Summary
Aqui nós apresentamos um método para medir diretamente o RNA de transferência, níveis de carga de purificado Escherichia coli RNA, bem como uma maneira de comparar os níveis relativos do RNA de transferência, ou qualquer outro RNA curto, entre diferentes amostras baseadas na adição de pico-no células expressando um gene de referência.
Abstract
RNA de transferência (tRNA) é uma parte essencial da maquinaria translacional em qualquer organismo. os tRNAs bind e transferir os aminoácidos para o ribossoma traduzir. Os níveis relativos de tRNAs diferentes e a relação de aminoacylated tRNA para total tRNA, conhecido como o nível de carga, são fatores importantes na determinação da precisão e velocidade de tradução. Portanto, a abundância e níveis de carga dos tRNAs são variáveis importantes para medir quando estudar a síntese de proteínas, por exemplo, sob diferentes condições de estresse. Aqui, descrevemos um método para a colheita de tRNA e medição diretamente tanto a abundância relativa e o nível de carregamento absoluto de espécies específicas de tRNA em Escherichia coli. O tRNA é colhida de forma que o laço lábil entre o tRNA e o aminoácido é preservado. O RNA é então submetido a electroforese do gel e do Norte, mancha, que resulta em separação entre os tRNAs carregado e descarregado. Os níveis de tRNAs específico em amostras diferentes podem ser comparados devido à adição de pico-em células para normalização. Antes da purificação de RNA, adicionar 5% de células de Escherichia coli que overproduce o tRNA raroselC para cada amostra. A quantidade de espécies de interesse em uma amostra de tRNA então é normalizada para a quantidade de tRNAselC na mesma amostra. Adição de pico-em células antes da purificação de RNA tem a vantagem sobre a adição de purificado spike-em RNAs que é também responsável por eventuais diferenças de eficiência de lise celular entre as amostras.
Introduction
A seguir, apresentamos um método para quantificar os tRNAs específicas e níveis de medição de sua carga pela mancha do Norte. O método é baseado em uma técnica desenvolvida por Vieira et al . 1. colheita de células em ácido tricloroacético (TCA) e mantendo as amostras a 0 ° C em toda a purificação de RNA, a ligação éster entre o tRNA e o aminoácido é conservada2,3,4. TRNAs Aminoacylated distingue suas contrapartes nonacylated por eletroforese em gel e mancha do Norte, devido a uma diminuição da mobilidade do aminoacylated tRNA no gel, causado por aminoácido covalentemente ligados5. Além disso, apresentamos um protocolo para normalizar as quantidades de tRNA por adição de pico-em células superexpressão do usados raramente tRNAselC 4.
os tRNAs são algumas das moléculas mais abundantes na célula bacteriana e uma parte absolutamente vital da maquinaria de tradução. os tRNAs vincular aminoácidos e transferi-los para os traduzir ribossomas. A ligação dos aminoácidos para tRNAs (aminoacylation ou carregamento) é facilitada pela aminoacil sintetases de tRNA. A abundância relativa de diferentes tRNAs carregada é importante para garantir a fidelidade da síntese de proteínas, porque sub-representação do cognato acusado que tRNA para um codão de determinado RNA mensageiro (mRNA) aumenta a probabilidade de que um tRNA perto-cognato serão erroneamente entrega seu aminoácido à cadeia de polipeptídeo crescente no Ribossoma6. A importância do tRNA carregada é refletida na extensa resposta da célula de e. coli para uma severa queda nos níveis de carregamento de um tRNA; a resposta rigorosa. Durante a resposta rigorosa a síntese dos tRNAs, RNAs ribossomal e maioria dos mRNAs é abaixada em favor de transcrição de mRNAs específicos associados a sobrevivência de biossíntese e estresse de aminoácido, e a taxa de crescimento das células é reduzida drasticamente7 . Além disso, o recente trabalho de nos revelou que a Escherichia coli ativamente degrada a maioria dos seus tRNA em resposta ao estresse que limitam a tradução4,8, sugerindo que o ajuste dos níveis de tRNA pode ser importante para lidar com tais tensões. Assim, medições correctas de abundâncias de tRNA e níveis de carregamento será uma ferramenta importante para compreender plenamente a respostas bacterianas do stress.
Escherichia coli é comumente usado para expressar a proteína recombinante e devido às diferenças no uso do códon entre espécies, expressão de qualidade inferior é um problema muitas vezes enfrentado9. Isto pode ser contornado pela expressão de tRNAs adicionais necessários para traduzir o mRNA recombinante10. Medições do tRNA níveis em tais cepas de carregamento poderiam orientar os esforços de solução de problemas e ajudar a aperfeiçoar a expressão de proteínas.
Este método também permite a detecção de "mischarging"; um aminoacylated da molécula de tRNA com um aminoácido não-cognato. Aminoacylation por aminoácidos diferentes pode causar um tRNA migrar com velocidades ligeiramente diferentes através de géis de poliacrilamida1,11. Em alguns casos, o método também pode ser usado para distinguir padrões diferentes de modificação em idênticas tRNAs3.
Outro estabelecido procedimento bioquímico para a investigação do tRNA níveis de carregamento é periodato de oxidação. O método baseia-se na observação de que a aminoacylated-tRNA é protegido de periodato de oxidação e tRNA descarregado não é. Depois periodato tratamento de oxidação a recarga do tRNA é usada para estimar os níveis de carga do RNA colhido. No entanto, a recarga de vários tRNAs foi mostrado para ser afetado pelo tratamento proporcionando alguma imprecisão12. O método apresentado aqui medidas de carregamento diretamente do RNA purificado, excluindo assim qualquer preconceitos de reações químicas ou enzimáticas. Uma limitação deste método é que apenas uma espécie de tRNA é detectado em um momento, então, embora a mesma Northern blot pode ser descascado e reprobed de vários tRNAs, é demorado e um tanto trabalhoso coletar dados sobre muitos tRNAs.
Uma maneira confiável de normalizar as amostras para o outro é vital em estudos onde o objetivo é comparar os níveis relativos de uma molécula através de amostras diferentes. Aqui apresentamos um procedimento de normalização para o RNA, onde uma pequena alíquota de células de Escherichia coli superexpressão do tRNA raroselC é adicionada como um pico em que todas as amostras experimentais antes da purificação de RNA. Este método é útil não só ao examinar os tRNAs mas para quantificação relativa de qualquer espécie de RNA quando a instalação experimental é tal que nenhum RNA endógena pode ser confiável para ser apresenta na mesma concentração celular em todas as amostras. Por exemplo, o nível de um "housekeeping" como RNA ribossómico (ARNR) muitas vezes é usado como uma referência endógena para comparar as quantidades relativas de outro RNA entre diferentes amostras de13. Mas isso é de pouca utilidade se a concentração celular do RNA referência varia entre amostras, como pode ser o caso para o RNA ribossômico se amostragem ocorre durante um esforço resposta15,16,17 ou durante entrada em fase estacionária17. A adição de pico-em células com as amostras experimentais antes da purificação de RNA fornece uma forma sólida e precisa de normalização independente da instalação do amostragem. Outra forma de padronização é a adição de um ou mais pico-em RNAs para as amostras experimentais após a purificação de RNA. No entanto, este método não leva em conta diferenças eventuais na recuperação de RNA entre as amostras.
Usando células de Escherichia coli que overexpress a referência de RNA como spike-em células (ver Figura 1) em um experimento em e. coli tem a desvantagem de que resulta além de uma pequena quantidade de exógenos Escherichia coli total RNA para a amostras. Podemos corrigir para este acréscimo através da análise de uma amostra contendo somente spike-em células em paralelo com as amostras experimentais (ver o norte borre na pista Figura 2, , rotulada "selC"). O protocolo apresentado é desenvolvido para Escherichia coli K-12, mas é provável que seja aplicável para a maioria das espécies bacterianas.
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Protocol
1. preparação de culturas bacterianas.
- Crescer todas as culturas em Erlenmeyers com uma relação de volume de cultura/frasco no máximo 1/6. Em uma instalação experimental típica, crescem as culturas a 37,0 ° C e agitando a 160 rpm em morpholinepropanesulfonic ácido (MOPS) mínimo médio 18 suplementado com a fonte de carbono preferencial, por exemplo glicose 0,2%, pelo menos 10 gerações consecutivas antes da colheita do RNA.
- o dia antes da colheita de RNA, diluir uma cultura Superdimensonada da estirpe desejada em meio mínimo ESPANADORES de tal forma que vai chegar a desejada OD 436 no momento desejado no dia seguinte. Calcular o volume de cultura Superdimensonada usar para inoculação pela fórmula:
Nota: aqui, OD novo denota o desejado OD 436 após a incubação, V nova denota o volume da cultura diluído, OD velho denota o OD 436 da cultura Superdimensonada diluída de, G denota o número de gerações a cultura vai crescer, desde o tempo de diluição (t 1) que o tempo que é necessário no dia seguinte (t 2) e pode ser calculada como: tempo de diferença (em min) entre t 1 e t 2 dividido pelo tempo de geração (em min). Para garantir o crescimento de estado estacionário, no momento da amostragem, G deve ser ≥ 10; V velho denota o volume da cultura out-adulto que deve ser transferido para o meio fresco. Esta equação é uma aproximação que não leva em conta para qualquer fase de retardo; um fenômeno que frequentemente observado após a diluição de uma cultura de out-crescida na mídia fresca.- Condições de crescimento irá variar dependendo da finalidade do experimento, mas para limitar a variação de célula para célula em níveis de tRNA e aumentar a reprodutibilidade dos resultados, (recomendado) crescem as culturas para firmar o estado antes da amostragem 19.
2. Preparação de pico-em células
Nota: A cepa de Escherichia coli MAS1074, que expressa o gene selC codificação tRNA selC sob o controle de um isopropílico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)- promotor inducible é usado como a tensão de pico-no.
- Dilua uma cultura Superdimensonada de MAS1074 para um OD 436 de 0,05 em MOPS mínimo suplementado com 100 µ g/mL ampicilina e 0,2% de glicose. Crescer a cultura a 37 ° C, agitando a 160 rpm.
Nota: Veja a discussão para o uso de uma estirpe de referência alternativo. - Em OD 436 ~ 0.1, adicionar IPTG para uma concentração final de 1 mM para induzir a expressão de tRNA selC. Crescer a cultura para OD 436 ~0.5 (~ 3-4 h de crescimento) e mover o frasco de cultura para um banho de gelo. Manter a cultura de pico-na célula no gelo até que todas as amostras para a purificação de RNA foram colhidas.
3. Colheita das amostras experimentais.
- Pre-quente (37 ° C), um tampado Erlenmeyer de 100 mL (ou similar) contendo 4 mL 10% (p/v) o ácido tricloroacético (TCA) para cada amostra, colocando-o em um banho de água aquecida.
Nota: cuidado, TCA decompõe-se em cima de aquecimento, produzindo fumos tóxicos e corrosivos, incluindo cloreto de hidrogênio e clorofórmio. A solução em água é um ácido forte; Ele reage violentamente com bases e é corrosivo para muitos metais. Devem ser tomadas precauções adequada quando usando esse líquido. - Imediatamente antes da colheita da pilha, medir e registrar o OD 436 da cultura.
- Para colher as células, transferir 4 mL da cultura para um frasco previamente aquecido contendo TCA.
- Misturar a amostra agitando o balão com a mão para s. 5 mistura com o TCA imediatamente desativa actividades enzimáticas tudo e, assim, preserva os níveis de carga dos tRNAs.
Nota: Se várias amostras devem ser recolhidos, manter a amostras colhidas no TCA no gelo até que todas as amostras foram coletadas.
4. Adição de pico-em células
Nota: preparação de pico-em células é descrita na etapa 2.
- Quando todos amostras para preparação do RNA foram coletado, adicionar 5% pico-em células (baseadas no OD) para cada amostra.
Nota: O volume de pico-na célula cultura necessária é calculado pela fórmula:
onde V pico denota o volume da cultura de pilha de pico-no necessário, V exp denota o volume da cultura de células experimentais colhidos (sem TCA), OD exp denota o OD 436 da cultura de pilha experimental no momento da colheita no TCA. OD spike denota o OD 436 da cultura pico-na célula. Se múltiplas amostras são colhidas em diferentes ODs, o volume de pico em células adicionado deve ser ajustado de acordo com a fórmula acima para cada amostra. - Para quantificar a contribuição da espiga-em células para as espécies de RNA de interesse, preparar uma amostra contendo somente spike-em células misturando 4ml spike-em células com 4 mL TCA. Preparar RNA a partir desta amostra da mesma forma como para as outras amostras.
- , Opcionalmente, tomar outro frasco contendo apenas a amostra experimental, sem pico-em células e incluí-lo para quantificar a contribuição da amostra experimental para o tRNA selC níveis; os níveis endógenos de tRNA selC em Escherichia coli K-12 são insignificante baixo.
5. Preparação do RNA
Nota: protocolo de preparação do RNA o descrito aqui é essencialmente descrito por Vieira et al. 1; Para evitar o deacylation do aminoacylated os tRNAs durante a purificação é importante manter as amostras em pH ácido e a 0 ° C ao longo do curso da purificação. Use tubos/frascos estéreis limpo para manter as amostras e as soluções e preparar todas as soluções com ultrapura (18,2 MΩ·cm resistividade) água.
- Pour 8 mL de cada amostra para um tubo de centrifugação refrigerada de gelo. Centrifugar as amostras por 10 min a 9.500 x g a 4 ° C. completamente remover sobrenadante e ressuspender em 0,3 mL frio 0,3 M de acetato de sódio, pH 4,5 e 10 mM de EDTA.
- Transferir cada amostra para um tubo de microcentrifugadora frio 1,5 mL e adicionar fenol 0,3 mL solução equilibrada com a mesma reserva.
Nota: cuidado, fenol produz gases tóxicos e é altamente corrosivo para a pele. - Vortex cada amostra 10 x 15 s pelo menos 1 min entre cada vórtice. Num Vortex manter as amostras em 0 ° C. usar as pausas frequentes para assegurar que as amostras de mantenham-se frio.
- Amostras de centrifugar por 15 min a 20.000 x g a 4 ° C. transferência a fase água (fase superior) para Nova microcentrifuga de 1,5 mL de tubos. Adicionar 0,3 mL frio fenol e vórtice 4 x 15 s como antes.
- Centrifugação por 10min a 20.000 x g a 4 ° C. transferência a fase de água de novo, frio 1,5 mL microcentrifuge tubos contendo 2,5 vezes o volume de etanol a 96% (~ 750 µ l). Precipitar o RNA incubando os tubos por 1h a-20 ° C, ou durante a noite a -80 ° C.
- Amostras de centrifugação por 30 min a 20.000 x g a 4 ° C. descartar o sobrenadante e cuidadosamente, adicionar 1 mL de etanol a 70% frio sem perturbar a pelota do RNA. Inverta suavemente uma vez para lavar o interior dos tubos com etanol.
Nota: O sedimento pode ser difícil ver neste passo. - Centrifugação por 10min a 20.000 x g a 4 ° C. completamente remover o sobrenadante e deixe secar naturalmente a pelota até não sobrar nenhuma etanol. Resuspenda o pellet vortexing vigorosamente em 20 µ l 10mm frio de sódio acetato pH 4.5 e 1 mM EDTA.
Nota: Não seque em demasiado a pelota como ele se tornará difícil ressuspender. - , Opcionalmente, avaliar a concentração de RNA medindo a absorbância em 260 nm.
- , Opcionalmente, avaliar a qualidade do RNA purificado através de de eletroforese de gel de agarose 20.
- Amostras de loja a -80 ° C.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
Nota: para distinguir a banda de aminoacylated tRNA de sua contraparte deacylated na Northern blot, um quimicamente deacylated alíquota é preparado pelo tratamento alcalino. Para a maioria dos fins, é suficiente para deacylate uma única amostra para cada borrão do Norte.
Amostra de- thaw o RNA no gelo. Transfira uma alíquota de 4 µ l da amostra do RNA para um tubo novo. Adicione pH de Tris-HCl µ l 46 9.0. Incubar durante 2 h a 37 ° C.
- Adicionar 15 µ l de acetato de sódio 0,3 M, pH 4,5 e posteriormente Adicionar 125 µ l de etanol a 96%. Precipitar o RNA a-20 ° C durante 1 h.
- Centrífuga por 30 min a 20.000 x g a 4 ° C. completamente remover o sobrenadante e ressuspender em 4 µ l 10mm frio de sódio acetato pH 4,5 e 1 mM EDTA.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui, se a amostra é armazenada a -80 ° C.
7. Gel eletroforese e mancha do Norte
- Mix 4 µ l de amostra (não tratada ou quimicamente deacylated) com amortecedor do carregamento 6 µ l (0,1 M de acetato de sódio (pH 5.0), 8m ureia, 0,05% de azul de bromofenol e 0.05% xileno cianol).
Nota: Lembre-se de incluir a amostra contendo apenas spike-em células, o quimicamente deacylated amostra (e a amostra sem espiga-em células, se um estava preparado). - Carregar as amostras em 0,4 mm espessura 6,5% gel de poliacrilamida (acrylam 19:1 - ide:bisacrylamide) que contém ureia 8 M em tampão de acetato de sódio 0,1 M (pH 5.0). Usar géis longa de 60 cm para a adequada separação de espécies de tRNA.
- Separado do RNA por eletroforese em gel de 10 V/cm a 4 ° C, até o azul de bromofenol atinge o fundo do gel (~ 20 h). Tintura de
- a área da tintura xileno cianol e 20 cm para baixo para o azul de bromofenol é usada para a mancha (a distância entre os dois corantes deve ser 25-30 cm). Separe as placas de vidro de dois, com cuidado para que o gel permanece em um deles. Um pedaço de papel de filtro fino é cortado para o tamanho da área de mancha desejada e colocado em cima da parte do gel que será usado para a mancha. As peças do gel que não são cobertas por papel de filtro são cortadas e descartadas. Use o filtro de papel para levantar cuidadosamente o pedaço de gel de longe a placa de vidro.
Nota: O gel grande é muito frágil para segurar com cuidado. - Uma membrana de nylon positivamente carregado (por exemplo, membrana Hybond N +) é colocada no topo do gel e é electroblotted a 20 V para 90 min com 40 mM Tris-Acetato (pH 8.1), 2 mM EDTA como buffer de transferência.
- Crosslink o RNA para a membrana usando luz UV (0.12 J/cm 2).
Nota: A membrana agora pode ser armazenada à temperatura ambiente e o protocolo pode ser pausado aqui.
8. Projeto e verificação de sondas
Nota: cuidado de projeto e verificação das sondas de borrão do Norte é crucial para obter resultados fiáveis e evitar indesejável Cruz-hibridação com outras espécies de RNA.
- Uso curtos oligonucleotides sintéticos como sondas. Desenha a sequência de sonda, de forma que é complementar à parte mais original da sequência do tRNA de interesse - muitas vezes é o loop anticodão.
Nota: Uma lista de sequências de tRNA previsto de vários organismos pode ser encontrada no tRNA Genomic Database (GtRNAdb) 21. - Ajuste o comprimento da sequência para obter uma previsão de fusão temperatura de 55-65 ° C.
- BLAST (básico Local Alignment Search Tool) o escolhido sequenciar contra a sequência do genoma da cepa bacteriana utilizada no experimento, para verificar se a sequência é exclusiva para o tRNA selecionados, conforme descrito em 22.
Nota: A tabela 1 lista sonda sugeridas sequências de vários tRNAs diferentes de e. coli K12. Se a sonda é específica para o tRNA de interesse, apenas duas bandas são visíveis na Northern blot (carregado e descarregado tRNA) e somente uma faixa é visível na pista com a amostra deacylated (tRNA descarregado). Se mais de duas bandas estão presentes, ou se mais validação da especificidade da sonda é desejada, ver discussão.
9. Hibridação do borrão do Norte
Nota: nas etapas a seguir, a membrana é sequencialmente hibridizada com sondas complementares para os tRNAs específico desejado, incluindo uma sonda específica para a referência de tRNA selC.
- Colocar a membrana em um tubo de hibridização e adicionar 6 mL de solução de hibridação (0.9 M NaCl, 0,05 M NaH 2 PO 4 (pH 7,7), 5 mM EDTA, 0,5% (p/v) SDS, 100 mg/mL de distorcido e desnaturado DNA de esperma de arenque e 5 x Denhardt ' s solução (100 x Denhardt ' solução s = 2% albumina de soro bovino, 2% e 2% polivinilpirrolidona 40 Ficoll)).
- Pre-cruzar a membrana no buffer para 1h rodar a sonda de 42 ° C. Adicionar 30 pmol radioativo oligo-DNA 5 ' - final - rotulado com 32 P (preparado como descrito por Sambrook et al. 23)
Nota: cuidado, as emissões de alta energia beta de 32 P podem apresentar uma pele substancial e risco de dose de olho. Precaução adequada deve ser tomada quando usar 32 P. Radioactive resíduos deve ser eliminado de acordo com os protocolos de segurança institucionais adequadas. - Incubar a sonda com a membrana de giro durante a noite no 42 ° C. remover a sonda com uma pipeta descartável 10ml.
Nota: Se armazenado em um freezer a sonda pode ser reutilizada. - No tubo de hibridização, lave a membrana logo em 50 mL de 0,3 M NaCl, citrato de sódio de 30 mM, SDS 0,1% (p/v) à temperatura ambiente.
Nota: Esta primeira lavagem contém muito desvinculado da sonda e devem ser tratada como altamente radioactivos. - Repeat passo 9.4 uma vez e, em seguida, move a membrana para um recipiente de plástico liso ou bandeja incluindo uma tampa. Cobrir a membrana com a solução de lavagem (0,3 M NaCl, 30mm citrato de sódio, 0,1% (p/v) SDS) e ele incube durante 30 min à temperatura ambiente.
- Alterar a solução de lavagem e continue a lavar até um sinal / ruído satisfatório foi obtido (geralmente 3-4 alterações de solução de lavagem). Use um tubo de Geiger-Müller para detectar como o barulho de relação sinal muda medindo a radiação de uma área vazia da membrana e compará-lo com a área onde a sonda tem hibridizado especificamente para tRNA.
- a fim de ser capaz de retirar a sonda da membrana após a exposição, certifique-se que (importante) a membrana não secar antes do processo de descascamento. Coloca a membrana em um saco plástico fino ou envoltório firmemente usando plástico enrole e selá-lo para ser hermético por soldadura ou fita. Coloque a membrana selada em uma tela de phosphorimaging.
Nota: O tempo de exposição exigido na tela de phosphorimaging é determinada pela atividade específica da sonda, a quantidade de RNA sondou for e a eficiência de hibridização da sonda e pode variam muito; de alguns minutos a vários dias. Com a experiência, a intensidade da radiação detectada na membrana com o tubo de Geiger-Müller dá uma indicação boa parte do tempo de exposição necessário. Para a quantificação confiável, é importante que a tela não é superexposta. - Scan phosphorimaging tela usando um scanner a laser e salve o arquivo em " .gel " formato.
Nota: Um sinal elevado à relação de ruído é necessário para a quantificação confiável. Sondagem para um tRNA deve resultar em duas bandas; aminoacylated contendo um tRNA (migração mais lenta) e deacylated contendo um tRNA (migração mais rápida). Consulte a Figura 2.
10. Descascamento da membrana
Nota: antes da membrana pode ser vasculhados a procura de um outro tRNA, a sonda anterior primeiro deve ser removida pelo descascamento da membrana.
- Calor suficiente descascamento buffer (15 mM NaCl, 1,5 mM citrato de sódio, 0,1% (p/v) SDS) para cobrir a membrana e despeje-o sobre a membrana. -Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente.
- Repita o passo 10.1 até nenhuma radiação pode ser detectado com um tubo de Geiger-Müller; a membrana pode agora ser re-hibridizada seguindo as etapas descritas na seção 9.
11. Quantificar o tRNA e níveis de carregamento
software de- carregar o arquivo .gel para a imagem (consulte a Tabela de materiais). Desenhar uma linha vertical ao longo de cada uma das pistas amostra de tal forma que abrange a maioria da largura da faixa, mas exclui as bordas das bandas onde o sinal pode ser desigual, como mostrado na Figura 3A.
- Visualize conta de cada raia clicando " análise "-> " criar gráfico ". Definir manualmente os dois picos que representa a carga e o tRNA descarregado de cada raia, conforme mostrado na Figura 3B.
- Obter a contagem de cada pico clicando " análise "-> " relatório de área " e gravar a área sob cada um dos dois picos.
- Quando o blot tem sido vasculhados a procura de tRNA selC e pelo menos um tRNA de interesse, normalizar os níveis do tRNA de interesse para tRNA selC.
- Calcular a proporção de tRNA provenientes da espiga-em células em cada pista e subtrair o total de sinal em lane usando a equação:
Nota: aqui, Amostra de tRNA = o sinal obtido de uma única faixa de uma membrana sondada para o tRNA desejado; Amostra selC = o sinal obtido a partir da mesma pista da mesma membrana vasculhados a procura de tRNA selC; Ref tRNA = o sinal obtido a partir da pista contendo RNA só espiga-na célula da mesma membrana sondada para o tRNA desejado; Ref selC = o sinal obtido a partir da pista contendo RNA só espiga-na célula da mesma membrana vasculhados a procura de tRNA selC. - Para normalizar, divida o valor corrigido do tRNA de cada raia pelo sinal selC tRNA do pista mesmo.
Nota: A contribuição para o sinal da selC tRNA de células amostradas é negligenciável (consulte a Figura 2, lane rotulado "-selC ").
- Calcular a proporção de tRNA provenientes da espiga-em células em cada pista e subtrair o total de sinal em lane usando a equação:
- Calcular o tRNA carregamento de nível para cada pista dividindo-se o sinal do pico representando tRNA carregada com a soma do sinal de dois picos (carregada + descarregado).
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Representative Results
Usar o procedimento descrito aqui, a abundância e cobrando os níveis dos três tRNAs foram medidos em Escherichia coli K-12 antes e durante a fome de aminoácidos.
O auxotroph de arginina estirpe NF9154 (thr leu sua argH thi mtl supE44) foi cultivada pelo menos dez gerações em MOPS mínimo suplementado com 0,4% de glicerol, 50 treonina µ g/mL, leucina, arginina e histidina 5 µ g/mL a 37 ° C, no 160 rpm. Fome de arginina foi introduzido por filtração da cultura e da ressuspensão em meio de MOPS fresco como acima, mas sem arginina. Durante a fome de arginina, síntese de proteínas é fortemente reduzido, mas continua em um nível baixo usando arginina lançada pelo volume de negócios de proteínas existentes. As amostras foram colhidas no momento pontos indicaram na Figura 4. Depois que todas as amostras foram colhidas em TCA, 5% das MAS1074 espiga-em células superexpressão tRNAselC, foi adicionado para cada amostra, conforme ilustrado no Figura 1. RNA foi purificado a partir das amostras, separado por eletroforese e destruído em uma membrana como descrito no protocolo. A membrana foi sondada para tRNAargVYZQ, tRNAgltTUVW, tRNAhisRe tRNAselC, como visto na Figura 2. O sinal de radiação de cada raia foi quantificado para cada uma das quatro sondas como ilustrado na Figura 3e corrigido e normalizado, conforme descrito na seção 11. Os resultados são apresentados na Figura 4. A figura 4A mostra que os níveis de todas as espécies testadas do tRNA diminuem rapidamente durante a fome de aminoácidos, como relatado recentemente4. Figura 4B mostra que o tRNA carregamento níveis se comportar conforme o esperado: a fração carregada do tRNA arginina-aceitando cai rapidamente após a remoção da arginina do meio de crescimento, Considerando que os níveis de carga de outros tRNAs a aumentam ligeiramente em cima fome porque acusado tRNAs se acumulam quando sua taxa de decharging para os ribossomas diminui devido à falta de substrato para a síntese de proteínas4. Ainda mais o período de fome, a fração de tRNA carregada diminui para níveis de aproximadamente pre-fome devido à degradação da maioria da piscina tRNA (Figura 4A), que resulta em uma maior taxa de decharging dos tRNAs restantes no Os ribossomas. Por outro lado, a fração carregada de tRNAargVYZQ aumenta pelo menos duas razões; 1) a ativação da resposta rigorosa significa que o mRNA, não cobrado tRNAarg, torna-se o fator limitante para a tradução e 2) o pool total de tRNAarg é reduzida (Figura 4A), então uma fração maior do tRNA totalarg pode ser carregada pela mesma pequena quantidade de arginina. Este experimento demonstra como as medições simultâneas de abundância de tRNA e níveis de carga de tRNA fornece informação de qualidade sobre as condições para a síntese de proteínas dentro da célula.
Figura 1. Adição de pico-em células para amostras. Neste exemplo, amostras de uma única cultura de Escherichia coli NF915 são colhidas em uma série de tempo antes e durante a fome de aminoácidos. É mostrado um diagrama esquemático da curva de crescimento de NF915, onde os pontos azuis indicam os pontos de colheita de amostra. Os y-Axes são escala logarítmica. Amostras do ficam experimental são colhidas conforme descrito na seção 3. Também é mostrado um diagrama esquemático da curva de crescimento da tensão pico-em MAS1074, com o ponto de colheita de amostra, indicado como um ponto azul. O ponto da figura é para ilustrar que todas as amostras experimentais (de e. coli NF915 neste exemplo) recebem uma parte alíquota do pico-em células da mesma cultura de referência. Para cada amostra, 5% de aumento-em células são adicionados às células experimentais, calculadas baseado do OD das culturas de célula (ver secção 4). Posteriormente, RNA é purificado de todas as amostras e utilizado para os borrões do Norte. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Varredura de Imageador de fósforo de um borrão do Norte analisados os tRNAs indicado. A membrana contém RNA da estirpe Escherichia coli NF915 colhidas nos pontos de tempo indicado antes e após a indução de fome de arginina (minutos). Além disso, a membrana contém duas faixas de amostras onde spike-em células foram omitidas (-selC DA e - selC), e uma faixa contendo RNA de pico-a células única (selC). -SelC DA amostra contém quimicamente deacylated tRNA. As duas bandas representando as espécies carregadas e descarregadas do tRNA são claramente separadas. Nota o sinal negligenciável do tRNAselC na faixa adicionado sem espiga-em células. Na mesma membrana foi sucessivamente despojada e reprobed para os tRNAs indicado à esquerda. Área de box no blot superior indica a parte do blot, que é mostrado para as sondagens subsequentes do tRNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Quantificação do Northern blot. abundância de tRNA é medida utilizando o software. (A), A única faixa de Northern blot visto na Figura 2 vasculhados a procura de tRNAargVYZQ. A seta superior e inferior para indicar o aminoacylated tRNA e a deacylated-tRNA, respectivamente. As linhas vermelhas em paralelo com a lane são adicionadas e usadas para definir a área para quantificação. (B) quantificação do sinal dentro de duas linhas quebradas vermelhas visto em (A) retratado como um gráfico, onde o eixo horizontal indica a distância do topo da linha no (A) (em pixels), e o eixo vertical mostra a intensidade do sinal (em contagem). Os dois picos contendo sinal originário de aminoacylated o tRNA e o deacylated tRNA, respectivamente, são definidas manualmente. Os dados que são exportados para uma análise mais adicional são o valor correspondente à área sob cada um dos dois picos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Resultado representativo: quantificação de abundâncias de tRNA de umd níveis de carregamento durante a fome de arginina. Quantificação das bandas sobre o borrão do Norte mostrado na Figura 2. (A), a relativa abundância de tRNAgltTUVW (vermelho), tRNAargVYZQ (azul) e tRNAhisR (verde). O nível encontrado no zero minutos (amostras colhidas antes do início da fome) é definido como 1. (B) nível dos três tRNAs mesmo como em (A) de carga. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Especificidade de sonda | Sequência de sonda |
| tRNAargVYZQ | 5'-TCCGACCGCTCGGTTCGTAGC |
| tRNAgluTUVW | 5'-CCTGTTACCGCCGTGAAAGGG |
| tRNAhisR | 5'-CACGACAACTGGAATCACAATCC |
| tRNAleuPQVT | 5'-GTAAGGACACTAACACCTGAAGC |
| tRNAleuU | 5'-TATTGGGCACTACCACCTCAAGG |
| tRNAleuW | 5'-CTTGCGGCGCCAGAACCTAAATC |
| tRNAleuX | 5'-TATTTCTACGGTTGATTTTGAA |
| tRNAleuZ | 5'-AAAATCCCTCGGCGTTCGCGCT |
| tRNAlysQTVWYZ | 5'-TGCGACCAATTGATTAAAAGTCAAC |
| tRNAthrV | 5'-TGGGGACCTCACCCTTACCAA |
| tRNAtyrTV | 5'-TCGAACCTTCGAAGTCGATGA |
| tRNAselC | 5'-ATTTGAAGTCCAGCCGCC |
Tabela 1. Tabela de sequências de sonda sugerido para tRNAs selecionado em Escherichia coli K-12.
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Discussion
Este protocolo descreve como simultaneamente, medir o nível de carga de específico de e. coli tRNAs e comparar os níveis relativos dos tRNAs em amostras diferentes. Os pontos críticos do protocolo são 1) para manipular as amostras de tal forma que os níveis de carga celular tRNA são retidos, 2) para normalizar as quantidades de tRNA de tal forma que níveis de tRNA relativo em amostras diferentes podem ser comparados confiantemente e 3) para garantir a sp ecificity dos testes selecionados para os tRNAs de interesse. Estes pontos são abordados separadamente abaixo.
purificação de tRNA
Os tRNAs são purificados de e. coli , de uma forma suave que é otimizada para manter seus níveis de carga celulares. É nossa experiência que este protocolo extrai principalmente RNAs inferiores a 150 nt, tRNA constitui uma grande fração do RNA purificado. Por esta razão, não se recomenda usar este protocolo para purificar o RNA total de e. coli. O protocolo apresentado aqui também deve ser adequado para detecção e quantificação de outros RNAs como pequeno RNA (sRNA) sem quaisquer adaptações adicionais. Porque o protocolo de extração de RNA enriquece para sequências curtas de RNA também deve encontrar uso mesmo se a sRNA sob investigação humilde é expresso.
Normalização por pico-em células
Para comparar os níveis do tRNA através de amostras diferentes, é necessário normalizar os níveis de tRNA aos níveis de uma transcrição que está presente no mesmo número médio por célula em todas as amostras, a fim de corrigir as variações de amostra-de-amostra de RNA recuperação e gel de carregamento. Para esta finalidade, nós spike as amostras com 5% de células de referência que overexpress o tRNA raroselC antes da purificação de RNA. O espigão-no método é preferível sobre usando um RNA endógeno como referência, porque permite a comparação dos níveis de tRNA em condições onde não RNAs endógenos são conhecidos com certeza para ser encontrado na mesma concentração celular. Usando células de Escherichia coli como a espiga tem a desvantagem que 5% extra de e. coli RNA é adicionado a todas as amostras experimentais, que onde contribui para o sinal do RNA de interesse. Este preconceito é contabilizado pelo incluindo uma amostra contendo apenas as espigão-em células em cada borrão do Norte e corrigindo os valores de RNA, conforme descrito na etapa 11.4.1. A expressão do tRNAselC em células de tipo selvagem é tão baixo comparado com outros tRNAs (ver Figura 2) que ele não faz uma diferença significativa na quantificação e, portanto, pode ser negligenciada. No entanto, a tensão de referência MAS1074, onde selC é expressa por um promotor de7 T em um plasmídeo alta cópia, nós estimamos que pelo menos 1,000-fold mais tRNAselC é produzido na presença de 1 mM IPTG do que o produzido por sua E. Coli K-12 sob qualquer condição. MAS1074 deixa de crescer após duas gerações de indução de IPTG completa. Nesse ponto, as diferenças de cultura-de-cultura na indução de tRNAselC são pequenas, e não uma preocupação para este protocolo como todas as alíquotas de pico-em células de uma única experiência são tomadas a partir da mesma cultura induzida de MAS1074. Como uma alternativa para MAS1074, as células de um organismo cujo RNA será não reagem de forma cruzada com a sonda de hibridização podem ser usadas como spike-em células. Sulfolobus solfataricus células com sucesso têm sido utilizadas como spike-in para experimentos com e. coli tRNA4. No entanto, spike-em células de Escherichia coli são susceptíveis refletir com mais precisão o grau de lise celular das células experimentais, como é incerto se a S. solfataricus lise com a mesma eficiência como e. coli. Também, crescer S. solfataricus é mais tedioso como crescem a 85 ° C, com um tempo de geração de ~ 16 h.
Garantindo a especificidade dos tRNAs selecionado
Se ambos aminoacylated e deacylated tRNA tem sido com sucesso purificadas duas bandas devem ser detectadas na membrana do Norte. A distância entre as duas bandas serão diferentes dependendo do tRNA específico sob investigação e é uma consequência combinada da diferença de tamanho, Propriedades polares e conformação que faz com que um determinado aminoácido quando liga-se um determinado tRNA5 . Por exemplo, a distância entre o aminoacylated e o deacylated tRNA é superior para tRNAargVYZQ é para tRNAgltTUVW, como pode ser visto na Figura 2. Devido ao grande tamanho do gel usado aqui para separar o RNA, a resolução é alta o suficiente para distinguir carregada tRNA descarregado, mas também para distinguir a maioria dos tRNAs diferentes uns dos outros devido a suas diferenças no comprimento, sequência composição e modificação de padrões. Os tRNAs mesmo isoaccepting podem ser distinguidos como mostrado para a leucina aceitando os tRNAs2. No entanto, nota que neste estudo não foi possível distinguir tRNAleuPQV do tRNAleuT, como a diferença na sequência é apenas um G para substituição de T.
Se mais de duas bandas aparecem na membrana do Norte pode ser uma consequência da cross-reaction da sonda com outros RNAs. Aumentar o rigor da etapa de lavagem (etapa 9.5), aumentando a temperatura normalmente pode resolver isto. Lavagem de 30 min a 55 ° C é geralmente suficiente. Se aumentar o rigor da lavagem não remove Cruz-hibridação, a solução pode ser para projetar uma nova sonda complementar para outra parte da sequência de tRNA (muitas vezes parcialmente sobreposta). Faixas adicionais também podem ser reporte de uma sonda anterior, como resultado da remoção insuficiente da membrana. Para evitar isso, faça um controle de faixa, expondo a membrana antes de re-sondagem. Se bandas aparecem sobre a verificação de controle a membrana poderá ter adicionais de descascamento. É geralmente possível re-sonda uma membrana pelo menos 8 - 10 vezes, mas depois de vários testes pode ser difícil a roupa completamente. Se este for o caso, a membrana pode ser armazenada por alguns meses antes de re-sondagem como 32P se deteriora rapidamente.
Mais verificação da especificidade da sonda pode ser obtida executando um Northern blot com células colhidas sob um conjunto de condições onde a transcrição de interesse é esperada para ser afetado de forma previsível. Por exemplo, expressão inducible do tRNA de um plasmídeo, ou fome de aminoácido para aminoácido cognato, deve resultar em um nível de maior expressão relativa ou um nível de carga inferior, respectivamente, do tRNA de interesse.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecer Marit Warrer excelente assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho dinamarquês para pesquisa independente | Ciências naturais [1323-00343B] e a Fundação de pesquisa nacional dinamarquesa [DNRF120].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Urea | Merck | 57-13-6 | Purity >99% |
| Polyacrylamide | Serva | 79-06-7 | |
| Bis (N,N'-Methylene-bis-acrylamide) | BIO-RAD | 161-0201 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma | 76-03-9 | |
| Phenol | Merck | 108-95-2 | |
| IPTG | |||
| Glucose | |||
| Sodium Acetate | |||
| EDTA | |||
| Ethanol | |||
| Tris | |||
| Hydrochloric acid | |||
| Sodium Chloride | |||
| NaH2PO4 | |||
| Sodium Citrate | |||
| SDS | |||
| Herring Sperm DNA | Sigma | 100403-24-5 | |
| BSA | |||
| Polivinylpyrrolidone | |||
| Ficoll | |||
| P32 γATP | Perkin Elmer | ||
| DNA oligos (probes) | TAG Copenhagen | ||
| Hybond N+ membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
| Crosslinker | |||
| Electroblotter | BIO-RAD | ||
| Typhoon FLA 7000 Scanner | GE Healthcare | 28955809 | |
| Spectrophotometer | |||
| Hydridization oven | |||
| Geiger-Müller tube | |||
| Phosphor imager screen | GE Healthcare | ||
| Hybridization tube | |||
| Culture Flasks | |||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| 20 ml centrifuge tubes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| ImageQuant | GE Healthcare | ||
| Excel | Microsoft |
References
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