Summary
Nous présentons un protocole basé sur la filtration pour isoler des noyaux de haute qualité à partir du muscle squelettique de souris réticulé dans lequel nous avons supprimé le besoin d'ultracentrifugation, ce qui le rend facilement applicable. Nous montrons que la chromatine préparée à partir des noyaux est appropriée pour l'immunoprécipitation de la chromatine et les études probables de séquençage de l'immunoprécipitation de la chromatine.
Abstract
L'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est une méthode puissante pour déterminer la liaison des protéines à l'ADN de la chromatine. Le muscle squelettique riche en fibres a toutefois été un défi pour le ChIP en raison de difficultés techniques en isolement de noyaux de haute qualité avec une contamination minimale des myofibrilles. Les protocoles antérieurs ont tenté de purifier les noyaux avant la réticulation, ce qui entraîne une altération de l'interaction ADN-protéine pendant le processus de préparation des noyaux prolongés. Dans le protocole actuel, nous avons d'abord réticulé le tissu musculaire squelettique recueilli chez la souris et les tissus ont été hachés et sonicés. Comme nous avons constaté que l'ultracentrifugation n'était pas capable de séparer les noyaux des myofibrilles à l'aide d'un tissu musculaire réticulé, nous avons mis au point une procédure de filtration séquentielle pour obtenir des noyaux de haute qualité dépourvus de contamination significative par myofibrilles. Nous avons ensuite préparé la chromatine en utilisant un ultrasons, et les tests de ChIP avec anticorps anti-BMAL1 ont révélé une liaison circadienne robusteModèle de BMAL1 pour cibler les promoteurs de gènes. Ce protocole de filtration constitue une méthode facilement applicable pour isoler des noyaux de haute qualité à partir d'un tissu musculaire squelettique réticulé, ce qui permet un traitement cohérent des échantillons pour les études circadiennes et autres études sensibles au temps. En combinaison avec le séquençage de la prochaine génération (NGS), notre méthode peut être déployée pour diverses études mécaniques et génomiques axées sur la fonction du muscle squelettique.
Introduction
Le muscle squelettique joue un rôle important dans la physiologie et le comportement. La fibre musculaire multi-nucléée se compose de myofibrilles où l'actine et la myosine forment des unités fonctionnelles appelées sarcomères pour générer une force contractile. Le muscle squelettique est également le plus grand organe métabolique du corps, ce qui représente> 80% d'apport de glucose postprandial et de régulation de la réponse à l'insuline et de l'homéostasie métabolique 1 , 2 . La physiologie musculaire et le métabolisme sont étroitement réglementés par l'horloge circadienne, une minuterie biologique intrinsèque 3 , 4 , 5 , 6 . Par exemple, la suppression spécifique du muscle squelettique de Bmal1 , l'un des composants de l'horloge circadienne centrale, a entraîné une résistance à l'insuline et une diminution de l'absorption du glucose dans le muscle squelettique, et on a constaté que les animaux développaient un diabète de type 2 7 . jeEn outre, le muscle squelettique est de plus en plus apprécié en tant qu'organe endocrinien 8 , sécrétant les myokines pour réguler le métabolisme systémique et la physiologie. Des études mécanistiques sont nécessaires pour bien comprendre ces fonctions réglementaires dans le muscle squelettique.
ChIP est une approche puissante pour délimiter le recrutement par le promoteur de protéines de liaison à l'ADN. ChIP a d'abord été développé pour identifier l'organisation des nucléosomes sur l'ADN de la chromatine 9 , 10 . Depuis, on a signalé que diverses méthodes ont réticulé les protéines et l'ADN de la chromatine en utilisant du formaldéhyde, du sulfate de diméthyle ou de l'irradiation ultraviolette (UV) 11 , 12 . La réticulation du formaldehyde est la structure la plus utilisée, la structure de la chromatine et les interactions ADN-protéine 9 , 13 , 14 . Chromatographie réticuléeIn est déchiqueté par sonication et immunoprécipité avec un anticorps contre la protéine de liaison d'ADN spécifique 15 , 16 . Au cours des dernières années, le séquençage par ChIP (ChIP-seq), une méthode combinant ChIP avec NGS, a été développé pour interroger le facteur de transcription du génome à l'échelle du 17 et, dans certains cas, pour surveiller les changements dynamiques au cours d'un cours 18 , 19 , 20 . Par exemple, les études circadiennes ChIP-seq ont révélé une séquence hautement orchestrée de liaison génomique des composants de l'horloge circadienne et des marqueurs d'histones, ce qui entraîne une expression du gène temporellement précise tout au long du cycle circadien de 24 heures 18 .
La plupart des protocoles ChIP disponibles sont conçus pour les tissus mous ( par exemple, le foie, le cerveau, etc. ) et très peu ont été publiés pour les tissus durs, y compris le squeletteMuscle. Il est techniquement difficile d'homogénéiser le muscle squelettique riche en fibres et d'isoler les noyaux de haute qualité 21 , en particulier pour les expériences ChIP qui nécessitent une réticulation. Dans une récente étude sur le muscle ChIP 22 , les cellules satellites ont été séparées des myofibres et des noyaux ont été préparés à partir des deux types de cellules par une procédure prolongée impliquant une digestion des tissus. L'ensemble du processus a duré environ trois heures avant de procéder à la réticulation du formaldéhyde sur des noyaux isolés. Bien que cette procédure ait évité de reticuler la fibre musculaire, ce qui rend le tissu musculaire encore plus réfractaire à une homogénéisation efficace et a pu produire des noyaux de haute qualité, le retard important de la collecte des tissus à la réticulation des noyaux entraîne le risque d'ADN altéré -interaction des protéines. En revanche, la plupart des études ont réalisé une réticulation immédiatement après un traitement expérimental ou une collecte de tissu afin de préserver l'ADN-protéi en temps réelN liaison 12 . Un deuxième inconvénient de l'isolement des noyaux avant la réticulation est qu'il empêche les applications sensibles au temps telles que la collecte d'échantillon circadien qui se produit habituellement à des intervalles de 3 à 4 h. Sans reticuler les noyaux, l'isolement doit se dérouler immédiatement après la dissection, alors que les échantillons réticulés peuvent être traités ensemble après la fin du cours, ce qui garantit une plus grande cohérence expérimentale.
D'autres protocoles pour l'isolement des noyaux à partir de muscle squelettique non réticulé ont également été rapportés. Deux études ont décrit l'utilisation de l'ultracentrifugation en gradient pour séparer les noyaux des myofibrilles restantes et des débris cellulaires 23 , 24 . Alors que le sucrose ou l'ultracentrifugation en gradient colloïdal est efficace avec les tissus musculaires non réticulés, nos expériences ont révélé qu'après la réticulation, l'ultracentrifugation en gradient n'a pas réussi à séparer les noyaux de la cellule dEbris sur le dégradé.
Nous avons donc développé une procédure pour isoler des noyaux de haute qualité en utilisant des tissus de muscle squelettique de souris réticulés. Plutôt que de l'ultracentrifugation en gradient, nous avons conçu une méthode de filtration en série pour séparer efficacement les noyaux des débris. À la suite de l'échographie, les échantillons de chromatine ont été appliqués avec succès pour des études de ChIP qui ont montré un schéma circadien de liaison de la protéine BMAL1 aux promoteurs cibles. Notre méthode peut être largement applicable à diverses études mécanistes des tissus musculaires.
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Protocol
Les soins aux animaux ont été effectués dans le cadre des lignes directrices du Comité d'utilisation et d'utilisation des animaux institutionnels (IACUC), et les procédures ont été menées selon un protocole animal approuvé par le Centre de sciences de la santé de l'Université du Texas à Houston.
1. Isolation des noyaux à partir du muscle squelettique réticulé
- Pesez et mincez le muscle squelettique des membres postérieurs, isolé à partir de souris mâles C57BL / 6 d'environ 20 semaines, dans une solution salée tamponnée au phosphate glacée (PBS) comme décrit en détail précédemment 22 .
NOTE: Nous obtenons habituellement 1,0 à 1,5 g de muscle squelettique d'une souris.- Placer le tissu squelettique du muscle squeletté dans un tube conique de 50 ml contenant 10 ml de PBS sur de la glace.
- Centrifuger à 300 xg à 4 ° C pendant 5 min.
- Enlever soigneusement le surnageant PBS par aspiration.
- Évaluer le volume des pastilles dans chaque tube de 50 ml en utilisant des tubes de référence avec 1, 2, 3 et 4 ml d'eau.
- Ajouter 7 volumes de1% de formaldéhyde glacé dans du PBS et homogénéiser les échantillons sur de la glace à l'aide d'un homogénéisateur de tissu de sonde (voir Tableau des matériaux ).
REMARQUE: en option: la procédure d'homogénéisation peut être effectuée dans une chambre froide. - Reticuler l'échantillon en incubant à température ambiante pendant 10 min.
- Réduire la réaction de réticulation par addition de 1 M de glycine à une concentration finale de 0,125 M et incuber pendant 5 minutes à température ambiante.
- Centrifuger les échantillons à 3 000 xg pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant par aspiration.
- Rincer avec 10 ml de tampon de base glacé (HEPES-KOH 10 mM à pH 7,3, EDTA 10 mM, KCl 10 mM, MgCl2 5 mM, DTT 0,5 mM) contenant des inhibiteurs de protéase fraîchement ajoutés (fluorure de phénylméthylsulfonyle 0,2 mM (PMSF) , Et 10 ug / mL de leupeptine). Centrifuger à 3 000 g pendant 5 min à 4 ° C et retirer soigneusement le surnageant par aspiration.
- Remettre en suspension le culot dans 6 ml de tampon de lyse (HEPES-KOH 10 mM à pH 7,3, 10 mM d'EDTA, 10 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, 0,5 mM de DTT, 1% de Triton X-100) contenant des inhibiteurs de protéase fraîchement ajoutés (PMSF 0,2 mM et 10 ug / mL de leupeptine).
- Transférer l'échantillon à un homogénéisateur Dounce préchauffé de 15 ml et incuber pendant 10 minutes sur de la glace. Dénuder homogénéiser chaque échantillon sur de la glace avec 15 coups lents en utilisant un pilon lâche suivi de 15 coups avec un pilon serré pour libérer les noyaux.
- Filtrer l'homogénat (6 mL) par filtre cellulaire (taille des pores: 100 μm) et rincer avec 4 mL de tampon de lyse. Centrifuger les échantillons à 1000 xg pendant 10 min à 4 ° C. Remettre en suspension dans 5 mL de tampon de base glacé et dancer 10 fois avec un pilon serré pour libérer des noyaux.
- Supprimez une aliquote de 20 μL pour la mesure de la concentration d'ADN avec un spectrophotomètre (OD260 / OD280) et une observation microscopique avec du bleu de trypan si nécessaire (voir ci-dessous) ( Figure 1 A ).
- Filtrer la suspension à traversUn filtre cellulaire (taille du pore: 70 μm), rincer le tube et filtrer à nouveau avec 2 ml de tampon de base comme ci-dessus.
- Répétez la filtration comme à l'étape 1.13 avec des tamis cellulaires de taille de pores progressivement réduite (40 μm, 30 μm, 20 μm et 10 μm).
NOTE: Au total, des tamis de 6 tailles de pores ont été utilisés aux étapes 1.12-1.14. - Centrifuger à 1000 g à 4 ° C pendant 10 min. Retirer le surnageant et remettre à nouveau le culot dans 500 μL de tampon de base.
- Mesurez la concentration d'ADN comme ci-dessus.
NOTE: Environ 200 μg d'ADN nucléique ont été obtenus en combinant les deux membres postérieurs d'un animal. En option, économisez 20 μL pour une observation microscopique avec une coloration au bleu trypan (concentration de stock 0,4%, dilution 1: 5); Les noyaux verront le bleu ( Figure 1 B ). - Centrifuger à 1000 g à 4 ° C pendant 10 min, et jeter le surnageant. Gain de magasin à -80 ° C.
2. Sonication
<Ol>REMARQUE: Un exemple pour évaluer l'efficacité de la sonication est illustré à la figure 2 .
3. Évaluation de la sonication et de la quantification
- Ajouter 1.0ΜL de RNase A (500 U / mL RNase A: 20 000 U / mL RNase T1) sur les échantillons soignés de 50 μL et incubés pendant 30 min à 37 ° C.
- Ajouter 8 μL de protéase K (10 mg / mL) et incuber 30 min à 55 ° C.
- Récoltez l'ADN en utilisant un kit d'extraction d'ADN.
- Ajouter 5 volumes de tampon de liaison, l'appliquer à la colonne de spin et centrifuger à 4000 xg, 10 min.
- Appliquer le passage sur la même colonne et centrifuger à nouveau.
- Laver avec un tampon de lavage deux fois à 13 000 xg, 1 min.
- Centrifuger à nouveau à 13 000 xg, 1 min pour sécher la colonne.
- Ajouter 50 μL de H 2 O et centrifuger à 13 000 xg, 1 min pour éluer l'ADN.
- Appliquer le passage sur la même colonne et centrifuger à nouveau.
- Quantifier la quantité d'ADN avec un spectrophotomètre (OD260 / OD280). Exécutez des échantillons sur 0,8% de gels pour évaluer la taille et la quantité (1 μg) des produits sonés ( figure 2 ).
NOTE: Le rendement moyen de la chromatine est d'environ ~ 20%.
4. ChIP
- Décongeler la chromatine précédemment enregistrée à -80 ° C et allumer la chromatine à ~ 100 à 120 μg par tube. Diluer 1:10 avec un tampon de dosage de radioimmunoprécipitation (RIPA) (Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, NaF 1 mM, Na3VO4 1 mM, PMSF 1 mM, Cocktail inhibiteur de protéase 1x (PIC), 0,1% de Na-désoxycholate ( W / v), 1% Triton X-100).
- S'il y a plusieurs échantillons dans chaque groupe, combiner des quantités égales d'ADN de chromatine à la quantité finale de ~ 100 à 120 μg / échantillon. Économisez 10% comme contribution.
- Ajouter 40 μL (bouillie 50% v / v dans le tampon RIPA) d'agarose à base de protéine A / G pré-bloquée (~ 2 h, 4 ° C) pré-bloquée (2 h, 4 ° C) (anticorps anti-poulet) ou IgY (anticorps anti-poulet) et incuber sur Un rotateur pendant 3 h à 4 ° C.
- Centrifuger à 1000 xg, 10 min et transférer soigneusement le surnageant dans de nouveaux tubes.
- Ajouter des anticorps à 1 μg d'anticorps par ~25 - 100 μg d'ADN de chromatine.
- Tourner doucement à 4 ° C pendant une nuit à environ 15 tr / min.
- Ajouter 10 μL de protéines A / G agarassées (~ 2 h, 4 ° C) pré-bloquées (~ 2 h, 4 ° C) ou IgY (anticorrosion contre le poulet) et faire tourner dans la chambre froide pendant 2 h.
- Laver les perles comme suit. Laver avec 1 mL de tampon RIPA pendant 3 minutes deux fois, laver avec 1 ml de tampon salé élevé (Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), NaCl 500 mM, EDTA 2 mM, PMSF 1 mM, Triton X-100 à 1%) pendant 3 min deux fois , Laver avec 1 ml de tampon LiCl (Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), LiCl 250 mM, EDTA 2 mM, PMSF 1 mM, Na-désoxycholate 1%, NP40 à 0,5%) pendant 3 minutes deux fois.
- Laver avec 1 ml de tampon Tris-EDTA (TE) (10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA) pendant 3 min une fois. Ensuite élucient de l'ADN avec un tampon d'élution (Tris-HCl 20 mM, EDTA 5 mM et SDS à 0,5%).
- Centrifuger à 1000 g, 1 min et retirer soigneusement le surnageant.
- Remettre en suspension le cordon avec 50 μl de tampon d'élution.
- Incuber pour 10Min à 65 ° C.
- Centrifugez à 12 000 g pendant 5 min.
- Transférer le surnageant dans un nouveau tube, ajouter encore 50 μL et centrifuger encore une fois à 12 000 g pendant 5 min. Le volume final d'élution sera de 100 μL.
- Réticulation inverse et élution d'ADN.
- Incuber la chromatine éluée pendant une nuit à 65 ° C.
- Ajouter 1,0 μL de RNase A et incuber pendant 30 minutes à 37 ° C.
- Ajouter 8 μL de protéase K (10 mg / mL) et incuber 30 min à 55 ° C.
- Récoltez l'ADN en utilisant un kit de nettoyage par PCR avec un volume d'élution à 50 μL selon le protocole du fabricant.
- Analyser les profils par qPCR en temps réel comme décrit précédemment 25 , 26 .
REMARQUE: Les séquences d'amorces sont listées dans la Figure 3 Légende . Les données sont présentées comme moyen ± SEM ( Figure 3 ).
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Representative Results
Ici, nous avons effectué une réticulation au formaldéhyde immédiatement après la collecte des tissus pour préserver l'interaction ADN-protéine en temps réel. Cependant, nous avons constaté que le saccharose ou le gradient colloïdal, couramment utilisé pour l'isolement des noyaux 23 , 24 , n'était pas efficace pour séparer les noyaux des myofibrilles (données non présentées). La raison en est que cette réticulation confère une gravité similaire pour les noyaux et les myofibrilles. Par conséquent, nous avons développé un processus de filtration en série pour éliminer efficacement les grandes myofibrilles et autres débris de la fraction de noyaux. Après une filtration de 100 μm, il y avait encore de gros débris tissulaires et des myofibrilles ( figure 1 A ). En comparaison, à la fin de la filtration séquentielle, la majorité des grands débris tissulaires, des cellules intactes et des myofibrilles importantes ont été éliminés avec succès ( figure 1 B ).
27 ou le fibroblaste embryonnaire de souris (MEF) 28 , dans notre expérience, il a entravé la sonication des noyaux musculaires squelettiques et a abouti à un frottis large, en indiquant Sonication inefficace. En utilisant le protocole actuel avec une sonication immédiate après la suspension dans un tampon de lyse SDS, nous avons observé une sonication efficace avec de la chromatine progressivement déchiquetée de manière dépendant du cycle et éventuellement produire des fragments d'ADN de ~ 500 pb ( figure 2 ). La pré-incubation dans le tampon de lyse a permis de compromettre l'efficacité de la sonication.
À conFermez la qualité de la préparation de chromatine pour ChIP, nous avons examiné la liaison de l'ADN du facteur de transcription circadien BMAL1, qui a montré un pic de liaison et un temps de Zeitgeber (ZT) 6 et ZT18, respectivement 18 , 29 . Des échantillons de muscle squelettique de souris C57B / 6J ont été recueillis à ZT6 et ZT18, et les échantillons de chromatine ont été préparés comme ci-dessus. En bref, après la sonication, des échantillons de chromatine déchiquetés ont été préalablement éliminés avec des billes IgY préalablement bloquées avec BSA, puis incubées avec un anticorps anti-BMAL1 à 4 ° C pendant la nuit. Après élution et purification de la chromatine, nous avons réalisé RT-qPCR pour détecter la liaison BMAL1 sur les éléments E-Box de deux gènes cibles, Nr1d1 et Dbp 30 . Nous avons détecté une liaison robuste de BMAL1 aux éléments E-box à ZT6 et une liaison minimale à ZT18 ( Nr1d1 : 0,452 ± 0,022 contre 0,039 ± 0,002, Dbp -0,4: 0,627 ± 0,013 contre 0,062 ± 0,009, Dbp+0,8: 0,176 ± 0,013 par rapport à 0,008 ± 0,001, Dbp +2,4: 0,466 ± 0,010 par rapport à 0,122 ± 0,014; Toutes les valeurs sont moyennes ± SEM) ( Figure 3 ), validant le protocole pour l'analyse de la liaison du facteur de transcription sensible au temps dans le muscle squelettique.
Figure 1 : Filtration séquentielle Supprime efficacement les débris de tissus. (A) Des images représentatives montrant des échantillons après une filtration de 100 μm. De grands tissus et des débris de fibres sont observés. (B) Images représentatives montrant des échantillons après filtration en série. Les grands débris de fibres ont été éliminés. Seuls les noyaux isolés et les petits fragments de myofibrilles sont observés. Les images ont été prises en utilisant un microscope optique à des augmentations de 10X, 20X et 40X. Les barres d'échelle sont affichées sur les panneaux latéraux droit.Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Déchiquetage progressif de la chromatine à travers 10 Cycles de Sonication. Dix cycles de sonication avec de l'ADN de chromatine digéré à ~ 500 pb, comme révélé dans un gel d'agarose à 0,8%, ont fonctionné à 150 V pendant 60 min. Le panneau de droite indique une efficacité de sonication inférieure après la pré-incubation dans un tampon de lyse SDS glacé pendant 1 h. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
FiGure 3 : Représentant qPCR Résultats pour BMAL1 ChIP avec des échantillons de muscle squelettique de souris collectés à ZT6 et ZT18. Les données sont présentées sous la forme moyenne ± SEM. Dbp -0.4, +0.8 et +2.4 indiquent les emplacements des éléments E-Box sur le gène Dbp . NC: contrôle négatif avec IgY. Le schéma temporel de liaison de BMAL1 est cohérent avec les résultats précédents montrant le pic de liaison de BMAL1 autour de ZT6 18 . Les amorces avant et inverses sont les suivantes. Rev-erba: 5'-GTAGACTACAAATCCCAACAATCCTG et 5'-TGGAGCAGGTACCATGTGATTC; Dbp -0.4: 5'-ACACCCGCATCCGATAGC et 5'-CCACTTCGGGCCAATGAG; Dpp +0,8: 5'- ATGCTCACACGGTGCAGACA et 5'- CTGCTCAGGCATATTCCTCAT; Dbp +2,4: 5'- TGGGACGCCTGGGTACAC et 5'- GGGAATGTGCAGCACTGGTT. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Nous décrivons ici une méthode robuste où les tissus de muscles squelettiques réticulés ont été utilisés pour isoler des noyaux de haute qualité. La filtration séquentielle a été effectuée pour séparer efficacement les noyaux des débris et l'énergie acoustique ultrasonore du transducteur en forme de plat a percé la chromatine pour l'analyse de ChIP. Les résultats ont montré une liaison circadienne spécifique au temps de BMAL1 aux promoteurs cibles.
ChIP peut être utilisé pour capturer l'occupation de protéines en temps réel sur l'ADN génomique lorsque la réticulation a lieu. Pour profiter de ce potentiel, nous avons cherché à développer une méthode pour permettre la réticulation du muscle squelettique au moment de la dissection tissulaire et à rationaliser l'isolement des noyaux sans ultracentrifugation en gradient. En raison de la difficulté d'homogénéiser le muscle squelettique riche en fibres par rapport aux tissus mous tels que le foie, nous avons piqué le tissu musculaire dans du PBS glacé puis homogénéisé l'échantillon dans un tampon de formaldéhyde. Après trempe, la suspension de tissu waS centrifugé et rincé avec un tampon de base glacé pour rincer le reste de formaldéhyde. Les noyaux ont été libérés par homogénéisation Dounce, et les homogénats ont été filtrés séquentiellement pour éliminer progressivement les débris cellulaires et les myofibrilles. Nous avons conçu la série de filtration pour minimiser le colmatage du filtre qui pourrait avoir un impact négatif sur le rendement. Seules des myofibrilles très courtes restaient lorsque la filtration séquentielle était terminée.
Les procédures de sonication et de ChIP ont été adaptées à partir d'un rapport précédent 12 avec des modifications incluant le temps de sonication et le montant du tampon SDS. Le sonicateur en forme de plat permet d'exposer à une onde ultrasonore centralisée pour des échantillons dans des flacons en verre dans un bain d'eau froide. Par rapport aux sonicateurs à sonde, ce sonicateur contrôle la température de l'échantillon afin d'éviter une surchauffe et empêche également la contamination croisée des échantillons. Si des sonicateurs à sonde sont utilisés, les conditions de sonication optimales doivent être déterminées de manière empirique. Nous avons également réduit l'amounT du tampon SDS car le rendement de la chromatine musculaire est inférieur à celui du foie 12 . Plusieurs protocoles 28 , 31 , 32 comprennent l'incubation sur de la glace ou à température ambiante avant la sonication. Cependant, selon notre expérience, la pré-incubation sur glace n'a pas amélioré l'efficacité de la sonication. En fait, dans certains cas, la sonication a été compromise. Il est possible que les myofibrilles résiduelles enchevêtrent l'ADN de la chromatine pendant l'incubation et l'efficacité de la sonication atténuée. Avec une sonication immédiate après suspension de noyau dans un tampon de lyse SDS, nous avons réussi à obtenir une fragmentation progressive de la chromatine avec des cycles de sonication croissants ( Figure 2 ).
Nous avons validé la qualité de la chromatine avec ChIP qPCR. Comme le montre la figure 3 , l'occupation du promoteur BMAL1 était robuste à ZT6 et minimale à ZT18, conformément au BMAL1 montré auparavantLiaison du promoteur dian 18 . Cet essai fonctionnel a confirmé la qualité des noyaux et de la chromatine. Au cours des dernières années, le développement rapide de NGS a ouvert un nouvel horizon pour l'application ChIP où ChIP-seq peut interroger quantitativement la liaison génomique avec une sensibilité élevée 17 . Particulièrement pour ChIP-seq, des noyaux de haute qualité et de la chromatine sont nécessaires pour capturer de manière continue l'interaction protéine-ADN. La procédure décrite ici peut constituer une ressource précieuse pour les études ChIP-seq utilisant le muscle squelettique. Il est à noter que la préparation de la bibliothèque ChIP-seq nécessite des mesures supplémentaires pour améliorer la résolution du signal, telles que la sélection de la taille basée sur PAGE 18 .
En conclusion, nous avons développé un protocole basé sur la filtration pour préparer des noyaux de haute qualité à partir du muscle squelettique réticulé. Nous supprimez le besoin d'ultracentrifugation, ce qui le rend facilement applicable. En plus de ChIP pour les gènes d'intérêt, les noyaux et la chromatine prÉpargué comme décrit peut être largement applicable aux études de ChIP-seq.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Nous remercions Karyn Esser, Nobuya Koike et Noheon Park pour des conseils utiles. Ce travail a été partiellement soutenu par NIH / NIGMS (R01GM114424) à S.-HY, et la Fondation Robert A. Welch (AU-1731) et NIH / NIA (R01AG045828) à ZC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Fisher Scientific | 15250061 | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| Protease K | Sigma Aldrich | 3115887001 | |
| Chicken Anti-BMAL1 antibody | Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318 - 579, and IgY was affinity purified using the same antigen. | ||
| Chicken IgY Precipitating Resin | GenScript | L00405 | |
| Equipment | |||
| KINEMATICA Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-178 | |
| 15 mL Dounce tissue grinder | Whearton | 357544 | |
| Falcon Cell Strainers 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| Falcon Cell Strainers 70 µm | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Falcon Cell Strainers 40 µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| pluriStrainer 30 µm | PluriSelect | 43-50030-03 | |
| pluriStrainer 20 µm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| pluriStrainer 10 µm | PluriSelect | 43-50010-03 | |
| Covaris S2 Focused-ultrasonicator | Covaris | Model S2 | |
| Labquake | Thermo Scientific | C415110 | |
| CCD Microscope Camera | Leica Microsystems | DFC3000 G | |
| Reagent Kit | |||
| DNA extraction kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| Buffers | |||
| All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich |
References
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