Summary
हम क्रॉस-लिंक्ड माउस कंकाल की मांसपेशियों से उच्च-गुणवत्ता वाले नाभिक को अलग करने के लिए एक निस्पंदन-आधारित प्रोटोकॉल पेश करते हैं जिसमें हमने अल्ट्रेंट्रिफ्यूगेशन की आवश्यकता को हटा दिया, जिससे इसे आसानी से लागू किया जा सके। हम बताते हैं कि नाभिक से तैयार क्रोमेटिन क्रोमैटिन इम्युनोपेरेग्रेशन और संभावित क्रोमैटिन इम्युनोपेप्रिडीएक्शन सिकेंजिंग अध्ययन के लिए उपयुक्त है।
Abstract
Chromatin immunoprecipitation (चीप) क्रोमेटिन डीएनए के लिए प्रोटीन बाध्यकारी निर्धारित करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। फाइबर समृद्ध कंकाल की मांसपेशियों, हालांकि, myofibrils के कम से कम प्रदूषण के साथ उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक के अलगाव में तकनीकी कठिनाई के कारण चिप के लिए एक चुनौती रही है। पिछला प्रोटोकॉल ने क्रॉस-लिंकिंग से पहले नाभिक को शुद्ध करने का प्रयास किया है, जो लंबे समय तक नाभिक तैयारी प्रक्रिया के दौरान बदलते डीएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन का जोखिम उठाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम पहले चूहों से एकत्र कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों को क्रॉस-लिंक करते थे, और ऊतकों को कामा और सोनिक किया गया था। चूंकि हमने पाया कि अल्ट्रेंट्र्रिफ्यूगेशन क्रॉस-लिंक की गई मांसपेशियों के ऊतकों का उपयोग करके मायोफिब्रिल से नाभिक को अलग करने में सक्षम नहीं था, हमने महत्वपूर्ण मायोफिब्रिल प्रदूषण रहित रहित उच्च-गुणवत्ता वाले नाभिक प्राप्त करने के लिए एक अनुक्रमिक निस्पंदन प्रक्रिया तैयार की थी। हमने बाद में एक अल्ट्रासोनैटरेटर का उपयोग करके क्रोमेटिन तैयार किया, और एंटी-बीएमएएल 1 एंटीबॉडी के साथ चीप एशेज से पता चला कि मजबूत सर्कैडियन बाइंडिंगजीन प्रमोटरों को लक्षित करने के लिए BMAL1 का पैटर्न यह निस्पंदन प्रोटोकॉल, सर्कैडियन और अन्य समय-संवेदी अध्ययनों के लिए संगत नमूना प्रसंस्करण की अनुमति देने वाले क्रॉस-लिंक्ड कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों से उच्च-गुणवत्ता वाले नाभिक को अलग करने के लिए आसानी से लागू विधि का गठन करता है। अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) के साथ संयोजन में, हमारी पद्धति को कंकाल की मांसपेशी समारोह पर ध्यान केंद्रित करने वाले विभिन्न तंत्रिकी और जीनोमिक अध्ययनों के लिए तैनात किया जा सकता है।
Introduction
कंकाल की मांसपेशी शरीर क्रिया विज्ञान और व्यवहार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। मल्टी-न्यूक्लेयटेड मांसपेशी फाइबर में मायोफिब्रिल होते हैं, जहां एक्टिन और मायोसिन फंक्शनल यूनिटों को बनाते हैं, जिन्हें सर्कमर्स नामक सिकुड़ी शक्ति उत्पन्न होती है। कंकाल की मांसपेशियों में शरीर का सबसे बड़ा चयापचय अंग भी होता है-> 80% प्रत्यावर्ती ग्लूकोज सेवन के लिए और इंसुलिन प्रतिक्रिया और चयापचय होमोस्टैस 1 , 2 को विनियमित करने के लिए। मांसपेशी शरीर विज्ञान और चयापचय को सर्कैडियन घड़ी, एक आंतरिक जैविक टाइमर 3 , 4 , 5 , 6 द्वारा बारीकी से नियंत्रित किया जाता है। उदाहरण के लिए, कोर सर्कैडियन घड़ी के घटकों में से एक, बमल 1 के कंकाल की मांसपेशी-विशिष्ट विलोपन, इंसुलिन प्रतिरोध और कंकाल की मांसपेशियों में कम ग्लूकोज तेज हो गया और जानवरों को टाइप 2 डायबिटीज़ 7 विकसित करने के लिए पाए गए। मैंइसके अलावा, कंकाल की मांसपेशी को भी अंतःस्रावी अंग 8 के रूप में सराहना किया जा रहा है, प्रणालीगत चयापचय और फिजियोलॉजी को नियंत्रित करने के लिए माइोकिन्स स्रावित करना। कंकाल की मांसपेशियों में इन नियामक कार्यों को पूरी तरह से समझने के लिए यांत्रिक अध्ययनों की आवश्यकता होती है।
चिप डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन के प्रमोटर भर्ती को चित्रित करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है। चिप को प्रारंभिक रूप से क्रोमैटीन डीएनए 9 , 10 पर न्यूक्लियोओसोम संगठन की पहचान करने के लिए विकसित किया गया था। बाद में विभिन्न प्रकार के तरीकों से क्रॉस-लिंक प्रोटीन और क्रोमेटिन डीएनए को फार्मलाडिहाइड, डायमिथाइल सल्फेट या पराबैंगनी विकिरण (यूवी) 11 , 12 का उपयोग कर बताया गया है । फार्मलाडहेड क्रॉस-लिंकिंग सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाता है, क्रोमेटिन संरचना का संरक्षण और डीएनए प्रोटीन इंटरैक्शन 9 , 13 , 14 है । क्रॉस-लिंक किए गए क्रोमेटमें बायोडाईटेशन द्वारा दबाने पर लगाया जाता है और ब्याज 15 , 16 के विशेष डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन के प्रति एंटीबॉडी के साथ प्रतिरक्षी हो जाता है। हाल के वर्षों में चिप-अनुक्रमण (चीप-सीईसी), एनजीएस के साथ चिप का संयोजन करने वाला एक तरीका विकसित किया गया है, जिसे जीनोम-चौड़ा ट्रांसक्रिप्शन कारक बाध्यकारी 17 से पूछताछ करने के लिए विकसित किया गया है, और कुछ मामलों में एक समय के पाठ्यक्रम 18 , 1 9 , 20 । उदाहरण के लिए, सर्कैडियन चिप-सेक के अध्ययन ने सर्कैडियन घड़ी घटकों और हिस्टोन मार्करों के जीनोमिक बाइंडिंग का एक बहुत ही ऑर्केस्ट्रेटेड अनुक्रम प्रकट किया है, जो पूरे ~ 24 घंटे के सर्कैडियन चक्र 18 में अस्थायी रूप से सटीक जीन अभिव्यक्ति को चलाता है।
सबसे अधिक उपलब्ध चिप प्रोटोकॉल को मुलायम ऊतकों ( जैसे यकृत, मस्तिष्क, आदि ) के लिए डिज़ाइन किया गया है, और बहुत कुछ को कंकाल सहित कठिन ऊतकों के लिए प्रकाशित किया गया हैताल मांसपेशियों फाइबर के समृद्ध कंकाल की मांसपेशियों को होमोजिनायज करना और उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक 21 को अलग करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, खासकर चिप प्रयोगों के लिए जो क्रॉस-लिंकिंग की आवश्यकता होती है। हाल ही में मांसपेशियों के चिप्प अध्ययन में 22 , उपग्रह कोशिकाओं को माईफिबर्स से अलग किया गया था, और ऊतक पाचन को शामिल करने के लिए लंबे समय तक प्रक्रिया के माध्यम से नाभिक दोनों कोशिकाओं से तैयार किए गए थे। पूरी प्रक्रिया को पूरा करने के लिए लगभग तीन घंटे लग गए, इससे पहले फॉर्मलाडहाइड क्रॉस-लिंकिंग पृथक नाभिक पर किया गया था। हालांकि यह प्रक्रिया क्रॉस-लिंकिंग मांसपेशी फाइबर से परहेज करती है, जो मांसपेशियों के ऊतकों को कुशल होमोजिनायझेशन के लिए और अधिक अपवर्तक बनाता है, और उच्च-गुणवत्ता वाले नाभिक का उत्पादन करने में सक्षम था, ऊतक संग्रह से नाभिक क्रॉस-लिंकिंग के लिए महत्वपूर्ण समय-समय पर डीएनए को बदलने का जोखिम होता है प्रोटीन इंटरैक्शन इसके विपरीत, अधिकांश अध्ययनों ने वास्तविक समय डीएनए प्रोटीइ को सुरक्षित रखने के लिए प्रयोगात्मक उपचार या ऊतक संग्रह के तुरंत बाद क्रॉस-लिंकिंग कियाएन बाइंडिंग 12 क्रॉस-लिंकिंग से पहले नाभिक अलगाव का दूसरा दोष यह है कि यह समय-संवेदनशील अनुप्रयोगों को रोकता है जैसे सर्कैडियन नमूना संग्रह, जो आमतौर पर 3 - 4 एच अंतराल पर होता है। नाभिक को क्रॉस-लिंक किए बिना, अलगाव को विच्छेदन के तुरंत बाद आगे बढ़ने की आवश्यकता होती है, जबकि पूरे समय के पाठ्यक्रम के पूरा होने के बाद क्रॉस-लिंक किए गए नमूनों को एक साथ संसाधित किया जा सकता है, इस प्रकार इसने अधिक प्रयोगात्मक स्थिरता सुनिश्चित की है।
अनसर्लिंक किए गए कंकाल की पेशी से नाभिक अलगाव के अन्य प्रोटोकॉल भी सूचित किये गये हैं। दो अध्ययनों में उर्वरक अवरोष्ठता के उपयोग के लिए नाभिक को उर्वरित उर्वरकों और सेल मलबे 23 , 24 से अलग करने के लिए वर्णित किया गया है। जबकि सुक्रोज़ या कोलाइडयन ग्रेडिएंट अल्ट्रेंट्रिफ्यूगेशन अनसर्लिंकित मांसपेशियों के ऊतकों के साथ प्रभावी है, हमारे प्रयोगों से पता चला है कि क्रॉस-लिंकिंग के बाद, ग्रेडियेंट अल्ट्रेंट्रिफ्यूगेशन सेल डी से नाभिक को अलग करने में असफल रहा हैढाल पर एब्रिस
हमने इसलिए क्रॉस-लिंक्ड माउस कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों का उपयोग करते हुए उच्च-गुणवत्ता वाले नाभिक को अलग करने की प्रक्रिया विकसित की है। ग्रिडिएन्ट अल्ट्रेंसिफिग्यूशन के बजाय, हमने मलबे से नाभिक को प्रभावी रूप से अलग करने के लिए एक सीरियल निस्पंदन विधि तैयार की थी। अल्ट्रासॉनिकेशन के बाद, चिप अध्ययनों के लिए क्रोमेटिन के नमूनों को सफलतापूर्वक लागू किया गया, जिसमें प्रमोटर्स को लक्षित करने के लिए बाध्यकारी बीएमएमएल 1 प्रोटीन के सर्कैडियन पैटर्न दिखाए गए। हमारी विधि मांसपेशियों के ऊतकों के विभिन्न यंत्रवत् अध्ययनों के लिए मोटे तौर पर लागू हो सकती है।
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Protocol
संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसीसी) के दिशा-निर्देशों के तहत पशु देखभाल का प्रदर्शन किया गया और ह्यूस्टन के टेक्सास स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र द्वारा अनुमोदित एक पशु प्रोटोकॉल के अनुसार प्रक्रियाएं आयोजित की गईं।
1. क्रॉस-लिंक्ड स्केलेटल स्नायु से नाभिक अलगाव
- बर्फ के ठंडे फॉस्फेट में लगभग 20-हफ्ते पुराने C57BL / 6 पुरुष चूहों से पृथक हिंद अंग कंक्रीट की मांसपेशियों को वजन और छानना, पहले 22 में विस्तार से वर्णित खारा (पीबीएस) बफर किया गया था।
नोट: हम आमतौर पर एक माउस से कंकाल की मांसपेशियों की 1.0 - 1.5 ग्राम प्राप्त करते हैं।- बर्फ पर 10 मिलीलीटर पीबीएस वाले 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में कंकाल की मांसपेशियों के ऊतक को काट लें।
- 5 मिनट के लिए 300 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र
- आकांक्षा से पीबीएस सतह पर तैरने वाले को ध्यान से हटा दें
- 1, 2, 3 और 4 एमएल पानी के साथ संदर्भ ट्यूब का उपयोग करके प्रत्येक 50-एमएल ट्यूब में गोली मात्रा का आकलन करें।
- 7 खंडों का जोड़ेंपीबीएस में बर्फ-ठंडा 1% फॉर्मलाडेहाइड और जांच के ऊतक होमोजिनायझर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके बर्फ पर नमूनों को होमोज़ाइज़ करें।
नोट: वैकल्पिक: होमोजीनाइजेशन प्रक्रिया को एक ठंडे कमरे में आयोजित किया जा सकता है। - 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर incubating द्वारा नमूना क्रॉस-लिंक करें
- 1 एम ग्लाइसीन को 0.125 एम के अंतिम एकाग्रता में जोड़ने और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हुए क्रॉस-लिंकिंग प्रतिक्रिया को बुझाना।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 3,000 XG पर नमूनों को अपकेंद्रित्र आकांक्षा के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला निकालें
- 10 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा बेस बफर (10 एमएम HEPES-KOH 7.3 पीएच, 10 एमएम EDTA, 10 एमएम केएलएल, 5 एमएम एमजीसी 2 , 0.5 एमएम डीटीटी) के साथ कुल्ला, ताजा जोड़े प्रोटीज इनहिबिटर (0.2 एमएम फिनाइलमेथिलसफॉलिक फ्लोराइड (पीएमएसएफ) युक्त , और 10 माइक्रोग्राम / एमएल लियूप्टीन) 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 3,000 ग्राम पर अपकेंद्रित्र और आकांक्षा द्वारा सतह पर तैरने वाले को ध्यान से हटा दें।
- 6 मिलीलीटर के लिसेशन बफर (10 मिमी एचईपीईएस-पीओपी) में गोली को फिर से खोलेंएच 7.3, 10 मिमी ईडीटीए, 10 मिमी केएलएल, 5 मिमी एमजीसी 2 , 0.5 मिमी डीटीटी, 1% ट्राइटन एक्स -100) जिसमें ताजा जोड़े प्रोटीज अवरोधक (0.2 मिमी पीएमएसएफ, और 10 माइक्रोग्राम / एमएल लियूप्टीन) शामिल हैं।
- नमूना को प्रीच्रिल्ड 15 एमएल डूऑन होमोजीनजर में ट्रांसफर करें और बर्फ पर 10 मिनट के लिए सेते रहें। ड्यूसिंग बर्फ पर प्रत्येक नमूना को 15 धीमी गति से स्ट्रोक के साथ दोहराएं जिससे कि 15 स्ट्रोक के साथ तने मूसल के साथ नाभिक को छोड़ दें।
- कोशिका छलनी के माध्यम से homogenate (6 एमएल) फ़िल्टर करें (ताकना आकार: 100 माइक्रोन) और 4 एमएल का लिसेशन बफर के साथ कुल्ला। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1000 xg पर नमूनों को अपकेंद्रित्र 5 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे बेस बफर में पुन: श्वास और 10 बार घूमते हुए नाभिक छोड़ने के लिए तंग मूसल के साथ।
- स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (OD260 / OD280) के साथ डीएनए एकाग्रता माप के लिए 20 μL का एक विभाज्य निकालें और यदि आवश्यक हो तो ट्राइपएप नीले रंग के साथ सूक्ष्म अवलोकन (नीचे देखें) ( चित्रा 1 ए )।
- निलंबन के माध्यम से फ़िल्टर करेंएक सेल झरनी (ताकना आकार: 70 माइक्रोन), ट्यूब को कुल्ला और इसके बाद के संस्करण के रूप में 2 एमएल बेस बफर के साथ फिल्टर करें।
- धीरे-धीरे कम ताकना आकार (40 सुक्ष्ममापी, 30 माइक्रोग्राम, 20 माइक्रोन और 10 माइक्रोन) के सेल स्ट्रेनर्स के साथ चरण 1.13 के रूप में छानने का काम दोहराएं।
नोट: कुल में, 6 बीम के आकार के स्ट्रेनर्स 1.12-1.14 के चरणों में उपयोग किए गए थे - 1,000 ग्राम में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला निकालें और गोली को 500 μL बेस बफर में रीसस्पेंड करें।
- ऊपर के रूप में डीएनए एकाग्रता को मापें
नोट: लगभग 200 माइक्रोग्राम न्यूक्लिक डीएनए एक जानवर से दोनों अंगों के संयोजन के संयोजन से प्राप्त किया गया था। वैकल्पिक रूप से, trypan नीले धुंधला (स्टॉक एकाग्रता 0.4%, 1: 5 कमजोर पड़ने) के साथ सूक्ष्म अवलोकन के लिए 20 μL बचाओ; नाभिक नीले रंग ( चित्रा 1 बी ) को दाग देगा। - 1000 ग्राम में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर पेलेट
2. सोनिकिंग
<ol>नोट: sonication efficacy के मूल्यांकन के लिए एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है।
3. सोनिकिंग और मात्रा का मूल्यांकन
- 1.0 जोड़ेंआरएनसी ए (500 यू / एमएल आरएनस ए: 20,000 यू / एमएल आरएनज़ टी 1) के μL को बचाया 50 μL sonicated नमूने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
- 8 μL प्रोटीज़ कश्मीर (10 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें और 55 मिनट से कम से कम 55 डिग्री सेल्सियस तक लें।
- एक डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके डीएनए काटा।
- बाध्यकारी बफर के 5 संस्करण जोड़ें, इसे स्पिन कॉलम पर लागू करें, और 4,000 xg, 10 मिनट में अपकेंद्रित करें।
- पास-थ्रू एक ही कॉलम पर लागू करें और फिर से अपकेंद्रित करें।
- वॉशिंग बफ़र से दो बार 13,000 xg, 1 मिनट में धो लें
- स्तंभ को सूखने के लिए 13,000 xg, 1 मिनट में फिर से अपकेंद्रित्र।
- एच 1 ओ के 50 μL और अपकेंद्रित्र 13,000 xg, 1 मिनट डीएनए को कुचलने के लिए जोड़ें।
- पास-थ्रू एक ही कॉलम पर लागू करें और फिर से अपकेंद्रित करें।
- स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (OD260 / OD280) के साथ डीएनए की मात्रा को बढ़ाएं। Sonicated उत्पादों ( चित्रा 2 ) के आकार और राशि (1 माइक्रोग्राम) का मूल्यांकन करने के लिए 0.8% जैल पर नमूने चलाएं।
नोट: औसत क्रोमेटिन उपज लगभग ~ 20% है
4. चिप
- -80 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व में सहेजे गए क्रोमेटिन को पिघलना और क्रोमेटिन को ~ 100 से 120 μg प्रति ट्यूब पर विभाजित करना। रेडियोममोनोपेरेबसाइट परख (आरआईपीए) बफर (20 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 7.4), 150 एमएम नाओक्ल, 1 एमएम ईडीटीए, 1 एमएम एनएफ़, 1 एमएम एनए 3 वी ओ 4, 1 एमएम पीएमएसएफ, 1 एक्स प्रोटेस अवरोधक कॉकटेल (पीआईसी), 0.1% एन-डीओओओओसिकोलेट W / v), 1% ट्राइटन एक्स -100)।
- यदि प्रत्येक समूह में कई नमूने हैं, तो 100 ~ 120 μg / नमूना की अंतिम राशि में क्रोमेटिन डीएनए की बराबर मात्रा में गठबंधन करें। इनपुट के रूप में 10% बचाएं
- बीएसए-पूर्व-अवरुद्ध (~ 2 एच, 4 डिग्री सेल्सियस) प्रोटीन ए / जी एगरोज़ (गैर-चिकन एंटीबॉडी) या आईजीवी मोती (चिकन एंटीबॉडी) के 40 μL (आरआईपीए बफर में 50% वी / वी घोल) और जोड़ें 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए एक रोटेटर
- 1,000 xg, 10 मिनट पर अपकेंद्रित्र और ध्यान से नए ट्यूबों पर सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण।
- एंटीबॉडी 1 प्रति ग्राम एंटीबॉडी प्रति ~ जोड़ें25 - 100 माइक्रोग्राम क्रोमैटिन डीएनए
- लगभग 15 आरपीएम पर धीरे-धीरे 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं।
- प्रोटीन ए / जी एगरोज़ (गैर-चिकन एंटीबॉडी) या आईजीवी मोती (चिकन एंटीबॉडी) मिश्रण और 2 घंटे के लिए ठंडे कमरे में घुमाने के लिए बीएसए-पूर्व अवरुद्ध (~ 2 एच, 4 डिग्री सेल्सियस) के 10 μL जोड़ें।
- धो के रूप में निम्नानुसार धो लें तीन मिनट के लिए 1 एमएल आरआईपीए बफर के साथ धो लें, दो मिनट के लिए 1 मि.ली. उच्च नमक बफर (20 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 7.4), 500 एमएम नाओक्ल, 2 एमएम ईडीटीए, 1 एमएम पीएमएसएफ, 1% ट्राइटन एक्स -100) के साथ धो लें। , लीमल बफर के 1 एमएल (20 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 7.4), 250 एमएम लीक्ल, 2 एमएम ईडीटीए, 1 एमएम पीएमएसएफ, 1% एन-डीओओइओएक्साइकोलेट, 0.5% एनपी 40) से 3 मिनट में दो बार धो लें।
- ट्रिस-ईडीटीए (ते) बफर (10 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 7.4), 1 एमएम ईडीटीए) के 1 एमएल के साथ धो लें और 3 मिनट में एक बार। फिर एल्यूशन बफर (20 मिमी त्रि-एचसीएल, 5 एमएम ईडीटीए और 0.5% एसडीएस) के साथ डीएनए चुप रहें।
- 1,000 ग्राम, 1 मिनट में अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला को ध्यान से हटा दें
- अलौकिक बफर के 50 μL के साथ मस्तिष्क को फिर से खोलें।
- 10 के लिए सेते65 डिग्री सेल्सियस पर न्यूनतम
- 5 मिनट के लिए 12,000 ग्राम पर अपकेंद्रित्र
- सतह पर तैरनेवाला को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें, एक और 50 μL जोड़ें और एक बार फिर से 12,000 ग्राम में 5 मिनट के लिए सेंटीफ्यूज करें। अंतिम क्षालन मात्रा 100 μL होगी।
- रिवर्स क्रॉटलिंकिंग और डीएनए अल्यूशन
- 65 डिग्री सेल्सियस पर रात भर eluted chromatin सेते हैं
- आरएनसी ए के 1.0 μL जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेवन करें।
- 8 μL प्रोटीज़ कश्मीर (10 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें और 55 मिनट से कम से कम 55 डिग्री सेल्सियस तक लें।
- निर्माता के प्रोटोकॉल के मुताबिक 50 μL पर क्षीण मात्रा के साथ एक पीसीआर क्लीनअप किट का उपयोग करके डीएनए काटा।
- वास्तविक समय qPCR द्वारा प्रोफ़ाइल का विश्लेषण करें जैसा कि पहले 25 , 26 वर्णित है।
नोट: प्राइमर अनुक्रम चित्रा 3 लीजेंड में सूचीबद्ध हैं। डेटा को ± एसईएम ( चित्रा 3 ) के रूप में प्रस्तुत किया गया है।
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Representative Results
यहां हमने रीयल-टाइम डीएनए प्रोटीन इंटरैक्शन को संरक्षित करने के लिए टिशू कलेक्शन के तुरंत बाद फार्मलाडिहाइड क्रॉस-लिंकिंग किया था। हालांकि, हमने पाया कि सूक्रोज या कोलाइडयन ढाल, जो सामान्यतः नाभिक अलगाव 23 , 24 के लिए उपयोग किया जाता है, नाभिक को मायोफिब्रिल से अलग करने में प्रभावी नहीं था (डेटा नहीं दिखाया गया है)। कारण यह हो सकता है कि क्रॉस-लिंकिंग ने नाभिक और मायोफिब्रिल के लिए समान गुरुत्व प्रदान किया। इसलिए, हमने नाभिक अंश से बड़े मायोफिब्रिल और अन्य मलबे को प्रभावी ढंग से हटाने के लिए एक सीरियल निस्पंदन प्रक्रिया विकसित की है। 100 माइक्रोन फिल्टरिंग के बाद, बड़े टिशू मलबे और मायोफिब्रिल ( चित्रा 1 ए ) अभी भी थे। तुलना में, अनुक्रमिक निस्पंदन के अंत में, बड़े टिशू मलबे, बरकरार कोशिकाओं और बड़े मायोफिब्रिल को सफलतापूर्वक निकाल दिया गया ( चित्रा 1 बी )।
27 या माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ) 28 जैसे कुछ ऊतकों के लिए सोनाई में सुधार हो सकता है, हमारे अनुभव में यह कंकाल की मांसपेशियों के नाभिक के दोहन में हस्तक्षेप करता है और इसका व्यापक रूप से संकेत मिलता है अप्रभावी sonication एसडीएस lysis बफर में निलंबन के बाद तत्काल sonication के साथ प्रयोग में हमने क्रोमेटिन के साथ कुशल sonication को धीरे-धीरे चक्र-आधारित तरीके से कटा हुआ देखा और अंत में ~ 500 बीपी डीएनए टुकड़े ( चित्रा 2 ) का उत्पादन किया। Lysis बफर में पूर्व ऊष्मीकरण ने दयनीय रूप से सोनिक दक्षता के साथ समझौता किया।
ठगने के लिएचिप के लिए क्रोमेटिन की तैयारी की गुणवत्ता, हमने सर्कैडियन प्रतिलेखन कारक BMAL1 के डीएनए बाध्यकारी की जांच की, जिसमें क्रमशः Zeitgeber समय (जेडटी) 6 और जेडटी 18 क्रमशः 18 , 2 9 में बाध्यकारी शिखर और गर्त दिखाया गया था। सी 57 बी / 6 जे चूहों से कंकाल की मांसपेशियों के नमूनों को ZT6 और ZT18 में एकत्र किया गया था, और ऊपर के रूप में क्रोमेटिन के नमूने तैयार किए गए थे। संक्षेप में, sonication के बाद, कटा हुआ chromatin नमूनों IgY मोती के साथ पहले से मंजूरी दे दी गई थी जिन्हें बीएसए के साथ पूर्व अवरुद्ध किया गया है और इसके बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर रात में 4-बीएमएएल एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया जाता है। क्रोमेटिन के क्षीणन और शुद्धिकरण के बाद, हमने दो लक्ष्य जीन, एनआर 1 डी 1 और डीबीपी 30 के ई-बॉक्स तत्वों पर BMAL1 बाइंडिंग को पहचानने के लिए आरटी- क्यूपीसीआर किया । हमने ZT6 पर ई-बॉक्स तत्वों पर BMAL1 के लिए मजबूत बंधन का पता लगाया और ZT18 पर न्यूनतम बाध्यकारी ( Nr1d1 : 0.452 ± 0.022 बनाम 0.039 ± 0.002, डीबीपी -0.4: 0.627 ± 0.013 बनाम 0.062 ± 0.009, डीबीपी+0.8: 0.176 ± 0.013 बनाम 0.008 ± 0.001, डीबीपी +2.4 : 0.466 ± 0.010 बनाम 0.122 ± 0.014; सभी मानों का मतलब ± SEM है) ( चित्रा 3 ), कंकाल की मांसपेशियों में समय-प्रति संवेदनशील प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल को मान्य करता है।
चित्रा 1 : अनुक्रमिक छानने का काम प्रभावी रूप से हटाया गया ऊतक मलबे (ए) 100 माइक्रोन निस्पंदन के बाद नमूने दिखा प्रतिनिधि छवियाँ। बड़े ऊतक और फाइबर मलबे मनाया जाता है। (बी) सीरियल निस्पंदन के बाद नमूने दिखा प्रतिनिधि छवियाँ। बड़े फाइबर मलबे को मंजूरी मिली थी। केवल पृथक नाभिक और छोटे myofibril टुकड़े मनाया जाता है। चित्र 10X, 20X और 40X आवर्धन पर एक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करके लिया गया। स्केल सलाखों के दाहिने हाथ वाले पैनल पर दिखाए जाते हैंइस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 2 : सोनिकिंग के 10 चक्रों के माध्यम से प्रगतिशील क्रोमैटिन श्रेड्डिंग। पचाने वाला क्रोमैटिन डीएनए ~ 500 बीपी के साथ sonication के दस चक्र, जैसा कि 0.8% agarose जेल में पता चला है, 150 मिनट के लिए 60 मिनट में चलाया जाता है। 1 घंटे के लिए बर्फ-ठंडे एसडीएस लिसेफेशन बफर में प्री-इक्यूबेशन के बाद सही पैनल में कम सोनाटी दक्षता दर्शायी गयी है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
फाईअनुच्छेद 3 : जीएमटी 1 और जेडटी 18 में इकट्ठा किए गए माउस स्कैटल मस्जिद नमूनों के साथ बीएमएएल 1 चिप के लिए प्रतिनिधि qPCR परिणाम। डेटा को ± एसईएम मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जाता है डीबीपी -0.4, +0.8 और +2.4 डीबीपी जीन पर ई-बॉक्स तत्वों के स्थान दर्शाते हैं। नेकां: आईजीवी के साथ नकारात्मक नियंत्रण BMAL1 बाइंडिंग का अस्थायी पैटर्न पिछली परिणाम के साथ संगत है जिसमें बीएमएमएल 1 बाध्यकारी शिखर दिखाता है जो कि ZT6 18 के आसपास होता है। आगे और रिवर्स प्राइमरों निम्नानुसार हैं: Rev-erba: 5'-GTAGACTACAAATCCCAACAATCCTG, और 5'-TGGAGCAGGTACCATGTGATTC; डीबीपी -0.4: 5'-एसीसीसीसीजीसीएटीसीजीएटीएजीसी, और 5'-सीसीएटीटीसीजीजीजीसीसीएएटीएजीएजी; डीबीपी +0.8: 5'- ATGCTCACACGGTGCAGACA, और 5'- CTGCTCAGGCACATTCCTCAT; डीबीपी +2.4: 5'- टीजीजीजीएसीजीसीसीटीजीजीजीटीएसीएसी, और 5'- जीजीजीएटीजीटीजीसीएजीसीएक्टजीजीटीटी। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
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Discussion
यहां हम एक मजबूत विधि का वर्णन करते हैं जहां उच्च-गुणवत्ता वाले नाभिक को अलग करने के लिए कंकाल से जुड़ी कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों का इस्तेमाल किया गया था। मलबे से नाभिक को प्रभावी ढंग से अलग करने के लिए अनुक्रमिक छानने का काम किया गया था, और डिश-आकार के ट्रांसड्यूसर से अल्ट्रासोनिक ध्वनिक ऊर्जा ने चीप विश्लेषण के लिए क्रोमैटिन का प्रयोग किया था। प्रमोटरों को निशाना बनाने के लिए परिणामों ने BMAL1 के सर्कैडियन समय-विशिष्ट बंधन दिखाए।
क्रॉस-लिंकिंग होने पर जीनोमिक डीएनए पर वास्तविक समय प्रोटीन पर कब्जा करने के लिए चीप को नियोजित किया जा सकता है। इस क्षमता का लाभ उठाने के लिए, हम ऊतक विच्छेदन के समय कंकाल की मांसपेशियों के क्रॉस-लिंकिंग को अनुमति देने के लिए एक विधि विकसित करना चाहते थे और ढाल अल्ट्रेंट्रिफ्यूगेशन के बिना नाभिक अलगाव को सरल बनाने के लिए करते थे। यकृत के रूप में नरम ऊतकों की तुलना में फाइबर की समृद्ध कंकाल की मांसपेशी को बनाने में कठिनाई के कारण, हम बर्फ-ठंडा पीबीएस में मांसपेशियों के ऊतक को काटकर बनाते हैं और फिर एक फार्मलाडहाइड बफर में नमूना को एकजुट करते हैं। शमन के बाद, ऊतक निलंबन वाकिसी भी शेष formaldehyde को कुल्ला करने के लिए बर्फ-ठंडा आधार बफर के साथ सेंटीफ्यूज और भूनें। नाभिक को डूऑन होमोजनाइजेशन द्वारा जारी किया गया था, और होमोजेंट्स क्रमिक रूप से सेल मलबे और मायोफिब्रिल को धीरे-धीरे हटाए जाने के लिए फ़िल्टर्ड किया गया था। हमने फिल्टर क्लॉजिंग को कम करने के लिए निस्पंदन की श्रृंखला तैयार की जो कि उपज पर प्रतिकूल प्रभाव डाल सकती है। केवल बहुत ही कम मायोफिब्रिल बने रहे जब अनुक्रमिक निस्पंदन पूरा हो गया।
सोनीकरण और चिप प्रक्रियाओं को पिछले रिपोर्ट से 12 रूपांतरित किया गया था, जिसमें सुधारों के साथ-साथ सोओटिकिंग टाइमिंग और एसडीएस बफर रकम भी शामिल थी। पकवान के आकार वाले सोनिकेटर ठंडे पानी के नहाने में कांच के शीशियों के नमूनों के लिए केंद्रीकृत अल्ट्रासोनिक तरंग के संपर्क की अनुमति देता है। जांच sonicators के मुकाबले, इस sonicator नमूना तापमान नियंत्रित करने के लिए overheating से बचने के लिए, और भी नमूना पार संदूषण रोकता है। अगर जांच सोनीकेटर का उपयोग किया जाता है, तो इष्टतम बायोटेक्शन शर्तों को अनुभवपूर्वक निर्धारित किया जाना चाहिए। हम भी कम कर दिया amounएसडीएस बफर का टी क्योंकि मांसपेशियों क्रोमेटिन की पैदावार यकृत 12 से कम है कई प्रोटोकॉल 28 , 31 , 32 में शामिल हैं बर्फ पर या ऊष्मायन पर कमरे के तापमान से पहले sonication। हालांकि, हमारे अनुभव में, बर्फ पर पूर्व-ऊष्मायन सोनिक दक्षता में सुधार नहीं हुआ। वास्तव में, कुछ उदाहरणों में सोनाईज समझौता किया गया था। यह संभव है कि अवशिष्ट myofibrils ऊष्मायन और attenuated sonication प्रभावकारिता के दौरान chromatin डीएनए उलझा। एसडीएस लिसेफेशन बफर में नाभिक निलंबन के तुरंत बाद, हम बढ़ते हुए सोनाइकल चक्र ( चित्रा 2 ) के साथ प्रगतिशील क्रोमेटिन विखंडन प्राप्त करने में सफल रहे।
हमने चिप qPCR के साथ क्रोमैटिन की गुणवत्ता को मान्य किया है। जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है, BMAL1 प्रमोटर अधिभोग ZT6 पर मजबूत था और ZT18 पर कम से कम था, जो पहले बीएमएमएल 1 के साथ दिखाया गया थादीन प्रमोटर बाइंडिंग 18 इस कार्यात्मक परख ने नाभिक और क्रोमेटिन की गुणवत्ता की पुष्टि की। हाल के वर्षों में, एनजीएस में तेजी से विकास ने चिप अनुप्रयोग के लिए एक नया क्षितिज खोला, जहां चिप-सेक मात्रात्मक रूप से उच्च संवेदनशीलता 17 के साथ जीनोमिक बाध्यकारी पूछताछ कर सकता है। विशेष रूप से चिप-सेक, उच्च-गुणवत्ता वाले नाभिक और क्रोमैटिन के लिए प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन को लगातार कब्जा करना आवश्यक है। यहां वर्णित प्रक्रिया कंकाल की मांसपेशियों का उपयोग कर चिप-सेक अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण संसाधन का गठन कर सकती है। नोट, चिप-सेक पुस्तकालय तैयारी संकेत संकल्प में सुधार के लिए अतिरिक्त उपायों की आवश्यकता है, जैसे पृष्ठ-आधारित आकार चयन 18
अंत में, हमने क्रॉस-लिंक्ड कंकाल स्नायु से उच्च गुणवत्ता वाली नाभिक तैयार करने के लिए एक निस्पंदन-आधारित प्रोटोकॉल विकसित किया है। हम ultracentrifugation की आवश्यकता को दूर करते हैं, इसे आसानी से लागू करते हैं। हित के जीनों के लिए चिप के अलावा, नाभिक और क्रोमैटिन जनसंपर्कवर्णित रूप में वर्णित चक्र-सीक अध्ययनों के लिए मोटे तौर पर लागू किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
उपयोगी सलाह के लिए हम कैरन एस्सार, नोबुया कोइक और नोहॉन पार्क का धन्यवाद करते हैं इस काम को एनआईएच / एनआईजीएमएस (आर -101 जीएम 114424) एस-एचवाई और रॉबर्ट ए। वेल्च फाउंडेशन (एयू -1731) और एनआईएच / एनआईए (आरएपीएजीए 080828) को जेसीसी से समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Fisher Scientific | 15250061 | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| Protease K | Sigma Aldrich | 3115887001 | |
| Chicken Anti-BMAL1 antibody | Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318 - 579, and IgY was affinity purified using the same antigen. | ||
| Chicken IgY Precipitating Resin | GenScript | L00405 | |
| Equipment | |||
| KINEMATICA Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-178 | |
| 15 mL Dounce tissue grinder | Whearton | 357544 | |
| Falcon Cell Strainers 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| Falcon Cell Strainers 70 µm | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Falcon Cell Strainers 40 µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| pluriStrainer 30 µm | PluriSelect | 43-50030-03 | |
| pluriStrainer 20 µm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| pluriStrainer 10 µm | PluriSelect | 43-50010-03 | |
| Covaris S2 Focused-ultrasonicator | Covaris | Model S2 | |
| Labquake | Thermo Scientific | C415110 | |
| CCD Microscope Camera | Leica Microsystems | DFC3000 G | |
| Reagent Kit | |||
| DNA extraction kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| Buffers | |||
| All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich |
References
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