES-KOH ved pH 7,3, 10 mM EDTA, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT) inneholdende nytilstilte proteaseinhibitorer (0,2 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) , Og 10 ug / ml leupeptin). Sentrifuger ved 3000 g i 5 minutter ved 4 ° C og fjern forsiktig supernatanten ved aspirasjon.
- Resuspender pelleten i 6 ml lysisbuffer (10 mM HEPES-KOH på sH 7,3, 10 mM EDTA, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 1% Triton X-100) inneholdende nytilstilte proteaseinhibitorer (0,2 mM PMSF og 10 ug / ml leupeptin).
- Overfør prøven til en ferdigkjølt 15 ml Dounce-homogenisator og inkuber i 10 minutter på is.Dounce homogenisere hver prøve på is med 15 sakte slag ved hjelp av løs pestle etterfulgt av 15 slag med tett støpe for å frigjøre kjernene.
- Filtrer homogenatet (6 ml) gjennom cellefilter (porestørrelse: 100 μm) og skyll med 4 ml lysisbuffer. Sentrifuger prøvene ved 1000 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Resuspender i 5 ml iskall base buffer og dounce 10 ganger med tett pestle for å frigjøre kjerner.
- Fjern en alikvot på 20 μl for DNA-konsentrasjonsmåling med et spektrofotometer (OD260 / OD280) og mikroskopisk observasjon med trypanblå hvis nødvendig (se nedenfor) ( Figur 1A).
- Filtrer fjæringen gjennomEn cellefilter (porestørrelse: 70 μm), skyll røret og filter igjen med 2 ml basebuffer som ovenfor.
- Gjenta filtreringen som i trinn 1.13 med cellestrømmer med gradvis redusert porestørrelse (40 μm, 30 μm, 20 μm og 10 μm).
MERK: I alt ble det brukt strendere med 6 porestørrelser i trinn 1.12-1.14. - Sentrifuger ved 1000 g ved 4 ° C i 10 minutter. Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 500 μl basebuffer.
- Mål DNA-konsentrasjon som ovenfor.
MERK: Ca 200 μg nukleins DNA ble oppnådd ved å kombinere begge bakre lemmer fra ett dyr. Valgfritt, lag 20 μL for mikroskopisk observasjon med trypanblå flekker (bestandskonsentrasjon 0,4%, 1: 5 fortynning); Kjerner vil flekke blå ( figur 1B ). - Sentrifuger ved 1000 g ved 4 ° C i 10 minutter, og kast supernatanten. Oppbevar pelleten ved -80 ° C.
2. Sonikering
<ol>MERK: Et eksempel for evaluering av sonikeringseffektivitet er vist i figur 2 .
3. Evaluering av Sonication og Quantitation
- Legg til 1,0ΜL av RNase A (500 U / ml RNase A: 20.000 U / mL RNase T1) til de lagrede 50 μl sonikerte prøver og inkuber i 30 minutter ved 37 ° C.
- Tilsett 8 μl protease K (10 mg / ml) og inkuber 30 minutter ved 55 ° C.
- Høst DNA ved å bruke et DNA-ekstraksjonssett.
- Tilsett 5 volumer bindingsbuffer, bruk den til spinnkolonne, og sentrifuger ved 4.000 xg, 10 min.
- Påfør passasjonen på samme kolonne og sentrifuger igjen.
- Vask med vaskebuffer to ganger ved 13.000 xg, 1 min.
- Sentrifuger igjen ved 13.000 xg, 1 min for å tørke kolonnen.
- Tilsett 50 μl H20 og sentrifuge ved 13.000 xg, 1 min for å eluere DNA.
- Påfør passasjonen på samme kolonne og sentrifuger igjen.
- Kvantifiser mengden av DNA med et spektrofotometer (OD260 / OD280). Kjør prøver på 0,8% geler for å vurdere størrelsen og mengden (1 μg) av de sonikerte produktene ( Figur 2 ).
MERK: Gjennomsnittlig kromatinutbytte er ca. ~ 20%.
4. ChIP
- Tine det tidligere lagrede kromatinet ved -80 ° C og alikvot kromatinet til ~ 100 - 120 μg per rør. Fortynn 1:10 med radioimmunprecipitationsassay (RIPA) buffer (20mM Tris-HCl (pH 7,4), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM NaF, 1mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 1x Protease inhibitor cocktail (PIC), 0,1% Na-deoksycholat Vekt / volum), 1% Triton X-100).
- Hvis det er flere prøver i hver gruppe, kombinere like mengder kromatin-DNA til den endelige mengden av ~ 100 - 120 μg / prøve. Spar 10% som input.
- Tilsett 40 μL (50% v / v oppslemming i RIPA buffer) av BSA-forblokkert (~ 2 timer, 4 ° C) Protein A / G-agarose (ikke-kylling-antistoff) eller IgY-perler (kyllingantistoff) og inkuber på En rotator i 3 timer ved 4 ° C.
- Sentrifuger ved 1000 xg, 10 min og overfør forsiktig supernatanten til nye rør.
- Tilsett antistoffer ved 1 μg antistoff per ~25 - 100 μg kromatin-DNA.
- Roter forsiktig ved 4 ° C over natten ved ca. 15 rpm.
- Tilsett 10 μL BSA-forblokkert (~ 2 timer, 4 ° C) Protein A / G-agarose (ikke-kylling-antistoff) eller IgY-perler (kyllingantistoff) blandes og roteres i det kalde rommet i 2 timer.
- Vask perlene som følger. Vask med 1 ml RIPA-buffer i 3 minutter to ganger, vask med 1 ml høy saltbuffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% Triton X-100) i 3 minutter to ganger , Vask med 1 ml LiCl-buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 250 mM LiCl, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% Na-deoksycholat, 0,5% NP40) i 3 minutter to ganger.
- Vask med 1 ml Tris-EDTA (TE) buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA) i 3 minutter en gang. Deretter elueres DNA med elueringsbuffer (20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA og 0,5% SDS).
- Sentrifuger ved 1000 g, 1 min og fjern supernatanten forsiktig.
- Resuspender perlen med 50 μl elueringsbuffer.
- Inkubere for 10Min ved 65 ° C.
- Sentrifuger ved 12 000 g i 5 min.
- Overfør supernatanten til et nytt rør, tilsett ytterligere 50 μL og sentrifuger igjen ved 12 000 g i 5 min. Det endelige elueringsvolumet vil være 100 ul.
- Omvendt tverrbinding og DNA-eluering.
- Inkuber det eluerte kromatinet over natten ved 65 ° C.
- Tilsett 1,0 μL RNase A og inkuber i 30 minutter ved 37 ° C.
- Tilsett 8 μl protease K (10 mg / ml) og inkuber 30 minutter ved 55 ° C.
- Høst DNAet ved å bruke et PCR-opprydningssett med elueringsvolum ved 50 μl i henhold til produsentens protokoll.
- Analyser profilene i sanntid qPCR som tidligere beskrevet 25 , 26 .
MERK: Primersekvensene er oppført i figur 3 Legend . Data presenteres som gjennomsnittlig ± SEM ( Figur 3 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her gjennomførte vi formaldehyd-kryssbinding umiddelbart etter vevsinnsamling for å bevare sanntids-DNA-proteininteraksjon. Imidlertid fant vi at sukrose eller kolloidal gradient, som vanligvis ble brukt for kjerneisolasjon 23 , 24 , ikke var effektiv i å separere kjerner fra myofibriller (data ikke vist). Årsaken kan være at kryssbinding gir lignende tyngdekraften for kjerner og myofibriller. Derfor utviklet vi en seriell filtreringsprosess for effektivt å fjerne store myofibriller og annet rusk fra kjernefraksjonen. Etter 100 μm filtrering var det fortsatt store vevsavfall og myofibriller ( Figur 1 A ). Til sammenligning ble flertallet av store vevsrester, intakte celler og store myofibriller fjernet ved slutten av sekvensiell filtrering ( Figur 1 B ).
27 eller musembryonfibroblast (MEF) 28 , i vår erfaring, interfererte det med sonikering av skjelettmuskulaturkjerner og resulterte i bred smøring, hvilket indikerer Ineffektiv sonikering. Ved bruk av den nåværende protokollen med umiddelbar sonikering etter suspensjon i SDS lysisbuffer observert vi effektiv sonikering med kromatin gradvis kryptert på en syklusavhengig måte og til slutt produserer ~ 500 bp DNA-fragmenter ( figur 2 ). Preinkubasjon i lysisbufferen påvises kompromittert sonikeringseffektiviteten.
Å conFast kvaliteten på kromatinpreparasjonen for ChIP, undersøkte vi DNA-binding av sirkadisk transkripsjonsfaktor BMAL1, som viste bindende topp og trough ved Zeitgeber-tid (ZT) 6 og ZT18, henholdsvis 18 , 29 . Skjelettmuskelprøver fra C57B / 6J-mus ble samlet ved ZT6 og ZT18, og kromatinprøver ble fremstilt som ovenfor. Kort etter, etter sonikering ble riflede kromatinprøver forhånds-fjernet med IgY-perler som ble for-blokkert med BSA etterfulgt av inkubering med anti-BMAL1-antistoff ved 4 ° C over natten. Etter eluering og rensing av kromatin utførte vi RT-qPCR for å detektere BMAL1-binding på E-Box-elementer av to målgener, Nr1d1 og Dbp 30 . Vi oppdaget robust binding av BMAL1 til E-bokselementene ved ZT6 og minimal binding ved ZT18 ( Nr1d1 : 0,452 ± 0,022 vs. 0,039 ± 0,002, Dbp -0,4: 0,627 ± 0,013 vs. 0,062 ± 0,009, Dbp+0,8: 0,176 ± 0,013 vs. 0,008 ± 0,001, Dbp + 2,4: 0,466 ± 0,010 vs. 0,122 ± 0,014; Alle verdier er gjennomsnittlige ± SEM) ( Figur 3 ), validering av protokollen for tidsfølsom transkripsjonsfaktorbindingsanalyse i skjelettmuskulatur.
Figur 1 : Sekventiell filtrering effektivt fjernet Vevsløsen. (A) Representative bilder som viser prøver etter 100 μm filtrering. Store vev og fiberrusk observeres. (B) Representative bilder som viser prøver etter seriefiltrering. Store fiberrester ble ryddet. Bare isolerte kjerner og små myofibrilfragmenter blir observert. Bilder ble tatt ved bruk av et lysmikroskop ved 10X, 20X og 40X forstørrelser. Skalestenger vises på høyre sidepaneler.Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 : Progressiv kromatin-fragmentering gjennom 10 sykluser av sonikering. Ti sykluser av sonikering med fordøyd kromatin-DNA til ~ 500 bp, som avslørt i en 0,8% agarosegel, løper ved 150 V i 60 minutter. Det høyre panelet indikerer en lavere sonikasjonseffektivitet etter forinkubasjon i iskald SDS-lysisbuffer i 1 time. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
FiGure 3 : Representative qPCR-resultater for BMAL1 ChIP med museskelettmuskelprøver samlet ved ZT6 og ZT18. Data presenteres som gjennomsnittlig ± SEM. Dbp -0.4, +0.8 og +2.4 angir plasseringer av E-Box-elementene på Dbp- genet. NC: negativ kontroll med IgY. Det tidsmessige mønsteret for BMAL1-binding er i samsvar med tidligere resultater som viser BMAL1-bindende topp ved rundt ZT6 18 . Frem- og revers-primere er som følger. Rev-erba: 5'-GTAGACTACAAATCCCAACAATCCTG, og 5'-TGGAGCAGGTACCATGTGATTC; Dbp -0,4: 5'-ACACCCGCATCCGATAGC og 5'-CCACTTCGGGCCAATGAG; Dbp +0,8: 5'- ATGCTCACACGGTGCAGACA og 5'-CTGCTCAGGCACATTCCTCAT; Dbp +2,4: 5'- TGGGACGCCTGGGTACAC og 5'-GGGAATGTGCAGCACTGGTT. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en robust metode der tverrbundet skjelettmuskulatur vev ble brukt til å isolere høykvalitets kjerner. Sekventiell filtrering ble utført for effektivt å separere kjerner fra rusk, og ultralydsakustisk energi fra skålformet transduktor skåret kromatinet for ChIP-analyse. Resultatene viste circadian tidspesifik binding av BMAL1 til målpromotorer.
ChIP kan brukes til å fange sanntids proteinbelegning på genomisk DNA når kryssbinding foregår. For å dra nytte av dette potensialet, hadde vi til hensikt å utvikle en metode for å tillate tverrknytning av skjelettmuskulaturen på tidspunktet for vævsdiseksjon og for å strømline kjernisolasjonen uten gradient ultracentrifugering. På grunn av vanskeligheten ved homogenisering av fiberrik skjelettmuskulatur sammenlignet med myke vev som lever, hakket vi muskelvev i iskald PBS og homogeniserte deretter prøven i en formaldehydbuffer. Etter quenching, vevssuspensjon waS sentrifugert og skyllet med iskald basebuffer for å skylle ut eventuell gjenværende formaldehyd. Nuklein ble frigjort ved Dounce-homogenisering, og homogenatene ble sekventielt filtrert for gradvis å fjerne celleavfall og myofibriller. Vi utviklet filtreringsserien for å minimere filterstopping som kunne påvirke avkastningen negativt. Bare svært korte myofibriller ble igjen da sekvensiell filtrering ble fullført.
Sonication- og ChIP-prosedyrene ble tilpasset fra en tidligere rapport 12 med modifikasjoner inkludert sonikeringstidspunkt og SDS-bufferbeløp. Den parabolformede sonikatoren tillater eksponering for sentralisert ultralydbølge for prøver i glassflasker i et kaldvannsbad. Sammenlignet med sonde sonikatorer, kontrollerer denne sonikatoren prøvetemperaturen for å unngå overoppheting, og forhindrer også krysskontaminering av prøven. Hvis sonde sonikatorer brukes, må optimal sonication betingelser bestemmes empirisk. Vi har også redusert amounT av SDS buffer siden utbyttet av muskelkromatin er lavere enn det i lever 12 . Flere protokoller 28 , 31 , 32 inkluderer inkubering på is eller ved romtemperatur før sonikering. I vår erfaring forbedret imidlertid pre-inkubasjon på is ikke sonikeringseffektiviteten. Faktisk, i noen tilfeller var sonikasjonen kompromittert. Det er mulig at resterende myofibriller inntrappte kromatin-DNA'et under inkubering og dempet sonikeringseffektivitet. Med umiddelbar sonikering etter kjernesuspensjon i SDS lysisbuffer, lyktes det å oppnå progressiv kromatinfragmentering med økende sonikasjonssykluser ( Figur 2 ).
Vi validerte kvaliteten på kromatin med ChIP qPCR. Som vist i figur 3 var BMAL1-promotorbelegget robust ved ZT6 og minimal ved ZT18, i samsvar med tidligere vist BMAL1 circaDian promotor binding 18 . Denne funksjonelle analysen bekreftet kvaliteten av kjerner og kromatin. I de senere år har rask utvikling i NGS åpnet en ny horisont for ChIP-applikasjonen der ChIP-seq kvantitativt kan forhøre genomisk binding med høy følsomhet 17 . Spesielt for ChIP-seq er det nødvendig med høy kvalitet kjerne og kromatin å konsekvent fange protein-DNA-interaksjon. Fremgangsmåten beskrevet heri kan utgjøre en verdifull ressurs for ChIP-seq-studier ved bruk av skjelettmuskulatur. Uansett krever ChIP-seq-biblioteket forberedende tiltak for å forbedre signaloppløsningen, for eksempel PAGE-basert størrelsesvalg 18 .
Til slutt utviklet vi en filtreringsbasert protokoll for å forberede høykvalitets kjerner fra tverrbundet skjelettmuskulatur. Vi fjerner behovet for ultracentrifugering, noe som gjør det enkelt å bruke. I tillegg til ChIP for gener av interesse, er kjernene og kromatin prEpared som beskrevet kan være bredt anvendelig for ChIP-seq studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Karyn Esser, Nobuya Koike og Noheon Park for nyttige råd. Dette arbeidet ble delvis støttet av NIH / NIGMS (R01GM114424) til S.-HY, og Robert A. Welch Foundation (AU-1731) og NIH / NIA (R01AG045828) til ZC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Fisher Scientific | 15250061 | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| Protease K | Sigma Aldrich | 3115887001 | |
| Chicken Anti-BMAL1 antibody | Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318 - 579, and IgY was affinity purified using the same antigen. | ||
| Chicken IgY Precipitating Resin | GenScript | L00405 | |
| Equipment | |||
| KINEMATICA Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-178 | |
| 15 mL Dounce tissue grinder | Whearton | 357544 | |
| Falcon Cell Strainers 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| Falcon Cell Strainers 70 µm | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Falcon Cell Strainers 40 µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| pluriStrainer 30 µm | PluriSelect | 43-50030-03 | |
| pluriStrainer 20 µm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| pluriStrainer 10 µm | PluriSelect | 43-50010-03 | |
| Covaris S2 Focused-ultrasonicator | Covaris | Model S2 | |
| Labquake | Thermo Scientific | C415110 | |
| CCD Microscope Camera | Leica Microsystems | DFC3000 G | |
| Reagent Kit | |||
| DNA extraction kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| Buffers | |||
| All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich |
References
- Bouzakri, K., et al. siRNA-based gene silencing reveals specialized roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in glucose and lipid metabolism in human skeletal muscle. Cell Metab. 4 (1), 89-96 (2006).
- Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J.
- Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets. Nat Chem Biol. 3 (10), 630-639 (2007).
- Harfmann, B. D., Schroder, E. A., Esser, K. A. Circadian rhythms, the molecular clock, and skeletal muscle. J Biol Rhythms. 30 (2), 84-94 (2015).
- Nohara, K., Yoo, S. H., Chen, Z. J. Manipulating the circadian and sleep cycles to protect against metabolic disease. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 35 (2015).
- Harfmann, B. D., et al. Muscle-specific loss of Bmal1 leads to disrupted tissue glucose metabolism and systemic glucose homeostasis. Skelet Muscle. 6, 12 (2016).
- Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Jackson, V. Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent. Cell. 15 (3), 945-954 (1978).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Takahashi, J. S., et al. ChIP-seq and RNA-seq methods to study circadian control of transcription in mammals. Methods Enzymol. 551, 285-321 (2015).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
- Chen, Z., Manley, J. L. Core promoter elements and TAFs contribute to the diversity of transcriptional activation in vertebrates. Mol Cell Biol. 23 (20), 7350-7362 (2003).
- Menet, J. S., Abruzzi, K. C., Desrochers, J., Rodriguez, J., Rosbash, M. Dynamic PER repression mechanisms in the Drosophila circadian clock: from on-DNA to off-DNA. Genes Dev. 24 (4), 358-367 (2010).
- Miki, T., Matsumoto, T., Zhao, Z., Lee, C. C. p53 regulates Period2 expression and the circadian clock. Nat Commun. 4, 2444 (2013).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Koike, N., et al. Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals. Science. 338 (6105), 349-354 (2012).
- Zhou, J., Yu, W., Hardin, P. E. ChIPping away at the Drosophila clock. Methods Enzymol. 551, 323-347 (2015).
- Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat Rev Genet. , (2016).
- Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L.
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Isolation of nuclei from skeletal muscle satellite cells and myofibers for use in chromatin immunoprecipitation assays. Methods Mol Biol. 798, 517-530 (2012).
- Wilkie, G. S., Schirmer, E. C. Purification of nuclei and preparation of nuclear envelopes from skeletal muscle. Methods Mol Biol. 463, 23-41 (2008).
- Hahn, C. G., Covault, J. Isolation of transcriptionally active nuclei from striated muscle using Percoll density gradients. Anal Biochem. 190 (2), 193-197 (1990).
- Jeong, K., et al. Dual attenuation of proteasomal and autophagic BMAL1 degradation in Clock Delta19/+ mice contributes to improved glucose homeostasis. Scientific reports. 5, 12801 (2015).
- Nohara, K., et al. Ammonia-lowering activities and carbamoyl phosphate synthetase 1 (Cps1) induction mechanism of a natural flavonoid. Nutrition & metabolism. 12, 23 (2015).
- Zhang, L., Rubins, N. E., Ahima, R. S., Greenbaum, L. E., Kaestner, K. H. Foxa2 integrates the transcriptional response of the hepatocyte to fasting. Cell Metab. 2 (2), 141-148 (2005).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
- Kondratov, R. V., et al. BMAL1-dependent circadian oscillation of nuclear CLOCK: posttranslational events induced by dimerization of transcriptional activators of the mammalian clock system. Genes Dev. 17 (15), 1921-1932 (2003).
- Ripperger, J. A., Schibler, U. Rhythmic CLOCK-BMAL1 binding to multiple E-box motifs drives circadian Dbp transcription and chromatin transitions. Nat Genet. 38 (3), 369-374 (2006).
- Laplante, M., et al. DEPTOR cell-autonomously promotes adipogenesis, and its expression is associated with obesity. Cell Metab. 16 (2), 202-212 (2012).
- Blechman, J., Amir-Zilberstein, L., Gutnick, A., Ben-Dor, S., Levkowitz, G. The metabolic regulator PGC-1alpha directly controls the expression of the hypothalamic neuropeptide oxytocin. J Neurosci. 31 (42), 14835-14840 (2011).
