Summary
Мы представляем протокол, основанный на фильтрации, для выделения высококачественных ядер из сшитой скелетной мышцы скрещивания, в результате чего мы устраняем необходимость в ультрацентрифугировании, что делает его легко применимым. Мы показываем, что хроматин, полученный из ядер, подходит для иммунопреципитации хроматина и, вероятно, исследований хромогена иммунопреципитации.
Abstract
Хроматиновая иммунопреципитация (ChIP) является мощным методом определения связывания белка с ДНК хроматина. Однако богатая волокнами скелетная мышца была проблемой для ЧИП из-за технических трудностей в изоляции высококачественных ядер с минимальным загрязнением миофибрилл. Предыдущие протоколы пытались очистить ядра перед сшиванием, что сопряжено с риском изменения взаимодействия ДНК-белка во время процесса подготовки длительных ядер. В текущем протоколе мы сначала скрещивали скелетную мышечную ткань, собранную у мышей, и ткани измельчали и обрабатывали ультразвуком. Поскольку мы обнаружили, что ультрацентрифугирование не способно отделять ядра от миофибрилл, используя сшитую мышечную ткань, мы разработали последовательную процедуру фильтрации для получения высококачественных ядер, лишенных значительного миофибрильного загрязнения. Затем мы получали хроматин с помощью ультразвукового анализатора, а анализы ChIP с антителом против BMAL1 выявили устойчивое циркадное связываниеОбразец BMAL1 для целевых промоторов генов. Этот протокол фильтрации представляет собой легко применимый метод выделения высококачественных ядер из сшитой ткани скелетных мышц, что позволяет проводить последовательную обработку проб для суточных и других чувствительных к времени исследований. В сочетании с секвенированием следующего поколения (NGS) наш метод может быть развернут для различных механистических и геномных исследований с упором на функцию скелетных мышц.
Introduction
Скелетные мышцы играют важную роль в физиологии и поведении. Многонуклеированное мышечное волокно состоит из миофибрилл, где функциональные единицы актина и миозина образуют саркомеры для создания сократительной силы. Скелетные мышцы также являются крупнейшим метаболическим органом в организме, что составляет> 80% потребления постпрандиальной глюкозы на 80% и регулирует реакцию инсулина и метаболический гомеостаз 1 , 2 . Физиология мышц и метаболизм тесно регулируются циркадианными часами, внутренним биологическим таймером 3 , 4 , 5 , 6 . Например, скелетная мускулативная делеция Bmal1 , одного из основных циркадных компонентов часов, привела к резистентности к инсулину и уменьшению поглощения глюкозы в скелетных мышцах, и у животных, как было установлено, развился диабет 2 типа. яКроме того, скелетные мышцы также все чаще оцениваются как эндокринный орган 8 , выделяя миокины для регулирования системного метаболизма и физиологии. Механические исследования необходимы для полного понимания этих регуляторных функций в скелетных мышцах.
ChIP является мощным подходом к разграничению рекомбинации промоторов ДНК-связывающих белков. Первоначально ChIP был разработан для идентификации нуклеосомной организации на ДНК хроматина 9 , 10 . С тех пор сообщалось о различных методах сшивания белков и хроматиновой ДНК с использованием формальдегида, диметилсульфата или ультрафиолетового облучения (УФ) 11 , 12 . Формальдегидная сшивка является наиболее часто используемой, сохраняющей структуру хроматина и ДНК-белковыми взаимодействиями 9 , 13 , 14 . Сшитая хроматографияIn, измельчается ультразвуком и иммунопреципитируется антителом против специфического связывающего ДНК белка, представляющего интерес 15 , 16 . В последние годы было разработано ChIP-секвенирование (ChIP-seq), метод, объединяющий ChIP с NGS, для опроса связывания фактора транскрипции генома 17 , а в некоторых случаях для мониторинга динамических изменений за время 18 , 19 , 20 , Например, циркадные исследования ChIP-seq выявили высокоорганизованную последовательность геномного связывания циркадных часовых компонентов и гистоновых маркеров, которые приводят к временной точной экспрессии генов в течение 24-часового циркадного цикла 18 .
Большинство доступных протоколов ChIP предназначены для мягких тканей ( например, печени, головного мозга и т. Д. ), И очень немногие были опубликованы для твердых тканей, включая скелеМышцы. Технически сложно гомогенизировать богатую клетчаткой скелетную мышцу и изолировать высококачественные ядра 21 , особенно для экспериментов ChIP, которые требуют сшивания. В недавнем исследовании ChIP 22 мышц сателлитные клетки были отделены от миофибрилл, и ядра были получены из обоих типов клеток с помощью продолжительной процедуры, включающей переваривание тканей. Весь процесс занимает примерно три часа, чтобы завершить сшивку формальдегида на изолированных ядрах. В то время как в этой процедуре избегалось сшивание мышечного волокна, что делает мышечную ткань еще более огнестойкой для эффективной гомогенизации и способно производить высококачественные ядра, значительная временная задержка от сбора тканей до сшивания ядер приводит к риску изменения ДНК -протеинового взаимодействия. В отличие от этого, большинство исследований выполняли сшивание сразу после экспериментального лечения или сбора ткани, чтобы сохранить ДНК-протеины в реальном времениN привязка 12 . Второй недостаток изоляции ядер перед сшиванием состоит в том, что он исключает приложения, чувствительные к времени, такие как циркадный сбор проб, который обычно происходит с интервалами 3-4 ч. Без поперечной сшивки ядер изоляция должна протекать сразу же после вскрытия, тогда как сшитые образцы могут быть обработаны вместе по завершении всего времени, что обеспечивает большую экспериментальную согласованность.
Сообщалось также о других протоколах для изоляции ядер от несшитых скелетных мышц. В двух исследованиях описывалось использование градиентного ультрацентрифугирования для отделения ядер от оставшихся миофибрилл и клеточного мусора 23 , 24 . В то время как ультрацентрифугирование сахарозы или коллоидного градиента эффективно с несшитыми мышечными тканями, наши эксперименты показали, что после сшивания градиентное ультрацентрифугирование не позволяет отделить ядра от клетки dEbris на градиенте.
Поэтому мы разработали процедуру выделения высококачественных ядер с использованием сшитых мышечных тканей скелетных мышц. Вместо градиентного ультрацентрифугирования мы разработали метод последовательной фильтрации для эффективного отделения ядер от мусора. После ультразвукового исследования образцы хроматина были успешно применены для исследований ChIP, которые показали циркадную картину связывания белка BMAL1 с целевыми промоторами. Наш метод может быть широко применим для различных механистических исследований мышечных тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Уход за животными осуществлялся в соответствии с руководящими принципами Комитета по институциональному уходу и использованию животных (IACUC), и процедуры проводились в соответствии с протоколом животных, одобренным Научным центром здоровья Университета Техаса в Хьюстоне.
1. Изоляция ядер из сшитой скелетной мышцы
- Взвешивают и сжимают скелетную мышцу задней конечности, изолированную от приблизительно 20-недельных мышей C57BL / 6 самцов, в ледяном забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS), как подробно описано ранее 22 .
ПРИМЕЧАНИЕ. Обычно мы получаем 1,0-1,5 г скелетной мышцы от одной мыши.- Поместите измельченную ткань скелетных мышц в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 10 мл PBS на льду.
- Центрифуга при 300 xg при 4 ° C в течение 5 мин.
- Тщательно удалите супернатант PBS путем аспирации.
- Оцените объем гранул в каждой 50-миллилитровой пробирке, используя контрольные трубки с 1, 2, 3 и 4 мл воды.
- Добавить 7 томовЛедяного 1% формальдегида в PBS и гомогенизации образцов на льду с использованием зондирующего тканевого гомогенизатора (см. Таблицу материалов ).
ПРИМЕЧАНИЕ. Дополнительно: процедуру гомогенизации можно проводить в холодной комнате. - Сшивают образец, инкубируя при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Закалка реакции сшивания путем добавления 1 М глицина до конечной концентрации 0,125 М и инкубации в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Центрифугировать образцы при 3000 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Удалите супернатант путем аспирации.
- Промойте 10 мл ледяного базового буфера (10 мМ HEPES-KOH при pH 7,3, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ KCl, 5 мМ MgCl 2 , 0,5 мМ DTT), содержащие свежезамещенные ингибиторы протеазы (0,2 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF) , И 10 мкг / мл лейпептина). Центрифугируют при 3000 г в течение 5 мин при 4 ° С и осторожно удаляют супернатант путем аспирации.
- Ресуспендируют гранулу в 6 мл буфера для лизиса (10 мМ HEPES-KOH при pH 7,3, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ KCl, 5 мМ MgCl 2 , 0,5 мМ DTT, 1% Triton X-100), содержащие свежезамещенные ингибиторы протеазы (0,2 мМ PMSF и 10 мкг / мл леупептина).
- Перенесите образец в предварительно охлажденный 15 мл гомогенизатор Dounce и инкубируйте в течение 10 минут на льду. Дозирование гомогенизирует каждый образец на льду с 15 медленными ударами, используя рыхлый пестик, а затем 15 ударов с жестким пестиком для высвобождения ядер.
- Фильтруют гомогенат (6 мл) через сетчатый фильтр (размер пор: 100 мкм) и промывают 4 мл буфера для лизиса. Центрифугируйте образцы при 1000 мкг в течение 10 мин при 4 ° С. Ресуспендируют в 5 мл ледяного базового буфера и 10 раз удаляют с помощью жесткого пестика для высвобождения ядер.
- Удалите аликвоту 20 мкл для измерения концентрации ДНК спектрофотометром (OD260 / OD280) и микроскопическим наблюдением с трипановым синим, если это необходимо (см. Ниже) ( рисунок 1 A ).
- Фильтрация суспензии черезСетчатый фильтр (размер пор: 70 мкм), промыть пробирку и снова фильтровать 2 мл базового буфера, как указано выше.
- Повторите фильтрацию, как на стадии 1.13, с клеточными фильтрами с постепенно уменьшенным размером пор (40 мкм, 30 мкм, 20 мкм и 10 мкм).
ПРИМЕЧАНИЕ. В общей сложности на этапах 1.12-1.14 использовались фильтры размером 6 пор. - Центрифугируют при 1000 г при 4 ° С в течение 10 мин. Удалите супернатант и ресуспендируйте гранулу в 500 мкл базового буфера.
- Измерьте концентрацию ДНК, как указано выше.
ПРИМЕЧАНИЕ. Приблизительно 200 мкг нуклеиновой ДНК получали из сочетания обеих задних конечностей у одного животного. Необязательно, сэкономить 20 мкл для микроскопического наблюдения при окрашивании трипановым синим (концентрация в концентрации 0,4%, разбавление 1: 5); Ядра будут окрашиваться в синий цвет ( рисунок 1 B ). - Центрифугируют при 1000 г при 4 ° С в течение 10 мин и отбрасывают супернатант. Хранить гранулу при -80 ° C.
2. Ударение
<ол>ПРИМЕЧАНИЕ. Пример оценки эффективности ультразвука показан на рисунке 2 .
3. Оценка ультразвука и количественного определения
- Добавить 1.0Мкл РНКазы А (500 Е / мл РНКазы А: 20 000 Е / мл РНКазы Т1) до сохраненных 50 мкл ультразвуковых образцов и инкубировать в течение 30 мин при 37 ° С.
- Добавить 8 мкл протеазы К (10 мг / мл) и инкубировать 30 мин при 55 ° С.
- Убирайте ДНК с помощью набора для экстракции ДНК.
- Добавьте 5 объемов связующего буфера, примените его к спиновой колонке и центрифугируйте при 4000 x g, 10 мин.
- Нанесите проход на тот же столбец и снова центрифугируйте.
- Промыть промывочным буфером два раза при 13000 xg, 1 мин.
- Центрифугируйте снова при 13000 xg, 1 мин, чтобы высушить колонку.
- Добавить 50 мкл H 2 O и центрифугировать при 13000 xg, 1 мин для элюции ДНК.
- Нанесите проход на тот же столбец и снова центрифугируйте.
- Определите количество ДНК с помощью спектрофотометра (OD260 / OD280). Запустите образцы на 0,8% геля, чтобы оценить размер и количество (1 мкг) обработанных ультразвуком продуктов ( рисунок 2 ).
ПРИМЕЧАНИЕ. Средний выход хроматина составляет приблизительно ~ 20%.
4. Чип
- Оттепель ранее сохраненного хроматина при -80 ° C и аликвоты хроматина до ~ 100-120 мкг на пробирку. Разбавляют 1:10 с помощью буфера радиоиммунопреципитации (RIPA) (20 мМ Трис-HCl (pH 7,4), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ NaF, 1 мМ Na3VO4, 1 мМ PMSF, 1x коктейль ингибитора протеазы (PIC), 0,1% Na-деоксихолат ( Вес / объем), 1% Triton X-100).
- Если в каждой группе имеется несколько образцов, объедините равные количества хроматиновой ДНК с конечным количеством ~ 100-120 мкг / образец. Сохраните 10% в качестве входных данных.
- Добавить 40 мкл (50% об. / Об. Суспензии в буфере RIPA) BSA-предварительно заблокированного (~ 2 ч, 4 ° C) белков A / G агарозы (не-куриное антитело) или шариков IgY (куриное антитело) и инкубировать Вращатель в течение 3 часов при 4 ° C.
- Центрифуги на 1000 мкг, 10 мин и тщательно переносят супернатант в новые трубки.
- Добавить антитела на 1 мкг антитела на ~25 - 100 мкг хроматиновой ДНК.
- Поверните осторожно при 4 ° C в течение ночи при приблизительно 15 об / мин.
- Добавьте 10 мкл BSA-предварительно заблокированного (~ 2 ч, 4 ° C) белков A / G агарозы (не-куриное антитело) или шариков IgY (куриное антитело) и поверните в холодной комнате в течение 2 часов.
- Вымойте бусины следующим образом. Промыть 1 мл буфера RIPA в течение 3 мин дважды, промыть 1 мл буфера с высоким содержанием соли (20 мМ Трис-HCl (рН 7,4), 500 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF, 1% Triton X-100) в течение 3 мин дважды , Промывают 1 мл буфера LiCl (20 мМ Трис-HCl (рН 7,4), 250 мМ LiCl, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF, 1% Na-дезоксихолата, 0,5% NP40) в течение 3 мин дважды.
- Промыть 1 мл буфера Tris-EDTA (TE) (10 мМ Трис-HCl (pH 7,4), 1 мМ EDTA) в течение 3 мин один раз. Затем элюируют ДНК элюирующим буфером (20 мМ Трис-HCl, 5 мМ ЭДТА и 0,5% SDS).
- Центрифугируют при 1000 г, 1 мин и осторожно удаляют супернатант.
- Ресуспендируют шарик с 50 мкл буфера для элюции.
- Инкубировать в течение 10Мин при 65 ° С.
- Центрифуга при 12000 г в течение 5 мин.
- Перенесите супернатант в новую пробирку, еще раз добавьте еще 50 мкл и центрифугируют при 12000 г в течение 5 мин. Конечный объем элюирования составит 100 мкл.
- Обратное сшивание и элюция ДНК.
- Инкубируйте элюированный хроматин в течение ночи при 65 ° C.
- Добавить 1,0 мкл РНКазы А и инкубировать в течение 30 мин при 37 ° С.
- Добавить 8 мкл протеазы К (10 мг / мл) и инкубировать 30 мин при 55 ° С.
- Убирайте ДНК с помощью набора для очистки ПЦР с объемом элюирования в 50 мкл в соответствии с протоколом производителя.
- Проанализируйте профили в режиме реального времени qPCR, как описано ранее 25 , 26 .
ПРИМЕЧАНИЕ. Последовательности праймеров перечислены на рисунке 3 « Легенда» . Данные представлены как среднее ± SEM ( рисунок 3 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы проводили сшивание формальдегида сразу после сбора ткани для сохранения взаимодействия ДНК-белка в реальном времени. Однако мы обнаружили, что сахароза или коллоидный градиент, обычно используемый для выделения ядер 23 , 24 , не эффективен для отделения ядер от миофибрилл (данные не показаны). Причина может заключаться в том, что сшивание придавало аналогичную гравитацию для ядер и миофибрилл. Поэтому мы разработали процесс последовательной фильтрации для эффективного удаления крупных миофибрилл и других мусора из фракции ядер. После фильтрации 100 мкм все еще оставались крупные тканевые мусора и миофибриллы ( рис. 1А ). Для сравнения, в конце последовательной фильтрации большинство крупных тканевых обломков, интактных клеток и крупных миофибрилл были успешно удалены ( рис. 1В ).
27 или эмбриональный фибробласт (MEF) 28 , по нашему опыту он мешал обработке ультразвуком ядер скелетных мышц и приводил к широкому размытию, что указывало Неэффективная обработка ультразвуком. Используя текущий протокол с немедленной обработкой ультразвуком после суспензии в буфере для лизиса SDS, мы наблюдали эффективную обработку ультразвуком с хроматином, постепенно измельченным в зависящем от цикла образом и в конечном итоге продуцирующим фрагменты ДНК размером 500 п.о. ( рисунок 2 ). Предварительная инкубация в буфере для лизиса обнаруживала угрозу эффективности ультразвука.
ЧтобыТвердое качество подготовки хроматина для ChIP, мы исследовали связывание ДНК циркадного фактора транскрипции BMAL1, который показал связывание пика и корыта в момент Zeitgeber (ZT) 6 и ZT18, соответственно 18 , 29 . Образцы скелетных мышц у мышей C57B / 6J собирали на ZT6 и ZT18, и образцы хроматина готовили, как указано выше. Вкратце, после обработки ультразвуком измельченные образцы хроматина предварительно очищали шариками IgY, которые предварительно блокировали BSA с последующей инкубацией с антителом против BMAL1 при 4 ° C в течение ночи. После элюирования и очистки хроматина мы выполнили RT-qPCR для обнаружения связывания BMAL1 на элементах E-Box из двух целевых генов, Nr1d1 и Dbp 30 . Мы обнаружили устойчивое связывание BMAL1 с элементами E-box в ZT6 и минимальное связывание при ZT18 ( Nr1d1 : 0,452 ± 0,022 против 0,039 ± 0,002, Dbp-0,4 : 0,627 ± 0,013 против 0,062 ± 0,009, Dbp+ 0,8: 0,176 ± 0,013 против 0,008 ± 0,001, Dbp + 2,4: 0,466 ± 0,010 против 0,122 ± 0,014; Все значения являются средними ± SEM) ( рисунок 3 ), подтверждая протокол для анализа связывания фактора транскрипции с учетом времени в скелетной мышце.
Рисунок 1 : Последовательная фильтрация эффективно удалили мусор. (A) Репрезентативные изображения, показывающие образцы после фильтрации 100 мкм. Наблюдаются большие ткани и мусор. (B) Репрезентативные изображения, показывающие образцы после последовательной фильтрации. Большие мусорные частицы были очищены. Наблюдаются только изолированные ядра и небольшие фрагменты миофибрилл. Фотографии были сделаны с помощью светового микроскопа с увеличением 10X, 20X и 40X. Шкала шкалы показана на панелях с правой стороны.Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2 : Измельчение прогрессивного хроматина через 10 циклов ультразвука. Десять циклов обработки ультразвуком с переваренной ДНК хроматина до ~ 500 б.п., как показано в 0,8% агарозном геле, проводят при 150 В в течение 60 мин. Правая панель указывает на более низкую эффективность ультразвука после предварительной инкубации в ледяном буфере для лизиса SDS в течение 1 часа. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
FiGure 3 : Репрезентативные результаты qPCR для BMAL1 ChIP с мышечными образцами мышечной ткани, собранными на ZT6 и ZT18. Данные представлены как среднее ± SEM. Dbp -0.4, +0.8 и +2.4 указывают местоположения элементов E-Box на гене Dbp . NC: отрицательный контроль с IgY. Временная структура привязки BMAL1 согласуется с предыдущими результатами, показывающими пик связывания BMAL1 около ZT6 18 . Прямые и обратные праймеры заключаются в следующем. Rev-erba: 5'-GTAGACTACAAATCCCAACAATCCTG и 5'-TGGAGCAGGTACCATGTGATTC; Dbp -0,4: 5'-ACACCCGCATCCGATAGC и 5'-CCACTTCGGGCCAATGAG; Dbp +0,8: 5'-ATGCTCACACGGTGCAGACA и 5'-CTGCTCAGGCACATTCCTCAT; Dbp +2,4: 5'- TGGGACGCCTGGGTACAC и 5'-GGGAATGTGCAGCACTGGTT. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы опишем надежный метод, в котором сшитые скелетные мышечные ткани использовались для выделения высококачественных ядер. Была проведена последовательная фильтрация для эффективного отделения ядер от мусора, а ультразвуковая акустическая энергия от чашеобразного преобразователя срезала хроматин для анализа ChIP. Результаты показали циркадианное специфическое по времени связывание BMAL1 с целевыми промоторами.
ChIP можно использовать для захвата белка в реальном времени на геномную ДНК при сшивании. Чтобы воспользоваться этим потенциалом, мы стремились разработать метод, позволяющий сшивать скелетные мышцы во время диссекции тканей и оптимизировать изоляцию ядер без градиентного ультрацентрифугирования. Из-за сложности гомогенизации богатой клетчаткой скелетной мышцы по сравнению с мягкими тканями, такими как печень, мы измельчили мышечную ткань в ледяном PBS и затем гомогенизировали образец в формальдегидном буфере. После закалки суспензия ткани waЦентрифугируют и промывают ледяным базовым буфером для опорожнения любого оставшегося формальдегида. Ядра были выпущены путем гомогенизации Dounce, и гомогенаты последовательно фильтровали, чтобы постепенно удалить клеточный мусор и миофибриллы. Мы разработали серию фильтрации, чтобы свести к минимуму засорение фильтра, что может отрицательно сказаться на урожайности. Только очень короткие миофибриллы остались, когда последовательная фильтрация была завершена.
Процедуры обработки ультразвуком и ChIP были адаптированы из предыдущего отчета 12 с изменениями, включая время обработки ультразвуком и количество буфера SDS. Звукопоглощающий ультразвуковой аппарат позволяет экспонировать централизованную ультразвуковую волну для образцов в стеклянных флаконах в ванне с холодной водой. По сравнению с зондирующими ультразвуковыми аппаратами этот ультразвуковой датчик контролирует температуру образца во избежание перегрева, а также предотвращает перекрестное загрязнение образца. Если используются зондирующие ультразвуковые аппараты, оптимальные условия ультразвука должны определяться эмпирически. Мы также сократили amounТ SDS-буфера, поскольку выход мутационного хроматина ниже, чем у печени 12 . Несколько протоколов 28 , 31 , 32 включают инкубацию на льду или при комнатной температуре до обработки ультразвуком. Однако, по нашему опыту, предварительная инкубация на льду не улучшала эффективность ультразвука. Фактически, в некоторых случаях обработка ультразвуком была скомпрометирована. Возможно, что остаточные миофибриллы запутали ДНК хроматина во время инкубации и ослабленной эффективности ультразвука. При немедленной обработке ультразвуком после суспензии ядер в буфере для лизиса SDS нам удалось получить прогрессирующую фрагментацию хроматина с увеличением циклов обработки ультразвуком ( рис. 2 ).
Мы подтвердили качество хроматина с помощью ChIP qPCR. Как показано на рисунке 3 , размещение промотора BMAL1 было устойчивым при ZT6 и минимальным в ZT18, что соответствовало ранее показанным показателям BMAL1Dian-промотор 18 . Этот функциональный анализ подтвердил качество ядер и хроматина. В последние годы быстрое развитие NGS открыло новый горизонт для применения ChIP, где ChIP-seq может количественно опросить геномное связывание с высокой чувствительностью 17 . В частности, для ChIP-seq необходимы высококачественные ядра и хроматин для последовательного захвата взаимодействия белка с ДНК. Процедура, описанная здесь, может стать ценным ресурсом для исследований ChIP-seq с использованием скелетных мышц. Следует отметить, что подготовка библиотеки ChIP-seq требует дополнительных мер для улучшения разрешения сигнала, такого как выбор размера 18 на основе PAGE.
В заключение мы разработали протокол на основе фильтрации, чтобы подготовить высококачественные ядра из сшитых скелетных мышц. Мы устраняем необходимость в ультрацентрифугировании, что делает его легко применимым. В дополнение к ChIP для генов, представляющих интерес, ядра и хроматин prКак описано, может быть широко применима к исследованиям ChIP-seq.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Карин Эссер, Нобуя Койке и Ноэхон-Парк за полезные советы. Эта работа была частично поддержана NIH / NIGMS (R01GM114424) для S.-HY, а Фонд Роберта А. Уэлша (AU-1731) и NIH / NIA (R01AG045828) - ZC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Fisher Scientific | 15250061 | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| Protease K | Sigma Aldrich | 3115887001 | |
| Chicken Anti-BMAL1 antibody | Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318 - 579, and IgY was affinity purified using the same antigen. | ||
| Chicken IgY Precipitating Resin | GenScript | L00405 | |
| Equipment | |||
| KINEMATICA Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-178 | |
| 15 mL Dounce tissue grinder | Whearton | 357544 | |
| Falcon Cell Strainers 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| Falcon Cell Strainers 70 µm | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Falcon Cell Strainers 40 µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| pluriStrainer 30 µm | PluriSelect | 43-50030-03 | |
| pluriStrainer 20 µm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| pluriStrainer 10 µm | PluriSelect | 43-50010-03 | |
| Covaris S2 Focused-ultrasonicator | Covaris | Model S2 | |
| Labquake | Thermo Scientific | C415110 | |
| CCD Microscope Camera | Leica Microsystems | DFC3000 G | |
| Reagent Kit | |||
| DNA extraction kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| Buffers | |||
| All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich |
References
- Bouzakri, K., et al. siRNA-based gene silencing reveals specialized roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in glucose and lipid metabolism in human skeletal muscle. Cell Metab. 4 (1), 89-96 (2006).
- Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J.
- Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets. Nat Chem Biol. 3 (10), 630-639 (2007).
- Harfmann, B. D., Schroder, E. A., Esser, K. A. Circadian rhythms, the molecular clock, and skeletal muscle. J Biol Rhythms. 30 (2), 84-94 (2015).
- Nohara, K., Yoo, S. H., Chen, Z. J. Manipulating the circadian and sleep cycles to protect against metabolic disease. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 35 (2015).
- Harfmann, B. D., et al. Muscle-specific loss of Bmal1 leads to disrupted tissue glucose metabolism and systemic glucose homeostasis. Skelet Muscle. 6, 12 (2016).
- Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Jackson, V. Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent. Cell. 15 (3), 945-954 (1978).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Takahashi, J. S., et al. ChIP-seq and RNA-seq methods to study circadian control of transcription in mammals. Methods Enzymol. 551, 285-321 (2015).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
- Chen, Z., Manley, J. L. Core promoter elements and TAFs contribute to the diversity of transcriptional activation in vertebrates. Mol Cell Biol. 23 (20), 7350-7362 (2003).
- Menet, J. S., Abruzzi, K. C., Desrochers, J., Rodriguez, J., Rosbash, M. Dynamic PER repression mechanisms in the Drosophila circadian clock: from on-DNA to off-DNA. Genes Dev. 24 (4), 358-367 (2010).
- Miki, T., Matsumoto, T., Zhao, Z., Lee, C. C. p53 regulates Period2 expression and the circadian clock. Nat Commun. 4, 2444 (2013).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Koike, N., et al. Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals. Science. 338 (6105), 349-354 (2012).
- Zhou, J., Yu, W., Hardin, P. E. ChIPping away at the Drosophila clock. Methods Enzymol. 551, 323-347 (2015).
- Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat Rev Genet. , (2016).
- Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L.
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Isolation of nuclei from skeletal muscle satellite cells and myofibers for use in chromatin immunoprecipitation assays. Methods Mol Biol. 798, 517-530 (2012).
- Wilkie, G. S., Schirmer, E. C. Purification of nuclei and preparation of nuclear envelopes from skeletal muscle. Methods Mol Biol. 463, 23-41 (2008).
- Hahn, C. G., Covault, J. Isolation of transcriptionally active nuclei from striated muscle using Percoll density gradients. Anal Biochem. 190 (2), 193-197 (1990).
- Jeong, K., et al. Dual attenuation of proteasomal and autophagic BMAL1 degradation in Clock Delta19/+ mice contributes to improved glucose homeostasis. Scientific reports. 5, 12801 (2015).
- Nohara, K., et al. Ammonia-lowering activities and carbamoyl phosphate synthetase 1 (Cps1) induction mechanism of a natural flavonoid. Nutrition & metabolism. 12, 23 (2015).
- Zhang, L., Rubins, N. E., Ahima, R. S., Greenbaum, L. E., Kaestner, K. H. Foxa2 integrates the transcriptional response of the hepatocyte to fasting. Cell Metab. 2 (2), 141-148 (2005).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
- Kondratov, R. V., et al. BMAL1-dependent circadian oscillation of nuclear CLOCK: posttranslational events induced by dimerization of transcriptional activators of the mammalian clock system. Genes Dev. 17 (15), 1921-1932 (2003).
- Ripperger, J. A., Schibler, U. Rhythmic CLOCK-BMAL1 binding to multiple E-box motifs drives circadian Dbp transcription and chromatin transitions. Nat Genet. 38 (3), 369-374 (2006).
- Laplante, M., et al. DEPTOR cell-autonomously promotes adipogenesis, and its expression is associated with obesity. Cell Metab. 16 (2), 202-212 (2012).
- Blechman, J., Amir-Zilberstein, L., Gutnick, A., Ben-Dor, S., Levkowitz, G. The metabolic regulator PGC-1alpha directly controls the expression of the hypothalamic neuropeptide oxytocin. J Neurosci. 31 (42), 14835-14840 (2011).
