Summary
Burada doğrudan transfer RNA transfer RNA'ın göreli düzeyleri, ya da herhangi bir kısa diğer RNA, spike-in toplama göre farklı örnekleri arasında karşılaştırmak için bir yol yanı sıra arıtılmış Escherichia coli RNA düzeyleri şarj ölçmek için bir yöntem mevcut hücre başvurusu gen ifade.
Abstract
Transfer RNA (tRNA) herhangi bir canlı translasyonel makinelerin önemli bir parçasıdır. tRNA bağlamak ve amino asitler için çeviri ribozom aktarın. Farklı tRNA göreli seviyeleri ve aminoacylated oranı tRNA toplam tRNA, şarj düzeyi olarak bilinen için doğruluk ve çeviri hızını belirlemede önemli faktörlerdir. Bu nedenle, bolluk ve şarj tRNA düzeyde protein sentezi, örneğin çeşitli stres koşullarında okurken ölçmek için önemli değişkenlerdir. Burada, tRNA hasat ve doğrudan göreli bereket ve Escherichia colibelirli tRNA türler mutlak şarj düzeyini ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. TRNA tRNA ve onun amino asit arasında değişken bağ korunmuş şekilde hasat edilir. RNA sonra Jel Elektroforez ve kurutma, ücret ve doldurulmamış tRNA ayrılması hangi sonuçlar Kuzey tabi tutulur. Normalleştirme spike hücreler ilavesi nedeniyle farklı örneklerinde belirli tRNA düzeyde karşılaştırılabilir. Önce RNA arıtma, her örnek için nadir tRNAselC yatırıma E. coli hücrelerinin % 5 ekleyin. Bir örnek ilgi tRNA tür miktarı o zaman tRNAselC aynı örnek miktarı için normalleştirilmiş. Ayrıca spike hücreler RNA arıtma önce Ayrıca hücre lizis verimliliği tüm farklılıkları örnekleri arasında için hesaplar arıtılmış spike bileşenini RNA'lar ek avantajı vardır.
Introduction
Aşağıda, biz belirli tRNA miktarının bir yöntem mevcut ve kendi şarj ölçme düzeyleri Kuzey Blot tarafından. Bu yöntem ilk Varshney vd tarafından geliştirilen bir teknik üzerinde dayanır 1. hücre trichloroacetic asit (TCA) hasat ve RNA arıtma boyunca 0 ° C'de örnekleri tutmak, korunmuş2,3,4arasında tRNA ve amino asit ester bağı olduğunu. Aminoacylated tRNA nonacylated karşılıkları Jel Elektroforez ve seçkin Kuzey kurutma, tarafından kusura bakmayın ama aminoacylated azalmış bir hareketlilik için tRNA kovalent bağlı amino asit5tarafından neden jel içinde. Ayrıca, biz tRNA miktarları sık kullanılmayan tRNAselC 4overexpressing spike hücreler ilavesi ile normalize için bir iletişim kuralı mevcut.
tRNA bakteri hücre ve çeviri makineleri kesinlikle hayati bir parçası en bol moleküllerin bazıları. tRNA amino asitleri bağlama ve çeviri ribozomlara aktarabilirsiniz. Aminoasitler tRNA (aminoacylation veya şarj) için bağlama aminoasil tRNA sentetaz tarafından yönetilir. Farklı ücret tRNA göreli bolluk protein sentezi, kalitesini sağlamak için önemli çünkü tRNA için verilen mesajcı RNA (mRNA) kodon konağımız yakınındaki tRNA eşitlenmesi olasılığını artırır konağımız underrepresentation tahsil Yanlışlıkla onun amino asit büyüyen polipeptid zinciri ribozom6teslim. Şarj edilmiş tRNA önemini E. coli hücre geniş yanıt bir tRNA şarj düzeyleri ciddi bir düşüş olarak yansıtılır; sıkı yanıt. Sıkı tepki sırasında tRNA, ribozomal RNA'ların ve çoğu mRNA sentezi, amino asit biyosentezi ve stres hayatta kalma ile ilişkili belirli mRNA'lar transkripsiyon lehine indirilir ve hücrelerin büyüme oranı önemli ölçüde düşürdü7 . Ayrıca, bize ve diğerleri tarafından son iş E. coli aktif tRNA düzeyleri ayarlama olabileceğini düşündüren onun tRNA yanıt olarak çeviri4,8, limit gerilmeler çoğunluğu düşürür gösterdi Böyle stres ile başa çıkma için önemli. Böylece, güvenilir ölçümler tRNA zenginliği ve düzeyleri şarj tamamen bakteriyel stres yanıt-e doğru anlamak için önemli bir araç olacak.
E.coli rekombinant protein hızlı için yaygın olarak kullanılır ve türler arasında kodon kullanım farklılıkları nedeniyle bir sorun kez karşı karşıya9suboptimal ifadesidir. Bu ek tRNA rekombinant mRNA10çevirmek için gerekli ifade tarafından atlatılabilir. Böyle suşları seviyelerinde şarj tRNA ölçümleri sorun giderme çabaları rehberlik ve protein ifade en iyi duruma getirmek.
Bu yöntem, aynı zamanda "mischarging"; algılama sağlar Konağımız olmayan amino asit ile bir tRNA molekül aminoacylated. Farklı amino asitler tarafından Aminoacylation-polyacrylamide jeller1,11biraz farklı hızları ile geçirilecek bir tRNA neden olabilir. Bazı durumlarda, yöntem aynı zamanda aksi takdirde aynı tRNA3farklı değişiklik desenleri ayırt etmek için kullanılabilir.
Düzeyleri şarj tRNA incelenmesi olduğunu periodate için oksidasyon başka bir biyokimyasal yordamı kurdu. TRNA korunuyorsunuz aminoacylated periodate oksidasyon ve doldurulmamış tRNA değil gözlem yöntemi kullanır. Sonra tRNA şarj şarj düzeyleri hasat RNA'ın tahmin etmek için kullanılan oksidasyon tedavi periodate. Ancak, birkaç tRNA şarj böylece biraz yanlışlık12-mek şartıyla tedavi tarafından etkilendiği gösterilmiştir. Yöntem burada doğrudan saf RNA şarj, böylece herhangi bir önyargıları kimyasal veya enzimatik reaksiyonlar hariç önlemler sundu. Bu yöntemin bir sınırlama yalnızca bir o tRNA türler algılandığında bir zamanda, öylesine her ne kadar aynı Kuzey leke-ebilmek var soymak ve birden çok tRNA için reprobed zaman alan ve pek çok tRNA üzerinde veri toplamak biraz zahmetli olması.
Örnekleri birbirlerine normalleştirme için güvenilir bir yol hedefi farklı örnekler üzerindeki göreli bir molekül düzeyde karşılaştırmak için nerede çalışmalarda önemlidir. Burada küçük bir aliquot nadir tRNAselC overexpressing E. coli hücre içinde bir spike RNA arıtma önce deneysel örnekleri eklendiği RNA için normalleştirme işlemi tanıtmak. Bu yöntem sadece tRNA incelerken ama RNA'ın herhangi bir türün göreli miktar için deneysel Kur öyle ki hiçbir endojen RNA olmak güvenilir olabilir ne zaman tüm örnekleri aynı hücresel konsantrasyon mevcut yararlı olur. Örneğin, göreli miktarları arasında farklı başka bir RNA'ın karşılaştırmak için endojen bir başvuru13örnekleri gibi bir "temizlik" RNA gibi ribozomal RNA düzeyini kez kullanılır. Ama örnekleme bir stres yanıt15,16,17 veya sırasında oluşursa ribozomal RNA için durum olabilir gibi bu küçük kullanımı başvuru RNA hücresel konsantrasyonu örnekleri arasında değişir durağan faz17girmesinden. Spike hücreler RNA arıtma önce deneysel örnekleri için ek normalleştirme örnekleme kurulumunu bağımsız sağlam ve doğru bir yol sağlar. Başka bir belirli bir veya daha fazla spike içinde RNA'ların deneysel örnekleri eklenmesinden sonra RNA arınma yoludur. Ancak, bu yöntem için RNA kurtarma farklılıklarını örnekler arasındaki hesap değil.
E. coli hücreleri kullanarak bir deneyde E. coli olarak (bkz: şekil 1) spike hücreler olarak RNA gönderme yapıyor bunun dezavantajı o overexpress Ayrıca eksojen E. coli az miktarda toplam RNA örnekleri. Biz bu ek için yalnızca spike hücreler (bkz. Şekil 2, lane "selC" etiketli leke Kuzey) deneysel örnekleri ile paralel olarak içeren bir örnek analiz ederek doğru. Sunulan protokolü E. coli K-12 için geliştirilmiş ancak çoğu bakteriyel türler için geçerli olması muhtemeldir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bakteriyel kültürlerde hazırlanması.
- Grow bütün kültürlerde Erlenmeyer şişeler ile bir kültür/şişesi hacim oranı en az 1/6. 37,0 ° C'de kültürler ve tercih edilen karbon kaynağı, örneğin % 0,2 glikoz, en az 10 ile takıma morpholinepropanesulfonic asit (paspas) en az orta 18 160 rpm'de sallayarak tipik bir deneysel Kur içinde büyümek RNA hasat önce üst üste nesilleri.
- RNA hasat, önceki gün seyreltik BEZLERİ en az orta ertesi gün istediğiniz saatte istediğiniz OD 436 ulaşacak şekilde istenen yük outgrown bir kültür. Aşılama için formül tarafından kullanmak için kültür geçmek hacmi hesaplamak:
Not: Burada, OD Yeni istenen OD 436 gösterir Kuluçka sonra V Yeni gösterir seyreltilmiş kültür hacmi, OD eski gösterir üzerinden seyreltilmiş outgrown kültürünün OD 436, G gösterir kültür büyür, nesil sayısı üzerinden seyreltme (TRT 1) gün sonra (t 2) gerekli değildir ve olarak hesaplanan zaman zaman: zaman farklılığı (dk) arasında TRT 1 ve t 2 nesil süresi (dk) bölünür. Örnekleme zamanında kararlı durum büyüme sağlamak için G olmalıdır ≥ 10; V eski taze ortamına aktarılması gerektiğini dışı yetiştirilen kültür seviyesini gösterir. Bu denklem için herhangi bir gecikme aşama hesaba katmaz bir yaklaşım olduğunu; seyreltme taze medya dışı yetişkin bir kültür sonra sık sık gözlenen bir fenomen.- Büyüme koşulları deneme amacına bağlı olarak değişiklik gösterir, ama hücre hücre varyasyon tRNA düzeyleri ve sonuçları (önerilen), tekrarlanabilirlik artırmak için büyümek örnekleme öncesi durumunu sürekli kültürler sınırlamak için 19.
2. Spike hücreler hazırlanması
Not: tRNA selC bir izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) kontrolü altında kodlama selC gen ifade E. coli zorlanma MAS1074,- indüklenebilir organizatörü spike zorlanma kullanılır.
- Dilute MAS1074 outgrown bir kültür 0,05 BEZLERİ içinde bir OD 436 için en az orta 100 µg/mL Ampisilin ve % 0,2 glikoz ile desteklenmiştir. 160 rpm'de sallayarak 37 ° C'de kültür büyümek.
Not: tartışma bir alternatif başvuru zorlanma kullanımı için bkz. - , OD 436 ~ 0,1, tRNA selC ifade ikna etmek için 1 mM son bir konsantrasyon IPTG ekleyin. Kültür OD 436 ~0.5 için büyümek (~ 3-4 s büyüme) ve kültür şişeye bir buz banyosu için hareket. RNA arıtma için tüm örneklerini hasat kadar buz spike hücre kültür devam.
3. Deneysel örnekleri hasat.
- Öncesi sıcak (37 ° C) bir şapkalı 100 mL Erlenmeyer şişesi (veya benzeri) bir sıcak su banyosunda yerleştirerek her örnek için 4 mL % 10 (w/v) trichloroacetic asit (TCA) içeren.
Not: dikkat, hidrojen klorür ve kloroform gibi toksik ve aşındırıcı duman üreten Isıtma üzerine TCA parçalanır. Güçlü bir asit suda çözümdür; Bu şiddetle üsleri ile reaksiyona girer ve birçok metaller atmış. Bu sıvı kullanırken gerekli tedbirleri alınmalıdır. - Hemen önce hücre hasat, ölçmek ve kültür OD 436 rekor.
- Hücreleri hasat, kültür 4 mL TCA içeren önceden ısıtılmış bir şişesi transfer.
- İçin 5 s. karıştırma TCA ile hemen tüm enzimatik faaliyetleri devre dışı bırakır ve böylece tRNA şarj düzeyini korur şişeye el ile dönen tarafından örnek mix.
Not: Eğer birden fazla örnekleri toplanması için tüm örnekleri toplayana kadar hasat örnekleri TCA buz üstünde tutun.
4. Ayrıca spike hücreler
Not: spike hücreler hazırlanması adım 2'de açıklanan.
- Ne zaman tüm örnekleri için RNA hazırlık
- toplanmıştır, her örnek için (OD üzerinde göre) % 5 spike hücreler ekleyin.
Not: Gerekli spike hücre kültür hacmi formülle hesaplanır:
V spike gerekli, spike-in hücre kültürü hacmi gösterir nerede V exp hacmi gösterir (TCA) olmadan hasat deneysel hücre kültürü, OD exp deneysel hücre kültürü OD 436 hasat TCA içine zaman gösterir. OD spike spike hücre kültürünün OD 436 gösterir. Eğer birden fazla örnekleri farklı ODs hasat, birimin eklendi spike hücreler her örnek için formüle göre ayarlanmalıdır.
Spike hücreler katkısı faiz, RNA türü ölçmek için - sadece 4 mL spike hücreler 4 mL TCA ile karıştırılarak spike hücreler içeren bir örnek hazırlamak. RNA bu örnekten diğer örnekleri için aynı şekilde hazırlayın.
- İsteğe bağlı olarak, spike hücreler, olmadan sadece deneysel örnek içeren başka bir şişe al ve tRNA için deneysel örnek katkısını ölçmek için içerir selC düzeyleri; tRNA selC endojen düzeyleri E. coli K-12 negligibly düşük.
5. RNA'ın hazırlık
Not: Burada açıklanan RNA hazırlık protokoldür esasen Varshney ve ark. tarafından açıklanan 1; Aminoacylated tRNA deacylation arıtma sırasında önlemek için asidik pH ve arıtma seyri boyunca 0 ° C'de örnekleri tutmak önemlidir. Örnekleri ve çözümleri tutmak için temiz steril tüpler/şişeler kullanın ve tüm çözümler ultrasaf (18,2 MΩ·cm direnci ile) su hazırlayın.
- Bir buz soğuk santrifüj tüpü dönüştürmek dökün 8 mL. Örnekleri de 4 ° C. tamamen Kaldır süpernatant 9.500 x g, 10 dk santrifüj kapasitesi ve 0.3 mL soğuk 0,3 M sodyum asetat içinde pH 4.5 ve 10 mM EDTA resuspend.
- Her örnek için bir soğuk 1.5 mL microcentrifuge tüp nakletmek ve eklemek ile aynı tampon equilibrated 0.3 mL fenol.
Not: dikkat, fenol zehirli gazlar oluşturur ve cilt için son derece korozif. - Girdap her örnek 10 x 15 için en az 1 dk her girdap arasında bir iyimsersin. Vortexing arasında örnekleri 0 tutmak ° C. örnekleri soğuk kalmasını sağlamak için sık sık duraklar kullanın.
- İçin 20.000 x g 4 de 15 dk santrifüj örnekleri ° C. Transfer (üst aşama) su aşamaya yeni 1.5 mL microcentrifuge tüpleri. 0.3 mL soğuk fenol ve girdap 4 x 15 s daha önce olduğu gibi ekleyin.
- 4'de 20.000 x g, 10 dk santrifüj ° C. Transfer 2,5 kat % 96 etanol (~ 750 µL) birimi içeren yeni, soğuk 1.5 mL microcentrifuge su aşamaya tüpleri. Tüpler için 1 h-20 ° C veya gecede-80 kuluçka tarafından RNA çökelti ° C.
- İçin 20.000 x g 4 de 30 dk santrifüj örnekleri ° C. süpernatant atmak ve RNA Pelet bozmadan 1 mL soğuk % 70 etanol dikkatle ekleyin. Yavaşça iç etanol ile tüplerin yıkamak için bir kez tersine çevirin.
Not: Pelet Bu adımda görmek zor olabilir. - 4'de 20.000 x g, 10 dk santrifüj ° C. tamamen süpernatant kaldırmak ve kadar hiçbir etanol sol Pelet kuruması. Pelet tarafından şiddetle vortexing 20 µL soğuk 10 mM sodyum asetat pH 4.5 ve 1 mm EDTA resuspend.
Not: o-ecek var olmak resuspend zor gibi Pelet aşırı kuru değil. - İsteğe bağlı olarak, RNA konsantrasyonu 260 Absorbans ölçerek değerlendirmek nm.
- İsteğe bağlı olarak, özel Jel Elektroforez 20 tarafından arıtılmış RNA kalitesini değerlendirmek.
- Mağaza örnekleri-80, ° C.
Not: Burada protokol duraklatılmış.
Not: aminoacylated grup ayırt etmek için Kuzey üzerinde deacylated karşılığından tRNA leke, bir kimyasal deacylated aliquot alkali tedavisi tarafından hazırlanmıştır. Çoğu amaç için Kuzey her leke için deacylate tek bir örnek yeterli.
Buz- tezcan RNA örnek. 4 µL aliquot RNA örneği için yeni bir tüp aktarın. 46 µL Tris-HCl pH 9.0 ekleyin. 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya
- PH 4.5 0,3 M sodyum asetat 15 µL ekleyip daha sonra 125 µL % 96 etanol ekler. -20 ° c için 1 h. RNA çökelti
- İçin 20.000 x g 4 de 30 dk santrifüj ° C. tamamen süpernatant kaldırmak ve 4 µL soğuk 10 mM sodyum asetat pH 4,5 ve 1 mM EDTA içinde resuspend.
Not: örnek-80 depolanıyorsa, protokol, duraklatılmış ° C.
7. Jel Elektroforez ve Kuzey kurutma
- Mix 4 µL örnek (tedavi edilmemiş veya kimyasal olarak deacylated) ile 6 µL yükleme arabellek (0.1 M sodyum asetat (pH 5,0), 8 M üre, % 0.05 bromophenol mavi ve % 0.05 Ksilen cyanol).
Not: yalnızca spike hücreler, içeren örnek eklemeyi unutmayın kimyasal olarak deacylated sample (ve bir hazır spike hücreler, olmadan). - Örnekleri üzerine bir 0.4 mm kalınlığında % 6,5 polyacrylamide 0.1 M sodyum asetat arabellek (pH 5,0) 8 M üre içeren jel (19:1 acrylam - ide:bisacrylamide) yükleyin. TRNA türler uygun ayırma için 60 cm uzun jelleri kullanın.
- Ayrı RNA, 4 ° C'de 10 V/cm Jel Elektroforez tarafından mavi bromophenol kadar ulaşır jel (~ 20 h) alt.
- Alan Ksilen cyanol boya ve bromophenol mavi doğru aşağı 20 cm boya kurutma için kullanılır (iki boyalar arasındaki uzaklığı 25-30 cm olmalıdır). Böylece jel onlardan biri kalır iki cam levha, dikkatlice ayırın. Filtre kağıdı ince bir parçası istenen blotting alan boyutuna kesme ve kurutma için kullanılacak jel parçası üzerine yerleştirilir. Filtre kağıdı tarafından kapsanmayan jel parçaları kesilmiş ve atılan. jel parça cam levha uzak çýkýntýdan için filtre kağıdı kullanın.
Not: Büyük jel çok kırılgandır çok özenle ele. - Pozitif yüklü naylon membran (örneğin Hybond N + membran) jel üstüne yerleştirilir ve bu electroblotted 20 V 90 dk 40 mM Tris-asetat (pH 8.1), 2 mM EDTA Aktarım arabellek kullanarak için.
- Crosslink RNA UV ışık kullanarak membran için (0,12 J/cm 2).
Not: Membran-ebilmek şimdi var olmak stok oda sıcaklığında ve protokol burada duraklatıldı.
8. Tasarım ve sondalar doğrulanması
Not: dikkatli tasarım ve Kuzey leke probları doğrulanması güvenilir sonuçlar elde etmek ve diğer RNA türleri ile istenmeyen çapraz hibridizasyon önlemek için çok önemli.
- Kullanım probları olarak kısa sentetik oligonucleotides. Sonda sıra faiz tRNA dizisi en benzersiz bir parçası için tamamlayıcı - bu kez antikodon döngü olduğunu bir şekilde Tasarla.
Not: Çeşitli organizmalar üzerinden tahmin edilen tRNA sıralarının listesini veritabanı (GtRNAdb) 21 genomik tRNA bulunabilir. - Ayarlama bir tahmin almak için dizinin uzunluğunu erime sıcaklığı 55-65 ° c
- Patlama (temel yerel hizalama arama aracı) seçilmiş sıra sıra 22 içinde açıklandığı gibi seçili tRNA için benzersiz olduğunu doğrulamak için deneyde kullanılan bakteriyel zorlanma genom dizisi karşı.
Not: Tablo 1 E. coli K12 birkaç farklı tRNA için önerilen sonda serilerini listeler. Sonda faiz tRNA için belirli ise, sadece iki grup Kuzey leke (şarj edilmiş ve doldurulmamış tRNA) görünür ve yalnızca bir grup şeritte deacylated örnek (doldurulmamış tRNA) ile görülür. Daha--dan iki grup varsa veya daha fazla sonda özgüllük doğrulanmasını isterseniz, bkz.
9. Kuzey blot hibridizasyon
Not: Aşağıdaki adımlarda, membran sırayla probları başvurusu için belirli bir sonda da dahil olmak üzere istediğiniz belirli tRNA tamamlayıcı ile melezleşmiştir tRNA selC.
- Membran bir hibridizasyon tüpü yerleştirin ve 6 mL hibridizasyon çözüm ekleyin (0.9 M NaCl, 0,05 M NaH 2 PO 4 (pH 7,7), 5 mM EDTA, %0,5 (w/v) SDS, 100 mg/mL sheared ve denatüre ringa balığı sperm DNA ve 5 x Denhardt ' s çözüm (100 x Denhardt ' s çözüm % 2 sığır serum albümin, % 2 polyvinylpyrrolidone 40 ve % 2 = Ficoll)).
- Ön arabellek için 1S 42 ° C. Ekle 30 pmol radyoaktif oligo-DNA prob 5 dönen membran melezlemek ' - sonu - etiketli ile 32 (Sambrook et al. tarafından açıklandığı gibi hazırlanmış P 23)
Not: dikkat, 32 P yüksek enerjili beta emisyonları önemli cilt ve göz doz tehlike sunabilirim. 32 s. radyoaktif atık kullanarak, uygun kurumsal güvenlik protokollerini göre atılmalıdır zaman gerekli tedbirleri alınmalıdır. - Membran gece 42, dönen sonda kuluçkaya ° C. Kaldır tek kullanımlık 10 mL pipet kullanarak soruşturma.
Not: Eğer bir dolaba saklanan sonda kullanılabilmesinden. - Hibridizasyon tüpte membran 0.3 M NaCl, 30 mM sodyum sitrat, % 0,1 (w/v) SDS oda sıcaklığında 50 mL kısa bir süre içinde yıkayın.
Not: Bu ilk yıkama çok ilişkisiz sonda içerir ve son derece olarak radyoaktif işlenmeli. - Tekrar bir kez 9,4 adım, o zaman bir düz plastik konteyner veya bir kapak dahil olmak üzere tepsi membran taşıma. Yıkama solüsyonu (0.3 M NaCl, 30 mM sodyum sitrat, % 0,1 (w/v) SDS) membran kapak ve oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
- Yıkama çözüm değiştirin ve çamaşır kadar tatmin edici bir sinyal-gürültü oranı (, çözüm yıkama kez 3-4 değişiklikleri) elde etti. Nasıl boş bir alanı radyasyondan membran ölçerek gürültü oranı sinyal değişiklikleri algılamak ve nerede sonda özellikle tRNA melezleşmiştir alanına karşılaştırmak için bir Geiger-Müller tüpü kullanın. Sonda zar maruz kaldıktan sonra şerit edebilmek için
- emin olun (önemli) membran önce striptiz yordamı kurumasına olduğunu. Membran bir ince plastik torba veya sıkıca plastik kullanarak sarın ve hava-teyp veya kaynak tarafından sıkı sıkıya bağlanmanızı mühür şal yerleştirin. Mühürlü membran phosphorimaging ekrana koyun.
Not: Phosphorimaging ekrandaki gerekli çekim hızı belirlenir sonda, özel faaliyetin tarafından RNA miktarı fo probedr ve sonda ve can hibridizasyon etkinliğini büyük ölçüde değişir; birkaç gün için bir kaç dakika uzaklıktadır. Deneyimi ile membran Geiger-Müller tüpü ile algılanan radyasyon şiddetini gerekli çekim hızı iyi bir gösterge sağlar. Güvenilir miktar için ekran değil pozlanmış önemli. - Bir lazer tarayıcı kullanarak phosphorimaging ekran tarama ve dosyaya kaydetmek " .gel " biçimi.
Not: Bir yüksek sinyal gürültü oranı güvenilir miktar için gereklidir. Bir tRNA sondalama iki bantlarında sonuçlanmalıdır; bir içeren aminoacylated tRNA (daha yavaş geçiş) ve bir içeren deacylated tRNA (daha hızlı geçiş). Bkz: Şekil 2.
10. Membran sıyırma
Not: membran için başka bir tRNA probed önce önceki sonda ilk membran sıyırma tarafından kaldırılmalıdır.
Membran kapak ve membran dökmek için- ısı yeterince sıyırma arabellek (15 mM NaCl, 1.5 mM sodyum sitrat, % 0,1 (w/v) SDS). 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Tekrarlama adım 10.1 radyasyon yok kadar bir Geiger-Müller tüpü ile tespit; membran-ebilmek şimdi var olmak bölüm 9 açıklanan adımları izleyerek yeniden melezleşmiştir.
11. TRNA miktarının ve düzeyleri şarj
- yükü görüntüleme .gel dosyasına yazılım (Tablo reçetesi görmek). Nereye sinyal 3A rakam gösterildiği gibi düzensiz, olabilir bu yolun genişliğini çoğunu yayılmıştır ancak bantları kenarları hariç böyle bir şekilde her örnek yolları boyunca dikey bir çizgi çizmek.
- Visualize'ı tıklatarak her şeritli gelen sayar " analiz "-> " grafik oluşturmak ". Şarj edilmiş ve doldurulmamış tRNA her şeritli gelen temsil eden iki doruklarına şekil 3B ' gösterildiği gibi tanımlarken.
- Edinmek sayıları her ayında en yüksek tıklatarak " analiz "-> " alan rapor " ve her iki doruklarına altına alan kayıt. Ne zaman leke tRNA selC ve en az bir tRNA ilgi için probed
- tRNA tRNA selC ilgi düzeyleri normale.
- Her şeritte spike hücreler kaynaklanan tRNA oranını hesaplamak ve toplam sinyal denklemi kullanarak bu şeritte değerden çıkarmak:
Not: Burada, Örnek tRNA bir tek şeritli bir membran için istenen tRNA; probed elde edilen sinyal = Örnek selC tRNA selC için; probed aynı membran aynı lane elde edilen sinyal = Ref tRNA için istenen tRNA; probed aynı membran hücre yalnızca spike içinde RNA içeren lane elde edilen sinyal = Ref selC tRNA selC için probed aynı membran hücre yalnızca spike içinde RNA içeren lane elde edilen sinyal =.
Normalize etmek - tRNA selC sinyal aynı Lane tarafından düzeltilen tRNA değeri her Lane bölmek.
Not: tRNA selC sinyal katkısı örneklenen hücrelerden ihmal edilebilir düzeydedir (bkz: Şekil 2, lane etiketli "-selC ").
- Her şeritte spike hücreler kaynaklanan tRNA oranını hesaplamak ve toplam sinyal denklemi kullanarak bu şeritte değerden çıkarmak:
- Her iki zirveleri sinyal toplamı ile dolu tRNA temsil eden en yüksek sinyal bölerek düzeyinde her lane için şarj oluyor tRNA hesaplamak (ücret + doldurulmamış).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yordamı kullanarak burada, bereket ve üç tRNA düzeyde E. coli K-12 öncesi ve amino asit açlık sırasında ölçüldü şarj açıklanır.
Arginin auxotroph süzün NF9154 (thr Leyi onun argH thi mtl supE44) BEZLERİ en az orta % 0,4 gliserol, 50 µg/mL treonin, lösin, arginin ve 5 µg/mL histidin, sallayarak 37 ° C'de ile takıma en az on nesiller için yetiştirilen oldu 160 d/dak. Arginin açlık filtrasyon kültür ve resuspension taze BEZLERİ orta yukarıda ama arginin olmadan kullanılmaya başlandı. Arginin açlık sırasında protein sentezi şiddetle azalır, ancak varolan proteinler ciro tarafından yayımlanan arginin kullanarak düşük bir düzeyde devam eder. Örnekleri o zaman hasat Puan belirtilen şekil 4' te. Sonra tüm örneklerini TCA hasat edildi, tRNAselC, overexpressing MAS1074 spike hücreler % 5 eklendi her örnek için gösterildiği gibi şekil 1. RNA örnekleri saf, Elektroforez tarafından ayrılmış ve iletişim kuralında tanımlandığı gibi bir membran deyimiyle. Membran tRNAargVYZQ, tRNAgltTUVW, tRNAhisRve tRNAselC, Şekil 2' de görüldüğü gibi sondaj. Radyasyon sinyal her Lane her dört sondalar gibi şekil 3, resimli ve düzeltilmiş ve normalleştirilmiş Bölüm 11'de açıklandığı gibi bir sayısal. Sonuçları şekil 4' te sunulmuştur. Şekil 4A test tRNA türler düzeyleri hızla son zamanlarda bildirilen4olarak amino asit açlık sırasında azalma gösterir. Şekil 4B gösterir Bu düzeyleri davranır beklendiği gibi şarj tRNA: diğer tRNA şarj düzeyleri üzerine biraz artırmak ise arginin kabul tRNA şarj edilmiş kısmını hızla arginin büyüme ortamdan kaldırılması üzerine düşer açlık tRNA birikir ne zaman substrat protein sentezi4için eksikliği nedeniyle ribozomlar decharging onların hızı azalır tahsil çünkü. Daha fazla açlık dönemi dolu tRNA kesir büyük oranda bir kalan tRNA, decharging sonuçlanır tRNA Havuzu (şekil 4A), çoğunluğu bozulması nedeniyle yaklaşık öncesi açlık düzeyleri azalır ribozom. Buna karşılık, tRNAargVYZQ şarj edilmiş kısmını en az iki nedenden dolayı artırır; 1) sıkı yanıt aktivasyonu anlamına gelir mRNA tRNAarg, ücret değil, çeviri için sınırlayıcı bir faktör haline gelir ve 2)arg's tRNA toplam havuz (şekil 4A) çok düşük toplam tRNAdaha büyük bir kısmını arg arginin aynı küçük oranda şarj edilebilir. Bu deneme nasıl eşzamanlı ölçümler tRNA bolluk ve tRNA şarj düzeyleri sağlar yüksek kaliteli protein sentezi hücre içindeki koşulları hakkında bilgi gösterir.
Şekil 1. Ek örnekler için spike hücreler. Örneğin, E. coli NF915 tek kültürünün örneklerinden bir saat serisi öncesi ve amino asit açlık sırasında hasat. NF915 büyüme eğrisi şematik gösterilir nerede mavi noktalar örnek hasat noktaları gösterir. Axes günlük ölçek vardır. Deneysel culture(s) örnekleri Bölüm 3'te açıklandığı gibi hasat. Spike-in yük MAS1074 büyüme eğrisinin bir şematik mavi bir nokta gösterilen örnek hasat amacı ile de gösterilir. Rakam, tüm deneysel örnekleri (Bu örnekte E. coli NF915) bir aliquot spike hücreler aynı başvuru kültüründen almak göstermek için noktasıdır. Her örnek için hesaplanan deneysel hücrelere %5 spike hücreler eklenir (bkz: Bölüm 4) hücre kültürleri OD üzerinde dayalı. Daha sonra RNA tüm örneklerini saflaştırılmış ve Kuzey lekesi için kullanılan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Fosfor Imager tarama Kuzey bir leke için belirtilen tRNA probed. Membran E. coli zorlanma NF915 önce ve sonra indüksiyon arginin açlık (dakika) belirtilen süre noktalarda hasat RNA içerir. Ayrıca, membran nerede spike hücreler ihmal örnekleri iki şeritleri içeren (-selC DA ve - selC), ve bir lane spike bileşeninden RNA içeren hücreleri tek (selC). -SelC DA örnek kimyasal olarak deacylated içeren tRNA. Şarj edilmiş ve doldurulmamış tRNA türleri temsil eden iki grup açıkça ayrılır. Not tRNAselC Lanes ihmal edilebilir sinyal olmadan spike hücreler eklendi. Aynı membran gittikçe soydu ve solda gösterilen tRNA için reprobed. Üst leke kutulu alanda sonraki tRNA probings için gösterilen leke kısmını gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Kuzey leke quantification. tRNA bereket yazılımı kullanılarak ölçülür. (A) A tek şeritli gelen tRNAargVYZQiçin probed Şekil 2 ' deki görüldü Kuzey leke. Üst ve alt ok belirtmek aminoacylated tRNA ve deacylated tRNA, anılan sıraya göre. Lane ile paralel kırmızı çizgiler eklenir ve miktar alanını tanımlamak için kullanılır. (B) miktar (A) görülen iki kırık kırmızı çizgiler içinde sinyal nerede yatay eksen (piksel cinsinden) (a) hattının üst mesafe gösterir ve dikey eksen (adet) sinyalin yoğunluğunu gösteren bir grafik olarak tasvir. İki sinyal içeren kaynaklanan doruklarına aminoacylated tRNA ve deacylated are tRNA, anılan sıraya göre el ile tanımlanmış. Daha fazla çözümleme için dışa aktarılan her iki doruklarına altına alan karşılık gelen değer veridir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. Temsilcisi Sonuç: miktar tRNA zenginliği, bird düzeyleri arginin açlık sırasında şarj. Şekil 2' de gösterilen Kuzey leke üzerinde gruplarından miktar. (A) göreli bolluk tRNAgltTUVW (kırmızı), tRNAargVYZQ (mavi) ve tRNAhisR (yeşil). Sıfır dakika (sadece açlık başlangıcından önce hasat örnekleri) bulunan düzey 1 olarak ayarlanır. (B) düzeyinde (A) olduğu gibi aynı üç tRNA şarj oluyor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Sonda özgüllük | Sonda sıra |
| tRNAargVYZQ | 5'-TCCGACCGCTCGGTTCGTAGC |
| tRNAgluTUVW | 5'-CCTGTTACCGCCGTGAAAGGG |
| tRNAhisR | 5'-CACGACAACTGGAATCACAATCC |
| tRNAleuPQVT | 5'-GTAAGGACACTAACACCTGAAGC |
| tRNAleuU | 5'-TATTGGGCACTACCACCTCAAGG |
| tRNAleuW | 5'-CTTGCGGCGCCAGAACCTAAATC |
| tRNAleuX | 5'-TATTTCTACGGTTGATTTTGAA |
| tRNAleuZ | 5'-AAAATCCCTCGGCGTTCGCGCT |
| tRNAlysQTVWYZ | 5'-TGCGACCAATTGATTAAAAGTCAAC |
| tRNAthrV | 5'-TGGGGACCTCACCCTTACCAA |
| tRNAtyrTV | 5'-TCGAACCTTCGAAGTCGATGA |
| tRNAselC | 5'-ATTTGAAGTCCAGCCGCC |
Tablo 1. Tablo seçili tRNA E. coli K-12. için önerilen sonda sıralarının
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı aynı anda belirli E. coli şarj düzeyini ölçmek açıklar tRNA ve farklı örneklerinde tRNA göreli düzeyleri karşılaştırın. 1) örnekleri hücresel tRNA şarj düzeyleri, 2) tRNA miktarları göreli tRNA düzeyleri farklı örneklerinde güvenilir bir şekilde karşılaştırılabilir şekilde normale ve sp 3) tutulduğunu böyle bir şekilde işlemek için protokol kritik noktaları vardır tRNA ilgi için seçili sonda ecificity. Bu noktalar aşağıda ayrı ayrı ele alınmaktadır.
tRNA arıtma
TRNA E. coli hücresel şarj seviyelerini korumak için en iyi duruma getirilmiş nazik bir şekilde saf. Bu iletişim kuralı öncelikle 150 kısa RNA'ların ayıklar bizim deneyimdir nt, böylece tRNA arıtılmış RNA büyük bir kısmını oluşturmaktadır. Bu nedenle, E. coliüzerinden toplam RNA arındırmak için bu iletişim kuralını kullanmanız önerilmez. Burada sunulan protokolü de algılama ve küçük RNA (sRNA) olmadan herhangi bir daha fazla uyarlamaları gibi diğer RNA'ların miktar uygun olmalıdır. RNA ayıklama protokolü için kısa RNA serileri zenginleştiren çünkü sRNA soruşturma altında basit ifade edilir olsa bile aynı zamanda kullanım bulmalısınız.
Normalleştirme spike hücreler tarafından
TRNA düzeyleri farklı örnekler üzerindeki karşılaştırmak için RNA örnek örnek çeşitleri için düzeltmek için mevcut tüm örneklerdeki hücre başına ortalama aynı numarasında bir transkript düzeyleri tRNA düzeylere normalleştirmek gereklidir Kurtarma ve jel yükleme. Bu amaçla, biz önce RNA arıtma nadir tRNAselC overexpress hücrelere başvurma % 5 ile örnekleri spike. Nerede yok endojen RNA'ların kesin olarak aynı hücresel konsantrasyonu bulunabilir bilinmektedir koşullarında tRNA düzeylerinin karşılaştırılması verir çünkü spike yöntem endojen bir RNA referans olarak kullanarak üzerinden tercih edilir. E. coli hücreleri spike-kullanılarak dezavantajı o %5 ilave E. coli RNA tüm deneysel örnekleri için eklenir nerede bu ilgi RNA sinyal için katkıda vardır. Bu önyargı için tarafından bir örnek sadece spike hücreler her Kuzey leke üzerinde içeren ve RNA değerleri 11.4.1 adımda anlatıldığı gibi düzeltme dahil muhasebeleştirilir. TRNAselC vahşi türü hücrelerdeki olduğunu ifade düşük (bkz. Şekil 2) diğer tRNA öyle karşılaştırıldığında miktar önemli bir fark yapmaz ve böylece ihmal. Ancak, nerede selC ifade edilen bir T7 düzenleyici tarafından yüksek kopya plazmid, başvuru zorlanma içinde MAS1074, tahmin ettiğimiz en az 1000 kat daha fazla tRNAselC 1 mM IPTG huzurunda üretilir daha E. wildtype tarafından üretilen coli herhangi bir koşul altında K-12. MAS1074 tam IPTG indüksiyon iki nesil sonra büyümeye sona erer. Bu noktada, tRNAselC indüksiyon Kültür Kültür farklılıkları küçük, ve tüm aliquots spike hücreler tek bir deney olarak bu iletişim kuralı için bir endişe değil MAS1074 aynı indüklenen kültüründen alınır. MAS1074 alternatif, hücre olan RNA hibridizasyon sonda ile cross-react değil bir organizmadan spike hücreler kullanılabilir. Sulfolobus solfataricus hücreleri başarıyla spike-in E. coli tRNA4ile deneyler için kullanılmaktadır. Olup aynı verimlilik ile S. solfataricus lyses belirsiz olduğu gibi Ancak, E. coli spike hücreler deneysel hücrelerinin hücre lizis derecesini daha doğru yansıtacak biçimde aşikardır E. coli. Ayrıca, S. solfataricus büyüyen bir oluşturma süresi ~ 16 h ile 85 ° C'de büyüdükçe daha yorucu olabilir.
Seçili tRNA özgüllük sağlanması
Aminoacylated ve deacylated tRNA başarıyla geçmişse arıtılmış iki grup Kuzey membran üzerinde tespit edilmelidir. İki grup arasındaki mesafe ve soruşturma altında belirli tRNA bağlı olarak farklı olacaktır boyutu, kutup özellikleri ve belirli bir amino asit özellikle tRNA5 bağlandığında ateşlenmesine uyum arasındaki fark, kombine bir sonucudur . Örneğin, aminoacylated ve deacylated arasındaki mesafe tRNA Şekil 2' de görüldüğü gibi daha tRNAgltTUVWiçin tRNAargVYZQ için büyüktür. Burada RNA ayırmak için kullanılan jel büyük boyutu sonucu olarak, çözünürlük şarj edilmiş tRNA doldurulmamış dan ayırt etmek için aynı zamanda birbirinden farklı tRNA uzunluğu, sıra aralarındaki farklılıkları nedeniyle çoğu ayırt etmek için yeterince yüksek olduğunu kompozisyon ve değişiklik desenler. Hatta isoaccepting tRNA tRNA2kabul lösin gösterildiği gibi ayırt edilebilir. Ancak, sıra fark sadece bir G T ikame için olduğu gibi bu çalışmada bu tRNAleuPQV tRNAleuT, ayırt etmek mümkün olmadı unutmayın.
Daha--dan iki grup Kuzey membran üzerinde görünüyorsa bu sonda ile diğer RNA'ların cross-reaction bir sonucu olabilir. Sıcaklık artırarak yıkama adım (adım 9.5) sıkılık artan genellikle bunu çözebiliriz. 30 dk 55 ° C'de yıkama genellikle yeterli olur. Yıkama sıkılık artan çapraz-hibridizasyon kaldırmaz tamamlayıcı tRNA dizisinin (genellikle kısmen üst üste gelen) farklı bir parçası yeni bir sonda tasarlamak için çözüm olabilir. Ek bantları-ebilmek da var olmak yeterli membran soyma bir sonucu olarak bir önceki sonda gelen etkilenmişimdir. Bunu önlemek için zar sondalama önce yeniden açarak bir Şerit denetimi yapın. Grup denetimi Ultrasonda görünür membran ek sıyırma gerekebilir. Genellikle bir membran en az 8 - 10 kez yeniden incelemek mümkündür ama sonra birkaç probları tamamen şerit zor olabilir. Bu durumda ise, membran 32P bozunmaları hızlı yeniden sondalama daha önce bir kaç ay depolanabilir.
Daha fazla sonda özgüllük doğrulanması elde edilebilir bir Kuzey gerçekleştirerek leke bir koşullar kümesi altında hasat hücreler nerede faiz transkript tahmin edilebilir bir şekilde etkilenmesi bekleniyor. Örneğin, plazmid veya soydaş amino asit, amino asit açlık gelen tRNA indüklenebilir ifade bir gelişmiş göreli ifade düzey veya daha düşük şarj düzeyi, sırasıyla, faiz tRNA ile sonuçlanmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Marit Warrer mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz. Bu eser bağımsız araştırma için Danimarka Konseyi tarafından desteklenmiştir | Doğa Bilimleri [1323-00343B] ve [DNRF120] Danimarka Ulusal Araştırma Vakfı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Urea | Merck | 57-13-6 | Purity >99% |
| Polyacrylamide | Serva | 79-06-7 | |
| Bis (N,N'-Methylene-bis-acrylamide) | BIO-RAD | 161-0201 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma | 76-03-9 | |
| Phenol | Merck | 108-95-2 | |
| IPTG | |||
| Glucose | |||
| Sodium Acetate | |||
| EDTA | |||
| Ethanol | |||
| Tris | |||
| Hydrochloric acid | |||
| Sodium Chloride | |||
| NaH2PO4 | |||
| Sodium Citrate | |||
| SDS | |||
| Herring Sperm DNA | Sigma | 100403-24-5 | |
| BSA | |||
| Polivinylpyrrolidone | |||
| Ficoll | |||
| P32 γATP | Perkin Elmer | ||
| DNA oligos (probes) | TAG Copenhagen | ||
| Hybond N+ membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
| Crosslinker | |||
| Electroblotter | BIO-RAD | ||
| Typhoon FLA 7000 Scanner | GE Healthcare | 28955809 | |
| Spectrophotometer | |||
| Hydridization oven | |||
| Geiger-Müller tube | |||
| Phosphor imager screen | GE Healthcare | ||
| Hybridization tube | |||
| Culture Flasks | |||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| 20 ml centrifuge tubes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| ImageQuant | GE Healthcare | ||
| Excel | Microsoft |
References
- Varshney, U., Lee, C. -P., RajBhandary, U. L. Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase. J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).
- Sorensen, M. A. Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy. J Mol Biol. 307 (3), 785-798 (2001).
- Krüger, M. K., Sørensen, M. A.
- Svenningsen, S. L., Kongstad, M., Stenum, T. S., Muñoz-Gómez, A. J., Sørensen, M. A. Transfer RNA is highly unstable during early amino acid starvation in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 45 (2), 793-804 (2017).
- Enriquez, J. A., Attardi, G. Evidence for aminoacylation-induced conformational changes in human mitochondrial tRNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (16), 8300-8305 (1996).
- Parker, J. Errors and alternatives in reading the universal genetic code. Microbiol Rev. 53 (3), 273-298 (1989).
- Traxler, M. F., et al. The global, ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli. Mol Microbiol. 68 (5), 1128-1148 (2008).
- Zhong, J., et al. Transfer RNAs Mediate the Rapid Adaptation of Escherichia coli to Oxidative Stress. PLoS Genet. 11 (6), e1005302 (2015).
- Kane, J. F. Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol. 6 (5), 494-500 (1995).
- Baca, A. M., Hol, W. G. Overcoming codon bias: a method for high-level overexpression of Plasmodium and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli. Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).
- Li, S., Pelka, H., Schulman, L. The anticodon and discriminator base are important for aminoacylation of Escherichia coli tRNA (Asn). J Biol Chem. 268 (24), 18335-18339 (1993).
- Rizzino, A. A., Freundlich, M. Estimation of in vivo aminoacylation by periodate oxidation: tRNA alterations and iodate inhibition. Anal Biochem. 66 (2), 446-449 (1975).
- Dittmar, K. A., Sorensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation. EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).
- Zhou, K., et al. Novel reference genes for quantifying transcriptional responses of Escherichia coli to protein overexpression by quantitative PCR. BMC Mol Biol. 12 (1), 18 (2011).
- Jacobson, A., Gillespie, D. Metabolic events occurring during recovery from prolonged glucose starvation in Escherichia coli. J Bacteriol. 95 (3), 1030-1039 (1968).
- McCarthy, B. The effects of magnesium starvation on the ribosome content of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta (BBA)-Specialized Section on Nucleic Acids and Related Subjects. 55 (6), 880-889 (1962).
- Zundel, M. A., Basturea, G. N., Deutscher, M. P. Initiation of ribosome degradation during starvation in Escherichia coli. Rna. 15 (5), 977-983 (2009).
- Piir, K., Paier, A., Liiv, A., Tenson, T., Maivali, U. Ribosome degradation in growing bacteria. EMBO Rep. 12 (5), 458-462 (2011).
- Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced grown of Salmonella typhimurium. J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).
- Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F.
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold spring harbor laboratory press. (1989).
- Sorensen, M. A., Jensen, K. F., Pedersen, S. High concentrations of ppGpp decrease the RNA chain growth rate. Implications for protein synthesis and translational fidelity during amino acid starvation in Escherichia coli. J Mol Biol. 236 (2), 441-454 (1994).
- Tian, C., et al. Rapid Curtailing of the Stringent Response by Toxin-Antitoxin Module-Encoded mRNases. J Bacteriol. 198 (14), 1918-1926 (2016).
