Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

التحديد الكمي للوفرة وفرض مستويات نقل الكشف في الإشريكيّة القولونية

Published: August 22, 2017 doi: 10.3791/56212
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Copenhagen

Summary

هنا نقدم طريقة لقياس مباشرة فرض مستويات من المنقي الإشريكيّة القولونية الجيش الملكي النيبالي، فضلا عن طريقة لمقارنة المستويات النسبية لنقل الجيش الملكي النيبالي، أو أي أخرى قصيرة الجيش الملكي النيبالي، عبر عينات مختلفة على أساس الإضافة للمصطلحات الخاصة في الجيش الملكي النيبالي نقل التعبير عن جين مرجع الخلايا.

Abstract

نقل الجيش الملكي النيبالي (الحمض الريبي النووي النقال) جزء أساسي من إليه متعدية الجنسيات في أي كائن حي. ترنس ربط ونقل الأحماض الأمينية إلى الريبوسوم ترجمة. المستويات النسبية لمختلف ترنس، ونسبة أمينواسيلاتيد الحمض الريبي النووي النقال إلى إجمالي الحمض الريبي النووي النقال، المعروفة باسم مستوى الشحن، عوامل هامة في تحديد الدقة والسرعة في الترجمة. ولذلك، بوفرة ومستويات الشحن ترناس هي المتغيرات الهامة لقياس عند دراسة تخليق البروتين، على سبيل المثال تحت ظروف الإجهاد المختلفة. هنا، يمكننا وصف أسلوب الحصاد الحمض الريبي النووي النقال ومباشرة قياس الوفرة النسبية ومستوى الشحن المطلق لأنواع محددة من الحمض الريبي النووي النقال في الإشريكيّة القولونية. هو المقطوع الحمض الريبي النووي النقال في مثل هذه طريقة أن يتم الاحتفاظ بالسندات مجا بين الحمض الريبي النووي النقال وبه الأحماض الأمينية. ثم يتعرض الجيش الملكي النيبالي لجل التفريد والشمالية النشاف، مما يؤدي إلى فصل ترناس التهمة الموجهة إليه ودون توجيه تهم لهم. يمكن مقارنة مستويات محددة ترنس في عينات مختلفة بسبب إضافة المصطلحات الخاصة في الخلايا للتطبيع. قبل تنقية الحمض النووي الريبي، يمكننا إضافة 5% خلايا كولاي التي أكثر الحمض الريبي النووي النقال نادرةسيلك لكل عينة. ثم هو تطبيع مقدار الفائدة في عينة وأنواع الحمض الريبي النووي النقال بمقدار الحمض الريبي النووي النقالسيلك في نفس العينة. إضافة المصطلحات الخاصة في الخلايا قبل تنقية الحمض النووي الريبي مزية على إضافة المنقي سبايك في الكشف بأنه يمثل أيضا أية فروق في كفاءة تحلل الخلية بين العينات.

Introduction

في ما يلي، نقدم طريقة لتحديد كمية محددة ترناس وقياس فرض رسوم على المستويات من النشاف الشمالية. الأسلوب الذي يستند إلى تقنية وضعتها أولاً فارشنيي et al. 1-حصاد الخلايا إلى حمض التريكلوروسيتيك (TCA) وحفظ العينات في 0 درجة مئوية في جميع أنحاء تنقية الحمض النووي الريبي، هو السندات إستر بين الحمض الريبي النووي النقال والأحماض الأمينية المصانة2،،من34. ترنس أمينواسيلاتيد يمكن تمييز من نظرائهم نوناسيلاتيد هلام التفريد وشمال النشاف، يرجع إلى تنقل انخفض أمينواسيلاتيد الحمض الريبي النووي النقال في الهلام، الناجمة عن الأحماض الأمينية تساهمي ملزمة5. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نقدم بروتوكول لتطبيع كميات الحمض الريبي النووي النقال بالإضافة إلى المصطلحات الخاصة في الخلايا overexpressingسيلك الحمض الريبي النووي النقال نادراً ما تستخدم 4.

ترنس بعض من الجزيئات الأكثر وفرة في الخلية البكتيرية وجزء حيوي للغاية للترجمة الآلية. ترناس ربط الأحماض الأمينية ونقلها إلى ترجمة ريبوسوم. ربط الأحماض الأمينية ترنس (أمينواسيليشن أو شحن) يسر aminoacyl الحمض الريبي النووي النقال سينثيتاسيس. الوفرة النسبية لمختلف ترنس مشحونة مهم لضمان الدقة تخليق البروتين، لأنه اتهم التمثيل الناقص لقرابة الحمض الريبي النووي النقال كودون معين رسول من الحمض النووي الريبي (مرناً) يزيد من احتمال أن سيكون القرب من قرابة الحمض الريبي النووي النقال خطأ تسليم بالأحماض الأمينية في سلسلة ببتيد المتزايد في الريبوسوم6. وتتجلى الأهمية للحمض الريبي النووي النقال مشحونة باستجابة واسعة النطاق من الخلية كولاي إلى هبوط حاد في مستويات مشحون الحمض الريبي النووي النقال؛ استجابة صارمة. خلال الاستجابة الصارمة هو خفض التوليف ترنس والكشف الريباسي مرناس معظم صالح نسخ مرناس المحددة المرتبطة ببقاء الحمض الأميني الحيوي والإجهاد، وهو خفض معدل نمو الخلايا هائلة7 . وعلاوة على ذلك، أظهرت مؤخرا العمل لنا ولغيرنا أن كولاي يحط بنشاط غالبية الحمض الريبي النووي النقال ردا على تشدد على أن الحد من ترجمة4،8، مما يوحي بأن تعديل المستويات الحمض الريبي النووي النقال الهامة للتعامل مع هذه الضغوط. وهكذا، سوف تكون قياسات موثوقة من وفرة الحمض الريبي النووي النقال وفرض مستويات أداة هامة لفهم استجابات الضغط البكتيرية تماما.

القولونية يستخدم عادة للتعبير عن البروتين المؤتلف، ونظرا للاختلافات في استخدام كودون بين الأنواع، هو التعبير الأمثل غالباً ما واجهت مشكلة9. وهذا يمكن التحايل عليها بالتعبير عن ترناس الإضافية اللازمة لترجمة مرناً المؤتلف10. قياسات للحمض الريبي النووي النقال فرض مستويات في هذه السلالات يمكن توجيه جهود استكشاف الأخطاء وإصلاحها والمساعدة في تحسين التعبير البروتين.

هذا الأسلوب يمكن أيضا الكشف عن "ميشارجينج"؛ أمينواسيلاتيد جزيء الحمض الريبي النووي النقال مع من الأحماض الأمينية غير قرابة. قد يسبب أمينواسيليشن بالأحماض الأمينية مختلفة من الحمض الريبي النووي النقال لترحيل مع سرعات مختلفة قليلاً عن طريق الجل بولياكريلاميدي1،11. وفي بعض الحالات، يمكن أيضا استخدام الأسلوب التمييز بين أنماط مختلفة التعديل على خلاف ذلك مماثلة ترنس3.

آخر أنشأ الإجراء البيوكيميائية للتحقيق في فرض مستويات الحمض الريبي النووي النقال هو فوق يودات الأكسدة. الأسلوب يعتمد على ملاحظة مفادها أن أمينواسيلاتيد الحمض الريبي النووي النقال محمي من فوق يودات الأكسدة وليس من دون توجيه تهمة إليه الحمض الريبي النووي النقال. بعد فوق يودات علاج الأكسدة تغذيتها الحمض الريبي النووي النقال يستخدم لتقدير مستويات الشحن من الجيش الملكي النيبالي المقطوع. ومع ذلك، قد تبين تغذيتها ترنس عدة تتأثر بالعلاج وبالتالي توفير بعض عدم الدقة12. الطريقة المعروضة هنا تدابير الشحن مباشرة من تنقية الجيش الملكي النيبالي، وتستبعد بالتالي أي تحيز من التفاعلات الكيميائية أو الانزيمية. واحد الحد من هذا الأسلوب الكشف عن تلك الأنواع الحمض الريبي النووي النقال واحد فقط في كل مرة، حتى على الرغم من أن لطخة الشمالية نفسها يمكن تجريده وريبروبيد ترناس متعددة، أنها مضيعة للوقت وشاقة إلى حد ما جمع البيانات بشأن العديد من ترناس.

طريقة يمكن الاعتماد عليها لتطبيع عينات لبعضها البعض أمر حيوي في الدراسات حيث أن الهدف مقارنة المستويات النسبية لجزيء عبر عينات مختلفة. نقدم لك هنا إجراء تطبيع للجيش الملكي النيبالي حيث يتم إضافة قاسمة صغيرة كولاي الخلايا overexpressing الحمض الريبي النووي النقال نادرةسيلك كالمصطلحات خاصة في لجميع العينات التجريبية قبل تنقية الحمض النووي الريبي. يعد هذا الأسلوب مفيداً عندما يكون الإعداد التجريبية مثل لا الحمض النووي الريبي الذاتية التي يمكن أن تكون موثوق بها أن يقدم ليس فقط عند دراسة ترنس لكن للتحديد الكمي النسبي لأي أنواع من الحمض النووي الريبي في نفس تركيز الخلوية في جميع العينات. على سبيل المثال، غالباً ما يستخدم مستوى "التدبير المنزلي" مثل الحمض النووي الريبي الريباسي الرنا كمرجع ذاتية لمقارنة الكميات النسبية للجيش الملكي النيبالي آخر بين مختلف عينات13. ولكن هذا الاستخدام القليل إذا كان تركيز الجيش الملكي النيبالي الإشارة الخلوية يتراوح بين العينات، كما يمكن أن يكون الحال بالنسبة للحمض النووي الريبي الريباسي إذا أخذ العينات يحدث أثناء إجهاد استجابة15،،من1617 أو الدخول إلى مرحلة ثابتة17. إضافة المصطلحات الخاصة في الخلايا للعينات التجريبية قبل تنقية الحمض النووي الريبي يوفر طريقة متينة ودقيقة لتطبيع المستقلة لإعداد العينات. وهناك طريقة أخرى للتوحيد القياسي هو إضافة واحد أو أكثر المصطلحات الخاصة في الكشف على العينات التجريبية بعد تنقية الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، هذا الأسلوب لا تراعي أي اختلافات في الحمض النووي الريبي الانتعاش بين العينات.

استخدام خلايا كولاي أوفيريكسبريس هذا عيب الإشارة الجيش الملكي النيبالي كمسمار في الخلايا (انظر الشكل 1) في تجربة على كولاي التي يترتب عليها بالإضافة إلى ذلك كمية صغيرة من خارجية كولاي مجموع الجيش الملكي النيبالي عينات. علينا أن نصحح لهذه الإضافة عن طريق تحليل عينة تحتوي على إلا سبايك في الخلايا بالتوازي مع العينات التجريبية (انظر الشمالية لطخة في الشكل 2، لين المسمى "سيلك"). البروتوكول عرضت وضع من أجل K-12 كولاي ، لكن من المرجح أن تكون قابلة للتطبيق لمعظم الأنواع البكتيرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-التحضير للثقافات البكتيرية.

  1. تنمو جميع الثقافات في قوارير Erlenmeyer مع نسبة حجم ثقافة/قارورة من 1/6 على الأكثر. في إعداد نموذجي تجريبي، تنمو الثقافات في 37.0 درجة مئوية وتهز 160 لفة في الدقيقة في مورفولينيبروبانيسولفونيك الحمضية (والمماسح) الحد الأدنى المتوسط 18 تستكمل مع مصدر الكربون المفضل، على سبيل المثال الجلوكوز 0.2%، على الأقل من 10 أجيال متعاقبة قبل الحصاد الرنا.
  2. اليوم قبل موسم الحصاد في الجيش الملكي النيبالي، تضعف ثقافة المتضخمة من السلالة المرغوبة في الممسحات المتوسطة الدنيا في مثل هذه طريقة أنها ستصل إلى التطوير التنظيمي المطلوب 436 في الوقت المطلوب وفي اليوم التالي. حساب حجم الثقافة المتضخمة ﻻستخدام التطعيم بالصيغة:
    Equation 1
    ملاحظة: هنا، التطوير التنظيمي الجديد يدل على التطوير التنظيمي المطلوب 436 بعد الحضانة، الخامس الجديد يشير إلى حجم ثقافة المخفف، OD القديم يدل على التطوير التنظيمي 436 ثقافة المتضخمة المخفف من، ز ترمز إلى عدد الأجيال التي سوف تنمو الثقافة، من الوقت لتمييع (تي 1) في الوقت الذي هناك حاجة اليوم بعد (تي 2) ويمكن أن تحسب ك: الوقت الفرق (في دقيقة) بين تي 1 وتي 2 مقسوماً على وقت جيل (في دقيقة). لضمان نمو الحالة المستقرة في وقت أخذ العينات، ينبغي ز ≥ 10؛ V القديم يدل على حجم نمت خارج الثقافة التي ينبغي أن تنقل إلى وسيلة جديدة. هذه المعادلة هي تقريب التي لا تراعي أي مرحلة انتقالية؛ ظاهرة كثيرا ما لوحظ بعد تمييع ثقافة الخارج نمت في وسائط الإعلام الجديدة.
    1. ظروف النمو سوف تختلف تبعاً للغرض من هذه التجربة، ولكن للحد من خلية إلى الاختلاف في مستويات الحمض الريبي النووي النقال، وزيادة إمكانية تكرار نتائج النتائج، (مستحسن) تنمو الثقافات ثابت الدولة قبل أخذ العينات 19-

2. إعداد المصطلحات الخاصة في الخلايا

ملاحظة: كولاي سلالة MAS1074، الذي يعبر عن الجينات سيلك ترميز الحمض الريبي النووي النقال سيلك تحت سيطرة الأيزوبروبيل β-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي (إيبتج)- مروج إيندوسيبلي كارتفاع في الضغط.

  1. ديلوت ثقافة المتضخمة من MAS1074 إلى التطوير التنظيمي 436 0.05 في الممسحات المتوسطة الأدنى تستكمل مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين والجلوكوز 0.2%. تنمو ثقافة عند 37 درجة مئوية تهز 160 لفة في الدقيقة-
    ملاحظة: انظر المناقشة لاستخدام السلالة المرجعية البديلة.
  2. "في التطوير التنظيمي" 436 ~ 0.1، إضافة إيبتج إلى تركيز نهائي من 1 ملم للحث على التعبير عن الحمض الريبي النووي النقال سيلك. تنمو الثقافة للتطوير التنظيمي 436 ~0.5 (~ 3-4 ح النمو) ونقل قارورة الثقافة إلى حمام الثلج. الحفاظ على ثقافة المصطلحات الخاصة في الخلية على الجليد حتى جميع العينات لتنقية الحمض النووي الريبي قد تم حصادها.

3. حصاد عينات التجريبية.

توج
  1. الحارة قبل (37 درجة مئوية) واحد 100 مل قارورة Erlenmeyer (أو ما شابه ذلك) التي تحتوي على 4 مل 10% (w/v) التريكلوروسيتيك حامض (TCA) لكل عينة بوضعه في حمام مائي ساخن.
    ملاحظة: الحذر، TCA تتحلل عند التسخين، المنتجة للأبخرة السامة والمسببة للتآكل، بما في ذلك كلوريد الهيدروجين وكلوروفورم. الحل في الماء حمض قوي؛ أنه رد فعل عنيف مع القواعد واكاله لكثير من المعادن. وينبغي اتخاذ الاحتياطات المناسبة عند استخدام هذا السائل-
  2. فورا قبل الحصاد الخلية، قياس وتسجيل التطوير التنظيمي 436 الثقافة-
  3. حصاد الخلايا، نقل 4 مل ثقافة قارورة المعالجون مسبقاً تتضمن TCA.
  4. ميكس العينة التي يحوم في قارورة باليد لتعطيل الأنشطة الانزيمية كل خلط س. 5 مع TCA فورا ومما يحافظ على مستويات الشحن ترنس.
    ملاحظة: إذا جمع عينات متعددة، الاحتفاظ بحصادها عينات في كلورفورم الميثيل على الجليد حتى جميع العينات التي تم جمعها-

4. إضافة المصطلحات الخاصة في الخلايا

ملاحظة: إعداد خلايا سبايك هو الموصوفة في الخطوة 2-

  1. عند جميع العينات لإعداد الجيش الملكي النيبالي قد جمعت، وإضافة 5% ارتفاع في خلايا (استناداً إلى OD) لكل عينة.
    ملاحظة: يحسب حجم الثقافة سبايك في الخلية المطلوبة بالصيغة:
    Equation 2
    حيث V سبايك يدل على حجم الخلية سبايك في الثقافة اللازمة، الخامس أكسب يشير إلى الحجم الخلية التجريبية المقطوع الثقافة (دون TCA)، يدل OD أكسب التطوير التنظيمي 436 ثقافة الخلية التجريبية في وقت الحصاد في TCA. OD سبايك يدل على التطوير التنظيمي 436 ثقافة سبايك في الخلية. إذا كان يتم حصاد عينات متعددة في مختلف المواد المستنفدة للأوزون، ينبغي تعديل حجم الخلايا سبايك أضيف وفقا للصيغة الواردة أعلاه لكل عينة.
  2. لقياس المساهمة من الخلايا سبايك في الجيش الملكي النيبالي وأنواع الفائدة، تعد عينة فقط تحتوي على المصطلحات الخاصة في الخلايا بخلط 4 مل سبايك في الخلايا مع 4 مل TCA. إعداد الجيش الملكي النيبالي من هذه العينة بنفس الطريقة أما بالنسبة للعينات الأخرى.
  3. اختيارياً، تأخذ قارورة أخرى تتضمن فقط العينة التجريبية، دون ارتفاع في الخلايا، وله بتحديد مقدار مساهمة العينة التجريبية للحمض الريبي النووي النقال وتشمل مستويات سيلك؛ مستويات الحمض الريبي النووي النقال سيلك في الذاتية كولاي K-12 منخفضة لماما-

5. إعداد الجيش الملكي النيبالي

ملاحظة: "الجيش الملكي النيبالي" إعداد بروتوكول الموصوفة هنا أساسا التي وصفها فارشنيي et al. 1؛ لتجنب ديسيليشن ترنس أمينواسيلاتيد أثناء تنقية من المهم أن تبقى العينات في درجة الحموضة الحمضية وفي 0 درجة مئوية طوال فترة تنقية. استخدام أنابيب/قوارير نظيفة معقمة للاحتفاظ بعينات والحلول، وإعداد جميع الحلول مع عالي النقاوة (18.2 MΩ·cm المقاومة) الماء-

  1. مل 8 من أجل كل عينة في أنبوب الطرد مركزي برود الثلج. الطرد المركزي عينات لمدة 10 دقيقة في 9,500 س ز في 4 ° "جيم تماما" إزالة المادة طافية وريسوسبيند في 0.3 مل الباردة 0.3 M خلات الصوديوم، الأس الهيدروجيني 4.5 و 10 مم يدتا.
    2. نقل كل عينة إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي باردة 1.5 مل
  2. وإضافة الفينول 0.3 مل اكويليبراتيد مع المخزن المؤقت نفسه.
    ملاحظة: الحذر، الفينول تنتج أبخرة سامة وهو الغاية أكالة للجلد.
  3. دوامة كل عينة x 10 ل 15 ثانية مع على الأقل 1 دقيقة بين كل دوامة. ما بين فورتيكسينج تبقى العينات في 0 ° C. استخدم توقفات متكررة لضمان أن تظل العينات الباردة.
    4. °
  4. عينات أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 20,000 g x 4 جيم-نقل أنابيب المرحلة المائية (المرحلة العليا) إلى الجديدة 1.5 مل ميكروسينتريفوجي. إضافة الفينول 0.3 مل الباردة ودوامه 4 × 15 ثانية كما كان من قبل.
    5. °
  5. الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 20,000 g x 4 جيم-نقل المرحلة المائية إلى ميكروسينتريفوجي مل 1.5 الجديد، الباردة أنابيب تحتوي على 2.5 ضعف حجم 96 ٪ الإيثانول (~ 750 ميليلتر). يعجل بالجيش الملكي النيبالي بحضانة أنابيب لح 1-20 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في-80 درجة مئوية.
  6. عينات أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 20,000 g x 4 درجة مئوية. تجاهل المادة طافية وإضافة 1 مل إيثانول 70% الباردة بعناية دون إزعاج بيليه الجيش الملكي النيبالي. عكس بلطف مرة واحدة لغسل الدواخل الأنابيب مع الإيثانول.
    ملاحظة: يمكن أن يكون بيليه من الصعب أن نرى في هذه الخطوة.
    7. °
  7. الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 20,000 g x 4 "جيم تماما" إزالة المادة طافية وأيردري بيليه حتى يتم ترك لا الإيثانول. ريسوسبيند بيليه بشدة فورتيكسينج في 20 ميليلتر الباردة 10 صوديوم اسيتات الأس الهيدروجيني 4.5 و 1 مم يدتا.
    ملاحظة: عدم الإفراط الجاف بيليه كما أنه سوف يصبح من الصعب على ريسوسبيند-
  8. اختيارياً، تقييم تركيز الحمض النووي الريبي عن طريق قياس امتصاص في 260 nm-
  9. اختيارياً، تقييم الجودة للجيش الملكي النيبالي المنقي [اغروس] هلام التفريد 20-
  10. تخزين العينات في-80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا.
< الفئة p= "jove_title" > 6. إعداد نموذج عنصر تحكم ديسيلاتيد كيميائيا

ملاحظة: لتمييز فرقة أمينواسيلاتيد لطخة الحمض الريبي النووي النقال من نظيرتها ديسيلاتيد على الشمالي، كيميائيا على استعداد ديسيلاتيد الكوة بالمعالجة القلوية. لمعظم الأغراض، أنها كافية ديسيلاتي عينة واحدة لكل اسطوانة الشمالية-

نموذج
  1. ذوبان الجليد الجيش الملكي النيبالي على الجليد. نقل من قاسمة 4 ميليلتر من عينات الحمض النووي الريبي لأنبوب جديد. إضافة 46 درجة الحموضة من HCl تريس ميليلتر 9.0. احتضانها ح 2 في 37 درجة مئوية
    2. إضافة 15 ميليلتر من خلات الصوديوم 0.3 م في الأس الهيدروجيني 4.5
  2. وبعد ذلك إضافة 125 ميليلتر من الإيثانول 96%. يعجل بالجيش الملكي النيبالي في-20 درجة مئوية حاء 1
    3. °
  3. الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 20,000 g x 4 "جيم تماما" إزالة المادة طافية وريسوسبيند في 4 ميليلتر الباردة 10 ملم صوديوم اسيتات الأس الهيدروجيني 4.5 و 1 مم يدتا.
    ملاحظة: البروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً هنا، إذا كان يتم تخزين العينة في-80 درجة مئوية.

7. هلام التفريد والنشاف شمال

عينة
  1. ميكس 4 ميليلتر (غير المعالجة أو كيميائيا ديسيلاتيد) مع 6 ميليلتر تحميل المخزن المؤقت (0.1 M خلات الصوديوم (pH 5.0)، م 8 اليوريا، والأزرق بروموفينول 0.05%، وزايلين زيلين نفط 0.05%).
    ملاحظة: تذكر لتشمل العينة التي تحتوي على المصطلحات الخاصة في الخلايا فقط، عينة ديسيلاتيد كيميائيا (والعينة دون ارتفاع في الخلايا، وإذا كان أحد قد أعد).
  2. تحميل العينات إلى 0.4 مم سميكة 6.5% polyacrylamide هلام (19:1-أكريلام ide:bisacrylamide) التي تحتوي على اليوريا 8 أمتار في المخزن المؤقت خلات الصوديوم 0.1 M (pH 5.0). استخدم 60 سم طويلة الجل للفصل السليم بين الأنواع الحمض الريبي النووي النقال.
  3. منفصلة الجيش الملكي النيبالي بالتفريد في جل الخامس/سم 10 عند 4 درجة مئوية، حتى بروموفينول الأزرق يصل إلى أسفل الجل (ح ~ 20)-
    4. يستخدم صبغ
  4. المنطقة من الصبغة زايلين زيلين نفط و 20 سم أسفل نحو الأزرق bromophenol النشاف (ينبغي أن تكون المسافة بين الأصباغ اثنين 25-30 سم). عناية منفصلة ألواح الزجاج اثنين، حتى يظل الجل على واحد منهم. قطعة رقيقة من ورق الترشيح هو خفض لحجم منطقة blotting المطلوب ووضعت على رأس الجزء من جل الذي سيتم استخدامه النشاف. قطع الأجزاء من الهلام التي لا تغطيها أوراق الترشيح وتجاهل. استخدام ورق الترشيح لرفع بعناية قطعة جل بعيداً عن لوحة زجاج.
    ملاحظة: جل كبيرة هشة للغاية حتى التعامل مع الرعاية-
  5. غشاء نايلون مشحونة بشكل إيجابي (مثلاً غشاء هيبوند ن +) يوضع على رأس الجل وهو اليكتروبلوتيد في 20 الخامس لمدة 90 دقيقة باستخدام 40 مم تريس-خلات (الرقم الهيدروجيني 8.1)، 2 مم يدتا كنقل المخزن المؤقت-
  6. التشعب الجيش الملكي النيبالي للغشاء باستخدام الأشعة فوق البنفسجية-الضوء (0.12 ي/سم 2)-
    ملاحظة: يمكن تخزين الغشاء الآن في درجة حرارة الغرفة والبروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً هنا.

8. التصميم والتحقق من المسابر

ملاحظة: دقيق التصميم والتحقق من المسابر وصمة عار الشمالية أمر حاسم للحصول على نتائج يمكن الاعتماد عليها وتجنب غير المرغوب فيها عبر-التهجين مع الأنواع الأخرى من الحمض النووي الريبي.

  1. استخدام النوكليوتيد الاصطناعية قصيرة كتحقيقات. تصميم التسلسل المسبار في طريقة أن أنها مكملة للجزء الأكثر فريدة من نوعها من تسلسل الحمض الريبي النووي النقال للفائدة-هذا هو غالباً حلقة أنتيكودون.
    ملاحظة: قائمة بتسلسل الحمض الريبي النووي النقال المتوقعة من الكائنات المختلفة يمكن الاطلاع على في الحمض الريبي النووي النقال الجينوم قاعدة البيانات (جترنادب) 21-
  2. ضبط طول التسلسل للحصول على توقع ذوبان درجة حرارة 55-65 درجة مئوية.
  3. الانفجار (الأساسية المحلية محاذاة أداة البحث) تسلسل المختار ضد تسلسل الجينوم من السلالة البكتيرية المستخدمة في التجربة، للتحقق من أن التسلسل فريدة من نوعها للحمض الريبي النووي النقال المحدد، كما هو موضح في 22-
    ملاحظة: الجدول 1 قوائم تسلسل التحقيق المقترح لعدة ترنس مختلفة من K12 كولاي. في حالة محددة للحمض الريبي النووي النقال لمصلحة التحقيق، شريطين فقط مرئية على وصمة عار شمال (التهمة الموجهة إليه ودون توجيه تهم لهم من الحمض الريبي النووي النقال) وفرقة واحدة فقط مرئياً في حارة مع نموذج ديسيلاتيد (دون توجيه تهمة إليه الحمض الريبي النووي النقال). في حالة وجود اثنين أو أكثر من نطاقات أو إذا كان كذلك هو المطلوب التحقق من الصحة لخصوصية التحقيق، انظر المناقشة.

9. التهجين من وصمة عار شمال

ملاحظة: في الخطوات التالية، هو تهجين الغشاء تسلسلياً مع تحقيقات تكميلية إلى ترناس المحددة المطلوبة، بما في ذلك محدد مسبار للإشارة الحمض الريبي النووي النقال سيلك.

  1. وضع الغشاء في أنبوب تهجين وإضافة 6 مل التهجين الحل (0.9 كلوريد م الصوديوم، 0.05 متر مكعب NaH 2 بو 4 (7.7 درجة الحموضة)، 5 ملم يدتا، 0.5% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي، 100 ملغ/مل من المنفصمة والتشويه والتحريف الحمض النووي في الحيوانات المنوية الرنجة و 5 x Denhardt ' s الحل (100 x دينهارت ' حل s = ألبومين المصل البقري 2% و 2% بوفيدون 40 2% فيكل)).
  2. هجن قبل الغشاء في المخزن المؤقت ح 1 بالتناوب في 42 ° 30 إضافة جيم pmol المشعة اليغو الحمض النووي المسبار 5 '-نهاية-المسمى مع 32 ف (أعد كما وصفها سامبروك et al. 23)
    ملاحظة: الحذر، يمكن تقديم انبعاثات الجسيمات ذات الطاقة العالية بيتا من 32 ف الجلد كبيرة وخطر الجرعة العين. وينبغي اتخاذ الاحتياطات المناسبة عند استخدام 32 النفايات المشعة ص ينبغي التخلص من وفقا لبروتوكولات السلامة المؤسسية المناسبة.
  3. احتضان التحقيق مع الدورية غشاء بين عشية وضحاها في 42 ° جيم إزالة المسبار باستخدام ماصة المتاح 10 مل.
    ملاحظة: إذا كانت مخزنة في ثلاجة المسبار يمكن إعادة استخدامها-
  4. في الأنبوب التهجين، يغسل الغشاء قريبا في 50 مل من 0.3 M كلوريد الصوديوم، سترات الصوديوم 30 ملم، الحزب الديمقراطي الصربي 0.1% (w/v) في درجة حرارة الغرفة-
    ملاحظة: هذا الغسيل الأول يحتوي على مسبار كثير غير منضم ويجب التعامل معها كعاليه الإشعاع.
  5. كرر الخطوة 9.4 مرة واحدة، ثم نقل الغشاء إلى حاوية بلاستيكية مسطح أو صينية بما في ذلك غطاء. تغطي الغشاء بمحلول الغسيل (0.3 م NaCl، سترات الصوديوم 30 ملم، الحزب الديمقراطي الصربي 0.1% (w/v)) وتبني عليه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
  6. تغيير الحل الغسيل ويستمر الغسيل حتى تم الحصول على إشارة مرضية لنسبة الضوضاء (غالباً 3-4 التغيرات الغسيل الحل). استخدام أنبوب جايجر-مولر لاكتشاف كيفية تغيير نسبة الإشارة إلى الضوضاء بقياس الإشعاع من ناحية فارغة من الغشاء ومقارنتها بالمنطقة حيث قد تهجين التحقيق على وجه التحديد للحمض الريبي النووي النقال.
  7. لكي تتمكن من قطاع التحقيق من الغشاء بعد التعرض، وضمان أن (مهم) الغشاء لم تجف قبل إجراء تجريد. وضع الغشاء في حقيبة بلاستيكية رقيقة أو التفاف محكم باستخدام البلاستيك التفاف وختم أن يكون الغلق بالشريط أو لحام. ضع الغشاء مختوم على شاشة فوسفوريماجينج.
    ملاحظة: التعرض المطلوبة على الشاشة فوسفوريماجينج يتم تحديد الوقت بنشاط محدد للتحقيق، كمية الحمض النووي الريبي سبر foالبحث والتطوير، وكفاءة التهجين للتحقيق، ويمكن أن تختلف إلى حد كبير؛ من بضع دقائق إلى عدة أيام. مع التجربة، كثافة الإشعاع الكشف على الغشاء مع أنبوب جايجر-مولر يعطي مؤشرا جيدا لوقت التعرض المطلوبة. للقياس الكمي موثوقة، المهم أن لا يتم تعريض الشاشة.
    8. مسح الشاشة فوسفوريماجينج باستخدام ماسح ضوئي ليزر
  8. وحفظ الملف في ".gel " الشكل.
    ملاحظة: إشارة عالية لنسبة الضوضاء ضروري لتقدير موثوق بها. التدقيق الحمض الريبي النووي النقال ينبغي أن يسفر عن شريطين؛ واحد أمينواسيلاتيد التي تحتوي على الحمض الريبي النووي النقال (الهجرة أبطأ) وواحد من ديسيلاتيد التي تحتوي على الحمض الريبي النووي النقال (الهجرة أسرع). انظر الشكل 2-

10. تجريد الغشاء

ملاحظة: قبل يمكن سبر الغشاء للحمض الريبي النووي النقال آخر، يجب أولاً إزالة التحقيق السابقة بتجريد الغشاء.

  1. الحرارة ما يكفي تجريد المخزن المؤقت (15 ملم كلوريد الصوديوم، سترات الصوديوم 1.5 مم، الحزب الديمقراطي الصربي 0.1% (w/v)) لتغطية الغشاء ومن أجل ذلك عبر الغشاء. تبني عليه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
  2. ويمكن الكشف عن تكرار الخطوة 10.1 حتى لا الإشعاع مع أنبوب جايجر-مولر؛ والغشاء يمكن الآن إعادة المهجن اتباع الخطوات الموضحة في القسم 9-

11. التحديد الكمي للحمض الريبي النووي النقال وفرض مستويات

  1. تحميل الملف.gel إلى التصوير البرنامج (انظر الجدول للمواد). رسم خط عمودي على طول كل واحد من الممرات عينة في مثل هذه طريقة أنه يمتد أكثر من عرض حارة ولكن يستبعد حواف العصابات حيث يمكن الإشارة متفاوتة، كما هو مبين في الشكل 3 ألف-
  2. تصور التهم من كل حارة بالنقر فوق " التحليل "-> " "إنشاء الرسم البياني" ". تعريف يدوياً على قمم اثنين يمثلون التهمة الموجهة إليه والحمض الريبي النووي النقال دون توجيه تهم لهم من كل حارة، كما هو مبين في الشكل 3.
  3. الحصول على التهم من كل ذروة بالنقر فوق " التحليل "-> " "تقرير منطقة" "، وسجل المنطقة الخاضعة لكل منهما من قمم اثنين.
  4. عند قد تم سبر وصمة عار للحمض الريبي النووي النقال سيلك والحمض الريبي النووي النقال واحد على الأقل من الاهتمام، تطبيع مستويات الحمض الريبي النووي النقال الفائدة للحمض الريبي النووي النقال سيلك. حساب نسبة الحمض الريبي النووي النقال التي تنشأ من الخلايا في ارتفاع في كل حارة
    1. واطرح من إشارة المجموع في هذا الممر باستخدام المعادلة:
      Equation 3
      ملاحظة: هنا، عينة من الحمض الريبي النووي النقال = الإشارات التي تم الحصول عليها من ممر واحد من غشاء سبر للحمض الريبي النووي النقال المطلوب؛ عينة سيلك = الإشارات التي تم الحصول عليها من لين نفس الغشاء نفسه سبر للحمض الريبي النووي النقال سيلك؛ Ref الحمض الريبي النووي النقال = الإشارات التي تم الحصول عليها من لين التي تحتوي على الحمض النووي الريبي إلا سبايك في الخلية من الغشاء نفسه سبر للحمض الريبي النووي النقال المطلوب؛ Ref سيلك = الإشارات التي تم الحصول عليها من الممر الذي يحتوي على الخلية فقط المصطلحات الخاصة في الجيش الملكي النيبالي الغشاء نفسه سبر للحمض الريبي النووي النقال سيلك.
    2. إلى تطبيع، قيمة الحمض الريبي النووي النقال تصحيحها من كل حارة القسمة إشارة سيلك الحمض الريبي النووي النقال من الممر نفسه.
      ملاحظة: لا يكاد مساهمة إلى إشارة سيلك الحمض الريبي النووي النقال من الخلايا المنسوخة (انظر الشكل 2، لين المسمى "-سيلك ").
  5. حساب الحمض الريبي النووي النقال فرض مستوى كل حارة بتقسيم الإشارة الواردة من ذروة يمثلون مشحونة بالحمض الريبي النووي النقال مع مجموع الإشارات من كلا قمم (مشحونة + بدون تهمة).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

استخدام الإجراء الموصوفة هنا، الوفرة والشحن وقيست مستويات ترنس الثلاثة في K-12 كولاي قبل وأثناء المجاعة من الأحماض الأمينية.

سلالة أوكسوتروف ارجينين NF9154 (لوي thr supE44 mtl ثي argH له) كان نمت على الأقل عشرة أجيال والمماسح الحد الأدنى تستكمل مع والغليسيرول 0.4 في المائة، 50 ميكروغرام/مل ثريونين، لوسين، ارجينين، والحامض الأميني 5 ميكروغرام/مل عند 37 درجة مئوية تهتز في المديين المتوسط 160 لفة في الدقيقة. وعرض الترشيح للثقافة واستثارة في المتوسطة والمماسح الطازجة أعلاه ولكن دون ارجينين ارجينين جوعاً. أثناء المجاعة ارجينين، تخليق البروتين ينخفض بشدة، ولكن ما زال عند مستوى منخفض استخدام ارجينين صدر عن دوران البروتينات الموجودة. عينات تم حصادها في الوقت النقاط هو مبين في الشكل 4. بعد أن كانت تحصد جميع العينات في TCA، 5% من MAS1074 سبايك في الخلايا overexpressingسيلكمن الحمض الريبي النووي النقال، وأضيفت إلى كل عينة كما هو موضح في الرقم 1. تنقيته من العينات الحمض النووي الريبي، مفصولة بالتفريد، ومسح على غشاء كما هو موضح في البروتوكول. وكان سبر الغشاء للحمض الريبي النووي النقالأرجفيزقوالحمض الريبي النووي النقالجلتوفووالحمض الريبي النووي النقالهيسروالحمض الريبي النووي النقالسيلك، كما هو مبين في الشكل 2. وكان كمياً إشارة الإشعاع من كل حارة لكل من المسابر أربعة كما هو مبين في الشكل 3، وتصحيحها وطبيعية كما هو موضح في القسم 11. وترد النتائج في الشكل 4. ويبين الشكل 4A أن مستويات جميع أنواع اختبار الحمض الريبي النووي النقال تتناقص بسرعة خلال المجاعة من الأحماض الأمينية، كما تم الإبلاغ عنها مؤخرا4. يبين الشكل 4 باء أن الحمض الريبي النووي النقال فرض مستويات تتصرف كما هو متوقع: الكسر مشحونة من الحمض الريبي النووي النقال ارجينين في قبول يسقط سريعاً عند إزالة ارجينين من المتوسطة النمو، بينما مستويات الشحن ترنس الأخرى زيادة طفيفة على الموت جوعاً لأنه اتهم ترناس تتراكم عندما ينخفض معدل ديتشارجينج في ريبوسوم نظراً لعدم وجود الركيزة ل توليف البروتين4. كذلك يقلل الكسر الحمض الريبي النووي النقال المشحون في فترة المجاعة، إلى مستويات تقريبا قبل المجاعة بسبب تدهور غالبية تجمع الحمض الريبي النووي النقال (الشكل 4 أ)، الذي ينتج بمعدل أكبر من ديتشارجينج من ترنس المتبقية في ريبوسوم. وفي المقابل، يزيد الكسر مشحونة من الحمض الريبي النووي النقالأرجفيزق لسببين على الأقل؛ 1) تنشيط استجابة صارمة يعني مرناً، لا تحمل الحمض الريبي النووي النقالالأرجنتين، يصبح عاملاً يحد من الترجمة وتخفيض 2) الحصيلة الكلية للحمض الريبي النووي النقالarg (الشكل 4 أ) حتى جزء أكبر من مجموع الحمض الريبي النووي النقالarg يمكن أن تقيد بنفس الكمية الصغيرة من ارجينين. وتبين هذه التجربة كيف قياسات متزامنة لوفرة الحمض الريبي النووي النقال ومستويات الحمض الريبي النووي النقال مشحون يوفر معلومات ذات جودة عالية حول الشروط اللازمة تخليق البروتين داخل الخلية.

Figure 1
رقم 1. إضافة المصطلحات الخاصة في الخلايا لعينات- في هذا المثال، يتم حصاد عينات من ثقافة واحدة من NF915 كولاي قبل وأثناء المجاعة من الأحماض الأمينية في سلسلة زمنية. ويرد تخطيطي لمنحنى النمو NF915، حيث تشير النقاط الزرقاء إلى نقاط حصاد عينة. ياكسيس مقياس لوغاريتمي. يتم حصاد عينات ثقافة التجريبية كما هو موضح في القسم 3. ويرد أيضا تخطيطي منحنى النمو من ارتفاع في الضغط MAS1074، مع نقطة الحصاد عينة المبين كنقطة زرقاء. الرقم لتوضيح أن جميع العينات التجريبية (من NF915 كولاي في هذا المثال) تلقي قاسمة سبايك في الخلايا من ثقافة المرجع نفسه. تضاف إلى كل عينة، 5% خلايا سبايك على الخلايا التجريبية، حسبت استناداً إلى التوجيه التشغيلي للثقافات الخلية (انظر القسم 4). وفي وقت لاحق، تنقيته من جميع عينات الحمض النووي الريبي واستخدامها للبقع شمال. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2. مسح تصوير الفوسفور من وصمة عار شمال سبر ترنس المشار إليه- يحتوي الغشاء على الحمض النووي الريبي من سلالة كولاي NF915 حصاد النقاط الزمنية المشار إليها قبل وبعد تحريض ارجينين المجاعة (بالدقائق). بالإضافة إلى ذلك، يحتوي الغشاء على مسارين للعينات التي أغفلت فيها سبايك في الخلايا (-سيلك دا وسيلك)، ولين التي تحتوي على الحمض النووي الريبي من تصاعد في الخلايا فقط (سيلك). يحتوي على النموذج-سيلك دا كيميائيا ديسيلاتيد الحمض الريبي النووي النقال. واضح يفصل شريطين تمثل الأنواع الحمض الريبي النووي النقال التهمة الموجهة إليه ودون توجيه تهم لهم. وأضافت المذكرة إشارة ضئيلة من الحمض الريبي النووي النقالسيلك في الممرات دون سبايك في الخلايا. جردت الغشاء نفسه تباعا وريبروبيد ترنس المبينة على اليسار. منطقة محاصر في وصمة عار العلوي يشير إلى الجزء من وصمة عار، الذي يظهر بروبينجس الحمض الريبي النووي النقال اللاحقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3. التحديد الكمي لوصمة عار شمال. يتم قياس وفرة الحمض الريبي النووي النقال باستخدام البرمجيات. (A) A حارة واحدة من وصمة عار شمال ينظر في الشكل 2 سبر للحمض الريبي النووي النقالأرجفيزق. السهم العلوي والسفلي تدل أمينواسيلاتيد الحمض الريبي النووي النقال، وديسيلاتيد الحمض الريبي النووي النقال، على التوالي. إضافة الخطوط الحمراء التي تعمل بالتوازي مع لين وتستخدم لتحديد المنطقة للقياس الكمي. (ب) التحديد الكمي للإشارات ضمن خطوط حمراء كسر اثنين ينظر في (أ) يصور كرسم بياني، حيث المحور الأفقي يبين المسافة من أعلى السطر في (A) (بكسل)، والمحور الرأسي يوضح شدة الإشارة (بتهمة). اثنين إلى الذروة التي تحتوي على الإشارات الصادرة من أمينواسيلاتيد الحمض الريبي النووي النقال، وديسيلاتيد الحمض الريبي النووي النقال، على التوالي، يتم تعريف يدوياً. البيانات التي يتم تصديرها لمزيد من التحليل هو القيمة المقابلة لمنطقة تحت كل من قمم اثنين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4. النتيجة الممثل: القياس الكمي لوفرة الحمض الريبي النووي النقال(د) فرض مستويات أثناء المجاعة ارجينين. التحديد الكمي للعصابات في شمال وصمة عار هو مبين في الشكل 2. (أ) النسبي وفرة الحمض الريبي النووي النقالجلتوفو (أحمر) والحمض الريبي النووي النقالأرجفيزق (الأزرق) والحمض الريبي النووي النقالهيسر (أخضر). يتم تعيين مستوى عثر عليها في صفر دقيقة (عينات تحصد فقط قبل ظهور المجاعة) إلى 1. (ب) فرض مستوى ترناس ثلاثة نفسه كما هو الحال في (أ). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

خصوصية التحقيق تسلسل التحقيق
ترنارجفيزق 5-تككجاككجكتكجتكجتاجك
ترناجلوتوفو 5-ككتجتاككجككجتجااجج
ترناهيسر 5-كاكجاكاكتجاتكاكاتكك
ترناليوبقفت 5-جتاجاكاكتاكاككتجاجك
ترناليوو 5-تاتججكاكتاككاككتكاج
ترناليوو 5-كتجكجكجككاجاككتااتك
ترناليوكس 5-تاتتكتاكجتجاتتتجا
ترناليوز 5-آآآتكككتكجكجتكجكجكت
ترناليسقتفويز 5-تجكجاككاتجاتاااجتكاك
ترناثرف 5-تجججاككتكاكككتاككا
ترناتيرتف 5-تكجاككتكجاجتكجاتجا
ترناسيلك 5-أتتجاجتككاجككجكك

الجدول 1. جدول تسلسل التحقيق المقترح ترناس المحدد في K-12 كولاي .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هذا البروتوكول ويصف كيفية قياس مستوى شحن محددة كولاي في نفس الوقت ترنس ومقارنة مستويات نسبية من ترنس في عينات مختلفة. النقاط الحرجة للبروتوكول 1) للتعامل مع العينات بطريقة أن تبقى مستويات الحمض الريبي النووي النقال مشحون الخلوية، 2) تطبيع كميات الحمض الريبي النووي النقال في مثل هذه طريقة أنه يمكن مقارنة مستويات الحمض الريبي النووي النقال النسبي في عينات مختلفة موثوق، و 3) ضمان sp اسيفيسيتي تحقيقات مختارة ترناس الفائدة. يتم تناول هذه النقاط على حدة أدناه.

تنقية الحمض الريبي النووي النقال

ترناس يتم تنقيته من كولاي بطريقة لطيف هو الأمثل للإبقاء على مستويات رسوم الهاتف الخلوي. فمن خلال تجربتنا أن هذا البروتوكول أساسا مقتطفات الكشف أقصر من 150 nt، وبالتالي يشكل الحمض الريبي النووي النقال جزء كبير من الجيش الملكي النيبالي المنقي. ولهذا السبب، لا ينصح باستخدام هذا البروتوكول لتنقية الحمض النووي الريبي مجموع من كولاي. ينبغي أن يكون البروتوكول المعروضة هنا أيضا مناسبة للكشف والتحديد الكمي للكشف الأخرى مثل رنا الصغيرة (سرنا) دون أي تعديلات أخرى. لأنه يثري البروتوكول استخراج الحمض النووي الريبي لتسلسل الحمض النووي الريبي قصيرة ينبغي أن تجد أيضا استخدام حتى لو سرنا تحت التحقيق وتعرب الرخيصة.

التطبيع قبل سبايك في الخلايا

لمقارنة مستويات الحمض الريبي النووي النقال عبر نماذج مختلفة، من الضروري أن تطبيع مستويات الحمض الريبي النووي النقال إلى مستويات نسخة موجودة في نفس متوسط عدد كل خلية في جميع العينات، بغية تصحيح الاختلافات عينة بعينه في الجيش الملكي النيبالي الاسترداد وتحميل جل. ولهذا الغرض، نحن سبايك العينات مع 5% خلايا المرجعية التي أوفيريكسبريس الحمض الريبي النووي النقال نادرةسيلك قبل تنقية الحمض النووي الريبي. سبايك في الأسلوب الأفضل عبر استخدام الحمض النووي الريبي ذاتية كمرجع، نظراً لأنه يتيح المقارنة بين مستويات الحمض الريبي النووي النقال عبر الظروف حيث لا الكشف الذاتية معروفة على وجه اليقين التي يمكن العثور عليها في تركيز الخلوية نفس. استخدام خلايا كولاي كمسمار في عيب أن 5% إضافي كولاي الجيش الملكي النيبالي هو إضافة إلى جميع العينات التجريبية، حيث أنه يسهم في الإشارة للجيش الملكي النيبالي للفائدة. ويعزى هذا التحيز قبل بما في ذلك عينة تحتوي على المصطلحات الخاصة في الخلايا فقط عن كل وصمة عار شمال، وتصحيح القيم الرنا كما هو موضح في الخطوة 11.4.1. التعبير عن الحمض الريبي النووي النقالسيلك في الخلايا من نوع البرية منخفضة جداً مقارنة بغيرها ترنس (انظر الشكل 2) أنه ليس فرقا كبيرا في التحديد الكمي ومما يمكن إهمال. ومع ذلك، في السلالة المرجعية MAS1074، حيث يتم التعبير عن سيلك بمروج7 ر على بلازميد نسخة عالية، فإننا نقدر أن تنتج الحمض الريبي النووي النقال أكثر على الأقل 1,000-foldسيلك حضور 1 مم إيبتج من تلك التي تنتجها wildtype هاء القولونية K-12 تحت أي ظرف من الظروف. MAS1074 يتوقف النمو بعد جيلين من كامل إيبتج التعريفي. عند هذه النقطة، ثقافة للاختلافات في الاستقراء من الحمض الريبي النووي النقالسيلك صغيرة، وعدم اهتمام بهذا البروتوكول كمختبرين جميع المصطلحات الخاصة في الخلايا لتجربة واحدة مأخوذة من ثقافة المستحث نفس MAS1074. كبديل ل MAS1074، يمكن استخدام الخلايا من كائن حي الجيش الملكي النيبالي الذي سوف لا كروسريكت مع المسبار التهجين كمسمار في الخلايا. بنجاح استخدمت كمسمار في الخلايا سولفاتاريكوس سولفولوبوس للتجارب مع الحمض الريبي النووي النقال كولاي 4. ومع ذلك، من المحتمل أكثر دقة وتعكس درجة تحلل الخلية من الخلايا التجريبية، كولاي سبايك في الخلايا كما أنه من غير المؤكد ما إذا كانت س. سولفاتاريكوس بنفس الكفاءة ك كولاي. أيضا، تزايد س. سولفاتاريكوس أكثر مملة لأنها تنمو في 85 درجة مئوية مع وقت جيل من ح ~ 16.

ضمان خصوصية ترنس مختارة

إذا كان كلا من أمينواسيلاتيد وديسيلاتيد الحمض الريبي النووي النقال قد تم بنجاح ينبغي الكشف عنها المنقي شريطين على الغشاء الشمالية. المسافة بين العصابات اثنين سوف تختلف تبعاً الحمض الريبي النووي النقال محددة قيد التحقيق، وهو نتيجة الجمع بين الفرق في حجم وخصائص القطبية وتكيف تؤدي حمض أميني معين عند وهو ملزم الحمض الريبي النووي النقال خاص5 . على سبيل المثال، المسافة بين أمينواسيلاتيد وديسيلاتيد الحمض الريبي النووي النقال أكبر للحمض الريبي النووي النقالأرجفيزق مما عليه للحمض الريبي النووي النقالجلتوفو، كما هو مبين في الشكل 2. ونتيجة للحجم الكبير لجل المستخدمة هنا لفصل الجيش الملكي النيبالي، القرار عالية بما يكفي لتمييز مشحونة بالحمض الريبي النووي النقال من دون توجيه تهمة إليه ولكن أيضا تميز معظم ترنس مختلفة عن بعضها البعض بسبب الخلافات بينهما في الطول، وتسلسل تكوين، وتعديل الأنماط. ويمكن تمييز ترناس حتى إيسواكسيبتينج كما هو موضح ل leucine قبول ترناس2. ومع ذلك، نلاحظ في هذه الدراسة أنه من غير الممكن التمييز بين الحمض الريبي النووي النقالليوبقف منعبداللهمن الحمض الريبي النووي النقال، ما هو الفرق في تسلسل واحد جرام فقط لاستبدال T.

إذا كان اثنين أو أكثر من نطاقات تظهر على الغشاء شمال قد يكون نتيجة كروسريكتيون للتحقيق مع الكشف الأخرى. ويمكن زيادة التشدد في المياه والصرف الصحي والخطوة (الخطوة 9.5) عن طريق زيادة درجة الحرارة عادة حل هذا. الغسيل 30 دقيقة في 55 درجة مئوية عادة ما تكون كافية. إذا تزايد صرامة الغسيل لا يزيل الصليب-التهجين، يمكن أن تكون الحل لتصميم مجس جديدة مكملة لجزء (متداخلة في كثير من الأحيان جزئيا) مختلفة من تسلسل الحمض الريبي النووي النقال. يمكن أيضا أن تكون نطاقات إضافية المرحل من تحقيق سابقة، نتيجة لتجريد غير كاف للغشاء. لمنع هذا، قم بعنصر تحكم قطاع بتعريض الغشاء قبل إعادة التدقيق. في حالة ظهور عصابات على تفحص السيطرة الغشاء قد تحتاج إلى تجريد إضافية. من الممكن عادة إعادة التحقيق غشاء على الأقل 8-10 مرات ولكن بعد تحقيقات عديدة يمكن أن يكون من الصعب على الشريط تماما. إذا كان هذا هو الحال، يمكن تخزين الغشاء لبضعة أشهر قبل إعادة التدقيق كاضمحلال 32ف سريعة.

ويمكن الحصول على مزيد من التحقق لخصوصية التحقيق عن طريق إجراء الشمالية وصمة عار مع الخلايا التي تحصد في ظل مجموعة من الظروف فيها نسخة الفائدة من المتوقع أن تتأثر بطريقة يمكن التنبؤ بها. على سبيل المثال، التعبير إيندوسيبلي من الحمض الريبي النووي النقال من بلازميد أو الموت جوعاً من الأحماض الأمينية للحمض الأميني المشابهة، ينبغي أن يؤدي في مستوى تعبير نسبي زيادة أو انخفاض مستوى شحن، على التوالي، من الحمض الريبي النووي النقال للفائدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون ماريت وارير للمساعدة التقنية الممتازة. هذا العمل كان يدعمها "المجلس الدانمركي" "البحوث المستقلة" | العلوم الطبيعية [1323-00343B]، ومؤسسة البحوث الوطنية الدانمركية [DNRF120].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Urea Merck 57-13-6 Purity >99%
Polyacrylamide Serva 79-06-7
Bis (N,N'-Methylene-bis-acrylamide) BIO-RAD 161-0201
Trichloroacetic acid (TCA) Sigma 76-03-9
Phenol Merck 108-95-2
IPTG
Glucose
Sodium Acetate
EDTA
Ethanol
Tris
Hydrochloric acid
Sodium Chloride
NaH2PO4
Sodium Citrate
SDS
Herring Sperm DNA Sigma 100403-24-5
BSA
Polivinylpyrrolidone
Ficoll
P32 γATP Perkin Elmer
DNA oligos (probes) TAG Copenhagen
Hybond N+ membrane GE Healthcare RPN203B
Crosslinker
Electroblotter BIO-RAD
Typhoon FLA 7000 Scanner GE Healthcare 28955809
Spectrophotometer
Hydridization oven
Geiger-Müller tube
Phosphor imager screen GE Healthcare
Hybridization tube
Culture Flasks
1.5 ml microcentrifuge tubes
20 ml centrifuge tubes
Name Company Catalog Number Comments
Software
ImageQuant GE Healthcare
Excel Microsoft

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Varshney, U., Lee, C. -P., RajBhandary, U. L. Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase. J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).
  2. Sorensen, M. A. Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy. J Mol Biol. 307 (3), 785-798 (2001).
  3. Krüger, M. K., Sørensen, M. A. Aminoacylation of hypomodified tRNAGlu in vivo. J. Mol. Biol. 284 (3), 609-620 (1998).
  4. Svenningsen, S. L., Kongstad, M., Stenum, T. S., Muñoz-Gómez, A. J., Sørensen, M. A. Transfer RNA is highly unstable during early amino acid starvation in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 45 (2), 793-804 (2017).
  5. Enriquez, J. A., Attardi, G. Evidence for aminoacylation-induced conformational changes in human mitochondrial tRNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (16), 8300-8305 (1996).
  6. Parker, J. Errors and alternatives in reading the universal genetic code. Microbiol Rev. 53 (3), 273-298 (1989).
  7. Traxler, M. F., et al. The global, ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli. Mol Microbiol. 68 (5), 1128-1148 (2008).
  8. Zhong, J., et al. Transfer RNAs Mediate the Rapid Adaptation of Escherichia coli to Oxidative Stress. PLoS Genet. 11 (6), e1005302 (2015).
  9. Kane, J. F. Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol. 6 (5), 494-500 (1995).
  10. Baca, A. M., Hol, W. G. Overcoming codon bias: a method for high-level overexpression of Plasmodium and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli. Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).
  11. Li, S., Pelka, H., Schulman, L. The anticodon and discriminator base are important for aminoacylation of Escherichia coli tRNA (Asn). J Biol Chem. 268 (24), 18335-18339 (1993).
  12. Rizzino, A. A., Freundlich, M. Estimation of in vivo aminoacylation by periodate oxidation: tRNA alterations and iodate inhibition. Anal Biochem. 66 (2), 446-449 (1975).
  13. Dittmar, K. A., Sorensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation. EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).
  14. Zhou, K., et al. Novel reference genes for quantifying transcriptional responses of Escherichia coli to protein overexpression by quantitative PCR. BMC Mol Biol. 12 (1), 18 (2011).
  15. Jacobson, A., Gillespie, D. Metabolic events occurring during recovery from prolonged glucose starvation in Escherichia coli. J Bacteriol. 95 (3), 1030-1039 (1968).
  16. McCarthy, B. The effects of magnesium starvation on the ribosome content of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta (BBA)-Specialized Section on Nucleic Acids and Related Subjects. 55 (6), 880-889 (1962).
  17. Zundel, M. A., Basturea, G. N., Deutscher, M. P. Initiation of ribosome degradation during starvation in Escherichia coli. Rna. 15 (5), 977-983 (2009).
  18. Piir, K., Paier, A., Liiv, A., Tenson, T., Maivali, U. Ribosome degradation in growing bacteria. EMBO Rep. 12 (5), 458-462 (2011).
  19. Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced grown of Salmonella typhimurium. J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).
  20. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).
  21. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold spring harbor laboratory press. (1989).
  22. Sorensen, M. A., Jensen, K. F., Pedersen, S. High concentrations of ppGpp decrease the RNA chain growth rate. Implications for protein synthesis and translational fidelity during amino acid starvation in Escherichia coli. J Mol Biol. 236 (2), 441-454 (1994).
  23. Tian, C., et al. Rapid Curtailing of the Stringent Response by Toxin-Antitoxin Module-Encoded mRNases. J Bacteriol. 198 (14), 1918-1926 (2016).

Tags

الكيمياء الحيوية، مسألة 126، الإشريكيّة القولونية، الأحماض النووي الريبي، والجيش الملكي النيبالي غير الترميز، وتنقية الحمض النووي الريبي، نقل الجيش الملكي النيبالي، فرض مستوى، أمينواسيلاتيون، والجيش الملكي النيبالي الكمي، وصمة عار شمال.
التحديد الكمي للوفرة وفرض مستويات نقل الكشف في <em>الإشريكيّة القولونية</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stenum, T. S., Sørensen, M. A., … More

Stenum, T. S., Sørensen, M. A., Svenningsen, S. L. Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (126), e56212, doi:10.3791/56212 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter