Summary
Nous présentons ici une méthode pour mesurer directement les ARN de transfert, chargement des niveaux purifiée Escherichia coli RNA, mais aussi un moyen de comparer les niveaux relatifs des ARN de transfert, ou tout autre ARN court, entre les différents échantillons basées sur l’ajout de l’épi cellules exprimant un gène de référence.
Abstract
ARN de transfert (ARNt) est un élément essentiel de la machinerie translationnelle dans n’importe quel organisme. ARNt se lie et transférer des acides aminés dans le ribosome de traduction. Les niveaux relatifs des différents ARNt et le ratio de tRNALeu ARNt au total ARNt, connu comme le niveau de charge, sont des facteurs importants dans la détermination de la précision et la vitesse de translation. Par conséquent, l’abondance et les niveaux de charge des ARNt sont des variables importantes pour mesurer lorsque l'on étudie la synthèse des protéines, par exemple dans diverses conditions de stress. Nous décrivons ici une méthode de récolte des ARNt et directement mesurer tant l’abondance relative et le niveau de charge absolu de certaines espèces de tRNA chez Escherichia coli. L’ARNt est récolté de manière que la liaison labile entre le Tarn et ses acides aminés est préservée. L’ARN est ensuite soumis à l’électrophorèse sur gel et Northern blot, qui se traduit par la séparation des ARNt chargées et non chargées. Les niveaux des ARNt spécifiques dans différents échantillons peuvent être comparés en raison de l’ajout du spike-dans les cellules pour la normalisation. Avant la purification du RNA, nous ajoutons 5 % des cellules d’Escherichia coli qui le rare de tRNAselC à chaque échantillon de surproduction. Le montant de l’espèce de tRNA d’intérêt dans un échantillon est ensuite normalisé à la quantité de tRNAselC dans le même échantillon. Ajout de spike-dans des cellules avant purification RNA a l’avantage sur l’ajout de purifiée spike-en ARN qui elle tient compte également des différences dans l’efficacité de la lyse des cellules entre les échantillons.
Introduction
Dans ce qui suit, nous présentons une méthode pour quantifier les ARNt spécifiques et mesurer leur charge niveaux par Northern blot. La méthode est basée sur une technique développée par verite et al. 1. par récolte des cellules dans l’acide trichloracétique (TCA) et de garder les échantillons à 0 ° C tout au long de la purification de RNA, la liaison ester entre l’ARNt et l’acide aminé est conservé2,3,4. ARNt tRNALeu peut distinguer de leurs homologues nonacylated par électrophorèse sur gel et le transfert de Northern, dû à une diminution de la mobilité de la tRNALeu ARNt dans le gel, causé par l' aminoacide covalente5. En outre, nous présentons un protocole pour normaliser les quantités ARNt par addition du spike-dans les cellules surexprimant la rarement utilisé tRNAselC 4.
ARNt est des molécules plus abondants dans la cellule bactérienne et une partie indispensable de la machinerie de traduction. ARNt lie les acides aminés et les transférer sur les ribosomes traduction. La liaison des acides aminés d’ARNt (aminoacylation ou charge) est facilitée par l’aminoacyl tRNA synthétases. L’abondance relative des différents ARNt chargé est importante pour assurer la fidélité de la synthèse protéique, parce que la sous-représentation de l’apparenté facturés Qu'arnt pour un codon donné l’ARN messager (ARNm) augmente la probabilité d’un ARNt près-apparenté sera livrer par erreur son acide aminé à la chaîne de polypeptide croissant sur le ribosome6. L’importance de l’ARNt chargé est reflétée dans la vaste réponse de la cellule d’e. coli à une chute sévère dans les niveaux de charge d’un ARNt ; la réponse stricte. Au cours de la réponse stricte, la synthèse des ARNt, ARN ribosomal et la plupart des ARNm est abaissée en faveur de la transcription de l’ARNm spécifiques associées aux acides aminés la biosynthèse et du stress de survie, et le taux de croissance des cellules est abaissé de façon spectaculaire7 . En outre, des travaux récents par nous et d’autres ont montré qu’e. coli dégrade activement la majorité de son ARNt en réponse aux contraintes qui limitent la traduction4,8, ce qui suggère que l’ajustement des niveaux ARNt peut être important pour faire face à ces contraintes. Ainsi, des mesures fiables de l’abondance de l’ARNt et niveaux de charge sera un outil important pour bien comprendre les réactions de stress bactérien.
E. coli est couramment utilisée pour exprimer la protéine recombinante et en raison des différences dans l’utilisation de codon entre espèces, expression sous-optimale est un problème souvent rencontré9. Ceci peut être contourné par l’expression des ARNt supplémentaires nécessaires pour la traduction des ARNm recombinants10. Mesures de tRNA charge niveaux dans ces souches pourraient orienter les travaux de dépannage et vous aider à optimiser l’expression de la protéine.
Cette méthode permet également la détection de « mischarging » ; une molécule de tRNA tRNALeu avec un aminoacide non apparenté. Aminoacylation par différents acides aminés peut entraîner un ARNt migrer avec des vitesses légèrement différentes à des gels de polyacrylamide1,11. Dans certains cas, la méthode peut aussi servir à distinguer les modèles modification différente sur l’ARNt autrement identiques3.
Un autre a établi une procédure biochimique pour l’oxydation de l’enquête de l’ARNt niveaux de charge est périodique. La méthode repose sur l’observation que tRNALeu tRNA est protégé contre oxydation périodique et ARNt sans inculpation n’est pas. Le periodate après traitement d’oxydation la recharge de l’ARNt est utilisée pour estimer les niveaux de charge de l’ARN récolté. Toutefois, la recharge de plusieurs ARNt s’est avérée être affectées par le traitement, permettant ainsi une inexactitude12. La méthode présentée ici des mesures directement à partir de l’ARN purifié de charge, ce qui exclut tout biais de réactions chimiques ou enzymatiques. Une des limites de cette méthode est qu’une seule espèce de tRNA est détectée à la fois, donc même si la même Northern blot peut être dépouillé et reprobed pour plusieurs ARNt, c’est beaucoup de temps et un peu laborieux à recueillir des données sur plusieurs ARNt.
Un moyen fiable de normaliser les échantillons entre eux est vital dans les études dont le but est de comparer les niveaux relatifs d’une molécule à travers différents échantillons. Ici, nous introduisons une procédure de normalisation pour l’ARN où une petite aliquote d’e. coli cellules surexprimant la rare tRNAselC est ajoutée comme un épi-en à tous les échantillons expérimentaux avant purification RNA. Cette méthode est utile non seulement lors de l’examen des ARNt, mais pour la quantification relative de toutes les espèces d’ARN lorsque le montage expérimental est telle qu’aucun RNA endogène ne peut faire confiance pour être présents à la même concentration cellulaire dans tous les échantillons. Par exemple, le niveau d’un ARN ribosomal RNA-like « ménage » est souvent utilisé comme une référence endogène de comparer les quantités relatives d’un autre ARN entre les différents échantillons13. Mais cela est de peu d’utilité si la concentration cellulaire de l’ARN de référence varie selon les échantillons, comme peut être le cas pour les ARN ribosomiques en cas d’échantillonnage pendant un stress réponse15,16,17 ou entrée en phase stationnaire17. L’ajout du spike-dans les cellules pour les échantillons expérimentaux avant purification RNA fournit un moyen solid et précis de normalisation indépendant de l’installation d’échantillonnage. Une autre façon de normalisation est l’ajout d’un ou plusieurs épi-en ARN aux échantillons expérimentaux après purification RNA. Toutefois, cette méthode ne tient pas compte des différences dans la récupération de RNA entre les échantillons.
À l’aide de cellules d’Escherichia coli qu’overexpress l’ARN de référence comme spike-dans les cellules (voir Figure 1) dans une expérience sur e. coli présente l’inconvénient qu’il résulte en outre d’une petite quantité d’exogène e. coli total ARN pour la échantillons. Nous corrigeons pour cet ajout en analysant un échantillon ne contenant que spike-dans des cellules en parallèle avec les échantillons expérimentaux (voir le Northern blot en Figure 2, lane, étiqueté « selC »). Le protocole présenté est développé pour e. coli K-12 mais est susceptible d’être applicable pour la plupart des espèces bactériennes.
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Protocol
1. préparation des cultures bactériennes.
- Grow toutes les cultures dans les flacons d’Erlenmeyer avec un rapport de volume/flacon de culture d’au plus 1/6. Dans une installation expérimentale de type, poussent les cultures à 37,0 ° C et en agitant à 160 tr/min en morpholinepropanesulfonic acide (MOPS) minimale moyenne 18 additionné de la source de carbone préféré, par exemple 0,2 % de glucose, pendant au moins 10 les générations successives avant la récolte de RNA.
- La veille de la récolte de RNA, diluer une culture immature de la souche désirée dans un milieu minimal vadrouilles de telle manière qu’il atteindra le désiré OD 436 au moment voulu le lendemain. Calculer le volume de culture immature à utiliser pour l’inoculation par la formule :
Remarque : ici, OD nouveau dénote la désirée OD 436 après incubation, V nouveau désigne le volume de la culture dilué, OD vieux dénote l' OD 436 de la culture immature diluée de, G désigne le nombre de générations se développera la culture, de la temps de dilution (t 1) à l’époque, il est nécessaire le lendemain (t 2) et peut être calculée comme : décalage (en minutes) entre t 1 et t 2 divisé par la durée de génération (en min). Pour assurer une croissance stationnaire au moment de l’échantillonnage, G devrait être ≥ 10 ; V vieux désigne le volume de la culture out-cultivé qui doit être transféré vers le milieu frais. Cette équation est une approximation qui ne tient pas compte de toute phase de latence ; un phénomène souvent observé après dilution d’une culture out-cultivée dans les supports neufs.- Conditions de croissance variera selon le but de l’expérience, mais pour limiter la variation de cellule-cellule dans les niveaux de l’ARNt et d’augmenter la reproductibilité des résultats, (recommandé) poussent les cultures pour stabiliser l’état avant l’échantillonnage 19.
2. Préparation du spike-dans les cellules
Remarque : la souche e. coli MAS1074, qui exprime le gène selC tRNA selC sous le contrôle de l’isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)- promoteur inductible est utilisé comme la souche spike-à.
- Diluer une culture immature de MAS1074 à une OD 436 de 0,05 en vadrouilles un milieu minimal additionné de 100 µg/mL ampicilline et 0,2 % de glucose. Cultiver la culture à 37 ° C, agitation à 160 tr/min.
Remarque : Voir la Discussion pour l’utilisation d’une souche de référence alternative. - À OD 436 ~ 0,1, ajouter IPTG à une concentration finale de 1 mM pour induire l’expression de l’ARNt selC. Développer la culture d’OD 436 ~0.5 (~ 3-4 h de croissance) et déplacer le flacon de culture à un bain de glace. Conserver la culture de pointe-dans la cellule sur la glace jusqu'à ce que tous les échantillons pour la purification de RNA ont été récoltés.
3. Récolte d’échantillons expérimentaux.
- Pre tiède (37 ° C) un plafonné erlenmeyer de 100 mL (ou similaire) contenant 4 mL d’acide trichloracétique 10 % (p/v) (TCA) pour chaque échantillon en le plaçant dans un bain-marie chauffé.
Remarque : attention, TCA se décompose par chauffage, produisant des vapeurs toxiques et corrosives dont le chlorure d’hydrogène et le chloroforme. La solution dans l’eau est un acide fort ; Il réagit violemment avec les bases et corrosif pour beaucoup de métaux. Précautions appropriées doivent être prises lors de l’utilisation de ce liquide. - Juste avant la récolte de cellules, mesurer et noter la OD 436 de la culture.
- Pour récolter les cellules, transférer 4 mL de la culture dans une fiole préchauffée contenant TCA.
- Mélanger l’échantillon en agitant le flacon à la main pour 5 s. en mélange avec des TCA immédiatement désactive toutes les activités et préserve ainsi les niveaux de charge des ARNt.
NOTE : Si plusieurs échantillons doivent être collectés, laissez les échantillons récoltés TCA sur la glace jusqu'à ce que tous les échantillons ont été collectés.
4. Ajout du spike-dans les cellules
Remarque : préparation du spike-dans les cellules est décrite à l’étape 2.
- Lorsque tous les échantillons pour préparation d’ARN ont été prélevé, ajouter 5 % spike-dans les cellules (basés sur OD) pour chaque échantillon.
Remarque : Le volume de spike-en cellule culture nécessaire est calculé par la formule :
où V pointe représente le volume de spike-en cellule culture nécessaire, V exp désigne le volume récolté expérimental de culture de cellules (sans les TCA), OD exp dénote l' OD 436 de la culture de cellule expérimentale au moment de la récolte dans les TCA. OD spike dénote l' OD 436 de la culture pointe-dans la cellule. Si plusieurs échantillons sont récoltées à différents ODs, le volume des cellules épi-en ajouté doit être ajusté selon la formule ci-dessus pour chaque échantillon. - De quantifier la contribution de l’épi-dans les cellules à l’ARN d’intérêt, préparer un échantillon contenant seulement des épi-dans les cellules en mélangeant 4 mL spike-dans les cellules avec 4 mL TCA. Préparer l’ARN de cet échantillon de la même manière que pour les autres échantillons.
- , Éventuellement, prendre une autre fiole contenant seulement l’échantillon expérimental, sans crampon-dans les cellules et incluez-le afin de quantifier la contribution de l’échantillon expérimental à l’ARNt selC niveaux ; les taux endogènes de tRNA selC en E. coli K-12 sont négligeable faible.
5. Préparation de l’ARN
Remarque : Protocole de préparation de l’ARN décrit ici est essentiellement celle décrite par la verite et al. 1 ; Pour éviter la désacylation des ARNt tRNALeu durant la purification, il est important de conserver les échantillons à pH acide et à 0 ° C tout au long de la purification. Utiliser des tubes/flacons propre stériles pour contenir les échantillons et les solutions et préparer toutes les solutions de l’eau ultrapure (18,2 MΩ·cm résistivité).
- Verser 8 mL de chaque échantillon dans un tube à centrifuger de glace-réfrigérés. Centrifuger les échantillons pendant 10 min à 9 500 x g à 4 ° C. complètement enlever le surnageant et remettre en suspension dans l’acétate de sodium de le 0,3 M froid 0,3 mL, pH 4,5 et 10 mM EDTA.
- Transférer chaque échantillon dans un tube de microcentrifuge de froid 1,5 mL et ajouter phénol 0,3 mL équilibré avec le même tampon.
Remarque : attention, phénol produit des vapeurs toxiques et est très corrosive pour la peau. - Vortex chaque échantillon 10 x 15 s au moins 1 minute entre chaque vortex. Entre agitation conserver les échantillons à 0 ° C. utiliser les pauses fréquentes pour s’assurer que les échantillons restent froids.
- Échantillons de Centrifuger pendant 15 min à 20 000 x g à 4 ° C. transfert la phase aqueuse (phase supérieure) à nouveau microtubes de 1,5 mL tubes. Ajouter 0,3 mL froid phénol et le vortex 4 x 15 s comme avant.
- Centrifugation pendant 10 min à 20 000 x g à 4 ° C. transfert la phase aqueuse pour microtubes de 1,5 mL de nouveau, froid tubes contenant 2,5 fois le volume d’éthanol à 96 % (~ 750 µL). Précipiter l’ARN en incubant les tubes pendant 1 h à-20 ° C ou une nuit à -80 ° C.
- Échantillons de Centrifuger pendant 30 min à 20 000 x g à 4 ° C. éliminer le surnageant et ajouter 1 mL d’éthanol à 70 % froid avec précaution sans déranger le culot de RNA. Retourner doucement une fois pour laver l’intérieur des tubes avec de l’éthanol.
Remarque : Le culot peut être difficile de voir à cette étape. - Centrifugation pendant 10 min à 20 000 x g à 4 ° C. complètement éliminer le surnageant et sécher le culot jusqu'à ce qu’il ne l’éthanol. Resuspendre le culot au vigoureusement Vortex dans 20 µL froid 10 mM sodium acétate pH 4.5 et 1 mM EDTA.
Remarque : Ne pas trop sécher le culot qu’il deviendra difficile de remettre en suspension. - Vous pouvez également évaluer la concentration de l’ARN en mesurant l’absorbance à 260 nm.
- Cas échéant, évaluer la qualité de l’ARN purifié par de l’électrophorèse sur gel d’agarose 20.
- Échantillons de magasin à -80 ° C.
Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.
Remarque : À distinguer de la bande de tRNALeu tRNA de son homologue désacétylé sur la Northern blot, un chimiquement désacétylé aliquote est préparé par traitement alcalin. Pour la plupart des cas, il suffit de deacylate un seul échantillon pour chaque tache nordique.
- Dégel l’ARN échantillon sur la glace. Transférer une quantité de 4 µL de l’échantillon de RNA dans un nouveau tube. Ajoutez du 46 µL Tris-HCl pH 9,0. Incuber pendant 2 h à 37 ° C.
- Ajouter 15 µL d’acétate de sodium 0,3 M à pH 4,5 et par la suite ajouter 125 µL d’éthanol à 96 %. Précipiter les ARN à-20 ° C pendant 1 h.
- Centrifugeuse pendant 30 min à 20 000 x g à 4 ° C. complètement éliminer le surnageant et remettre en suspension dans 4 µL froid 10 mM sodium acétate pH 4,5 et 1 mM EDTA.
Remarque : Le protocole peut être suspendu ici, si l’échantillon est conservé à -80 ° C.
7. Gel d’électrophorèse et le transfert de Northern
- Mix 4 µL échantillon (non traitées ou chimiquement désacétylé) avec 6 µL de tampon de chargement (0,1 M acétate de sodium (pH 5,0), 8 M urée, bleu de bromophénol 0.05 % et 0,05 % de xylène cyanol).
Remarque : N’oubliez pas d’inclure l’échantillon contenant seulement spike-dans les cellules, le chimiquement désacétylé échantillon (et l’échantillon sans crampon-dans les cellules, si l’un a été préparé). - Charger les échantillons sur un 0,4 mm épaisseur 6,5 % gel de polyacrylamide (19:1 acrylam - ide:bisacrylamide) contenant de l’urée 8 M dans le tampon d’acétate de sodium 0,1 M (pH 5.0). Utiliser des gels long de 60 cm pour une bonne séparation des espèces de tRNA.
- Séparé de l’ARN par électrophorèse sur gel de V/cm 10 à 4 ° C, jusqu'à ce que le bleu de bromophénol atteint le fond du gel (~ 20 h).
- La zone du colorant xylène cyanol et 20 cm vers le bas vers le bleu de bromophénol colorant est utilisé pour éponger (la distance entre les deux colorants devrait être de 25-30 cm). Soigneusement séparer les deux plaques de verre, afin que le gel reste sur l’un d’eux. Un morceau de papier filtre mince est coupé à la taille de l’espace souhaité buvard et placé sur le dessus de la partie du gel qui sera utilisé pour éponger. Les pièces du gel qui ne sont pas couverts par le filtre papier sont coupés et mis au rebut. utiliser le papier filtre pour soulever délicatement le morceau de gel loin de la plaque de verre.
Remarque : Le grand gel est très fragile donc manipuler avec soin. - Une membrane de nylon chargé positivement (p. ex. Hybond N + membrane) est placée au dessus du gel et il est electroblotted à 20 V pendant 90 min avec 40 mM Tris-acétate (pH 8,1), 2 mM EDTA comme tampon de transfert.
- Liaison croisée de l’ARN à la membrane à l’aide de la lumière UV (0,12 J/cm 2).
Remarque : La membrane peut maintenant être stockée à température ambiante et le protocole peut être suspendu ici.
8. Conception et vérification des sondes
Remarque : conception et vérification des sondes par Northern blot est cruciale pour obtenir des résultats fiables et éviter les indésirable hybridation croisée avec les autres espèces d’ARN prudent.
- Utilisation courts oligonucléotides synthétiques comme sondes. Concevoir la séquence de la sonde de manière qu’elle est complémentaire à la partie la plus unique de la séquence de l’ARNt d’intérêt - ce qui est souvent la boucle de l’anticodon.
NOTE : Une liste de séquences de tRNA prédites de divers organismes se trouvent dans le tRNA génomique Database (GtRNAdb) 21. - Ajuster la longueur de la séquence pour obtenir un prédit fusion température de 55-65 ° C.
- BLAST (base Local Alignment Search Tool) choisi séquence contre la séquence du génome de la souche bactérienne utilisée dans l’expérience, afin de vérifier que la séquence est unique à l’ARNt sélectionnés, comme décrit dans 22.
Remarque : Le tableau 1 répertorie les séquences suggérées sonde pour plusieurs différents ARNt d’e. coli K12. Si la sonde est spécifique pour le tRNA d’intérêt, seulement deux bandes sont visibles sur le Northern blot (ARNt chargées et déchargées) et qu’une bande est visible sur la voie avec l’échantillon désacétylé (tRNA non chargés). Si plus de deux bandes sont présentes ou encore validation de spécificité de la sonde est souhaitée, voir Discussion.
9. L’hybridation de Northern blot
Remarque : dans les étapes suivantes, la membrane est séquentiellement hybridée avec sondes complémentaires à désiré ARNt spécifiques, y compris un spécifique de la sonde pour la référence tRNA selC.
- Placer la membrane dans un tube de l’hybridation et ajouter 6 mL de solution d’hybridation (0,9 M NaCl, 0,05 M NaH 2 PO 4 (pH = 7,7), 5 mM EDTA, 0,5 % (p/v) SDS, 100 mg/mL de cisaillé et dénaturé ADN de sperme de hareng et 5 x Denhardt ' solution s (100 x Denhardt ' solution s = 2 %, 2 % de polyvinylpyrrolidone 40 et 2 % d’albumine sérique bovine Ficoll)).
- Pré hybrider la membrane dans la mémoire tampon pendant 1 h en tournant à la sonde de ° C. Ajouter 30 pmol radioactifs oligo-ADN 42 5 ' - fin - étiqueté avec 32 P (préparé comme indiqué par Scott et al. 23)
Remarque : attention, les émissions de bêta de haute énergie de 32 P peuvent présenter une peau importante et risque de dose d’oeil. Bonne précautions doivent être prises lorsqu’à l’aide de 32 P. Radioactive des déchets doit être jeté conformément aux protocoles de sécurité institutionnelle appropriée. - Incuber la sonde avec la membrane en rotation pendant la nuit à 42 ° C. Retirer la sonde à l’aide d’une pipette jetable 10 mL.
Remarque : Si conservé dans un congélateur à la sonde peut être réutilisée. - Dans le tube de l’hybridation, laver la membrane sous peu dans 50 mL de 0,3 M NaCl, citrate de sodium de 30 mM, SDS 0,1 % (p/v) à la température ambiante.
Remarque : Ce premier lavage contient sonde beaucoup non liée et doivent être manipulé comme hautement radioactives. - Répéter étape 9,4 une fois, puis déplacer la membrane à un récipient plat en plastique ou un plateau comprenant un couvercle. Couvrir la membrane avec la solution de lavage (0,3 M NaCl, citrate de sodium de 30 mM, SDS 0,1 % (p/v)) et il incuber 30 min à température ambiante.
- Changer la solution de lavage et continuer le lavage jusqu'à ce qu’un signal / bruit satisfaisant a été obtenu (souvent 3-4 changements de solution de lavage). Utiliser un tube Geiger-Müller pour détecter comment le bruit ratio signal change en mesurant le rayonnement provenant d’une zone vide de la membrane et comparez-la à la zone où la sonde a hybridé spécifiquement à tRNA.
- Pour pouvoir enlever la sonde de la membrane après l’exposition, veiller à ce que (important) la membrane se dessécher avant la procédure de dépouillement. Placer la membrane dans un sac en plastique mince ou une pellicule hermétiquement à l’aide de plastique enveloppe et scellez-la pour être étanche à l’air par ruban adhésif ou soudure. Placer la membrane étanche sur un écran de phosphorimaging.
NOTE : Le temps d’exposition nécessaire sur l’écran phosphorimaging est déterminée par l’activité spécifique de la sonde, la quantité d’ARN sondé for et l’efficacité de l’hybridation de la sonde et peut varient considérablement ; de quelques minutes à plusieurs jours. Avec l’expérience, l’intensité des radiations détectées sur la membrane avec le tube Geiger-Müller donne une bonne indication de la durée d’exposition nécessaire. Pour la quantification fiable, il est important que l’écran n’est pas surexposé. - Balayage de l’écran de phosphorimaging à l’aide d’un scanner laser et enregistrez le fichier dans " .gel " format.
NOTE : Il faut un haut rapport signal sur bruit de quantification fiable. Sondage pour un ARNt devrait se traduire par deux bandes ; tRNALeu contenant un ARNt (plus lente migration) et désacétylé contenant un ARNt (migration plus rapide). Voir la Figure 2.
10. Décapage de la membrane
Remarque : avant la membrane peut être sondée pour un autre ARNt, la sonde précédente doit d’abord être enlevée par la membrane de décapage.
- Chaleur assez décapage tampon (15 mM NaCl, citrate de sodium 1,5 mM, SDS 0,1 % (p/v)) pour couvrir la membrane et la verser sur la membrane. Incuber pendant 15 min à température ambiante il.
- Répéter l’étape 10.1 jusqu'à aucun rayonnement peut être détectée avec un tube Geiger-Müller, la membrane peut maintenant être re-hybridée suivant les étapes décrites dans la Section 9.
11. Quantifier les ARNt et niveaux de charge
- charge le fichier .gel dans l’imagerie logiciel (voir la Table des matières). Tracez une ligne verticale le long de chacune des voies de l’échantillon de telle sorte qu’elle s’étend sur la majeure partie de la largeur de la voie, mais exclut les bords des bandes où le signal peut être inégal, comme illustré à la Figure 3 a.
- Visualiser compte de chaque voie en cliquant " analyse "-> " création graphique ". Définissez manuellement les deux pics représentant l’accusé et l’ARNt sans inculpation de chaque voie, comme illustré à la Figure 3 b.
- Obtenir des dénombrements de chaque pic en cliquant " analyse "-> " zone rapport " et d’enregistrer des superficies de chacune des deux sommets.
- Lorsque la tache a été sondée pour tRNA selC et au moins un tRNA d’intérêt, de normaliser les niveaux de l’ARNt d’intérêt pour les ARNt selC.
- Calculer la proportion de l’ARNt originaires des cellules épi-dans chaque voie et en soustraire le signal total dans cette voie en utilisant l’équation :
Remarque : ici, Déguster les ARNt = le signal provenant d’une seule voie d’une membrane sondée pour le tRNA désiré ; Échantillon de selC = le signal provenant de la même voie de la membrane même sondée pour tRNA selC ; Réf tRNA = le signal provenant de la voie contenant RNA que spike-dans les cellules de la membrane même sondée pour le tRNA désiré ; Réf selC = le signal provenant de la voie contenant ARN que spike-dans les cellules de la membrane même sondée pour tRNA selC. - Pour normaliser, divisez la valeur corrigée de tRNA de chaque voie par le signal de selC ARNt de la même voie.
Remarque : La contribution au signal selC tRNA des cellules échantillonnées est négligeable (voir la Figure 2, voie marquée "-selC ").
- Calculer la proportion de l’ARNt originaires des cellules épi-dans chaque voie et en soustraire le signal total dans cette voie en utilisant l’équation :
- Calculer le tRNA niveau pour chaque voie de charge en divisant le signal du pic représentant des ARNt chargé avec la somme du signal de ces deux sommets (chargée + non chargés).
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Representative Results
Utiliser la procédure décrite ici, l’abondance et la recharge des niveaux de trois tARNs ont été mesurées chez e. coli K-12 avant et acides aminés.
NF9154 la souche auxotrophe de l’arginine (thr leu sa argH thi mtl supE44) a été cultivée depuis au moins dix générations dans un milieu minimal MOPS additionné de 0,4 % de glycérol, 50 µg/mL thréonine, leucine, arginine et histidine de 5 µg/mL à 37 ° C, agitation à 160 tr/min. Famine de l’arginine a été présenté par filtration de la culture et de la remise en suspension dans un milieu frais MOPS comme ci-dessus mais sans arginine. Durant le jeûne de l’arginine, la synthèse des protéines est fortement réduite, mais continue à un niveau bas à l’aide d’arginine libéré par le chiffre d’affaires de protéines existantes. Des échantillons ont été récoltés au moment points indiqués à la Figure 4. Après que tous les échantillons ont été récoltés dans les TCA, 5 % du MAS1074 spike-dans les cellules surexprimant tRNAselC, a été ajouté à chaque échantillon, comme illustré dans la Figure 1. ARN a été purifiée à partir d’échantillons, séparé par électrophorèse et effacé sur une membrane comme décrit dans le protocole. La membrane a été sondée pour ARNtargVYZQ, ARNtgltTUVW, ARNthisRet ARNtselC, comme on le voit à la Figure 2. Le signal de rayonnement de chaque voie a été quantifié pour chacune des quatre sondes comme illustré à la Figure 3et corrigée et normalisée, comme décrit dans la Section 11. Les résultats sont présentés dans la Figure 4. Figure 4 a montre que les niveaux de toutes les espèces testées de tRNA diminuent rapidement durant le jeûne de l’acide aminé, comme rapporté récemment4. Figure 4 b montre que l’ARNt charge niveaux se comportent comme prévu : la fraction chargée de l’ARNt arginine-acceptant chute rapidement lors du retrait de l’arginine dans le milieu de croissance, alors que les niveaux de charge des autres ARNt augmentent légèrement sur famine parce que chargé ARNt s’accumuler lorsque leur taux de décharge dans les ribosomes diminue en raison de l’absence de substrat pour la synthèse de protéine4. Plus loin dans la période de famine, la fraction d’ARNt chargé diminue aux niveaux environ avant de famine en raison de la dégradation de la majorité de la piscine d’ARNt (Figure 4 a), qui se traduit par un taux plus élevé de décharge des ARNt restant à les ribosomes. En revanche, la fraction chargée des tRNAargVYZQ augmente pour au moins deux raisons ; 1) activation de la réponse stricte signifie qu’ARNm, ne pas facturé tRNAarg, devient le facteur limitant pour la traduction et 2) la masse totale de l’ARNtarg est réduite (Figure 4 a) donc une large fraction de l’ARNt totalarg peut être chargée par la même petite quantité d’arginine. Cette expérience montre comment la mesure simultanée de l’abondance de l’ARNt et niveaux de charge de tRNA fournit des informations de qualité sur les conditions de la synthèse des protéines à l’intérieur de la cellule.
Figure 1. Ajout du spike-dans les cellules aux échantillons. Dans cet exemple, les échantillons d’une culture unique d’e. coli NF915 sont récoltées dans une série chronologique avant et acides aminés. Une représentation schématique de la courbe de croissance de NF915 s’affiche, où les points bleus indiquent les points de récolte de l’échantillon. Les axes sont à échelle logarithmique. Des échantillons de la culture expérimentale sont récoltées comme décrit à la Section 3. Une représentation schématique de la courbe de croissance de la souche de spike-en MAS1074 montre aussi, avec le point de récolte d’échantillon indiquée par un point bleu. Le point de la figure est d’illustrer que tous les échantillons expérimentaux ( d’e. coli NF915 dans cet exemple) reçoivent une partie aliquote du spike-dans les cellules de la même culture de référence. Pour chaque échantillon, 5 % du pic-dans les cellules sont ajoutés aux cellules expérimentales, calculés basé sur le diamètre extérieur des cultures cellulaires (voir Section 4). Par la suite, l’ARN est purifiée à partir de tous les échantillons et utilisé pour des taches du Nord. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Scan Phosphor imager un par Northern blot sondé pour indiqué ARNt. La membrane contient RNA de la souche e. coli NF915 récoltés aux points d’heure indiquée avant et après l’induction de la famine de l’arginine (minutes). En outre, la membrane contient deux voies d’échantillons où spike-dans les cellules ont été omis (-selC DA et - selC), et une voie contenant des ARN de l’épi-en cellules seul (selC). L’échantillon de selC - DA contient chimiquement désacétylé ARNt. Les deux bandes représentant les espèces de tRNA chargées et non chargées sont clairement séparées. Remarque le signal négligeable de tRNAselC dans les ruelles sans ajouté spike-dans les cellules. La même membrane a été successivement dépouillée et reprobed pour les ARNt indiqués à gauche. La zone boxed dans la tache supérieure indique la partie de la tache, ce qui est indiquée pour le palpage d’ARNt ultérieures. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Quantification de Northern blot. abondance de l’ARNt est mesurée à l’aide de logiciels. (A) A seule voie de la tache nordique vue dans la Figure 2 sondé pour ARNtargVYZQ. La flèche du haute et du bas indique la tRNALeu Tarn et le désacétylé ARNt, respectivement. Les lignes rouges en parallèle avec la voie sont ajoutés et utilisés pour définir la zone pour la quantification. (B) Quantification du signal dans les deux lignes rouges cassés vu au point A représenté sous forme de graphique, où l’axe horizontal indique la distance entre le dessus de la ligne (a) (en pixels), et l’axe vertical indique l’intensité du signal (en chiffres). Les deux pics originaires de signal contenant de la tRNALeu Tarn et le désacétylé ARNt, respectivement, sont définis manuellement. Les données qui sont exportées pour une analyse ultérieure sont la valeur correspondant à la zone sous chacun des deux sommets. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 4. Résultat représentatif : Quantification des abondances de tRNA und charge niveaux durant le jeûne de l’arginine. Quantification des bandes sur la Northern blot illustré à la Figure 2. (A), la relative abondance des ARNtgltTUVW (rouge), ARNtargVYZQ (bleu) et de l’ARNthisR (vert). Le niveau constaté à zéro minute (échantillons récoltés juste avant l’apparition de la famine) est défini sur 1. (B) niveau des trois ARNt même comme dans (A) de charge. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Sonde spécificité | Séquence de la sonde |
| tRNAargVYZQ | 5'-TCCGACCGCTCGGTTCGTAGC |
| tRNAgluTUVW | 5'-CCTGTTACCGCCGTGAAAGGG |
| tRNAhisR | 5'-CACGACAACTGGAATCACAATCC |
| tRNAleuPQVT | 5'-GTAAGGACACTAACACCTGAAGC |
| tRNAleuU | 5'-TATTGGGCACTACCACCTCAAGG |
| tRNAleuW | 5'-CTTGCGGCGCCAGAACCTAAATC |
| tRNAleuX | 5'-TATTTCTACGGTTGATTTTGAA |
| tRNAleuZ | 5'-AAAATCCCTCGGCGTTCGCGCT |
| tRNAlysQTVWYZ | 5'-TGCGACCAATTGATTAAAAGTCAAC |
| tRNAthrV | 5'-TGGGGACCTCACCCTTACCAA |
| tRNAtyrTV | 5'-TCGAACCTTCGAAGTCGATGA |
| tRNAselC | 5'-ATTTGAAGTCCAGCCGCC |
Le tableau 1. Tableau des séquences suggérées sonde pour certains ARNt dans e. coli , K-12.
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Discussion
Ce protocole décrit comment mesurer simultanément le niveau de charge spécifique e. coli ARNt et comparer les niveaux relatifs des ARNt dans différents échantillons. Les points critiques du protocole sont 1) pour manipuler les échantillons de telle sorte que les niveaux de charge ARNt cellulaire sont conservées, 2) pour normaliser les quantités de tRNA de telle sorte que les niveaux relatifs de tRNA dans différents échantillons peuvent être comparés avec fiabilité et 3) pour s’assurer de la sp arrangement des sondes sélectionnés pour les ARNt d’intérêt. Ces points sont abordés séparément ci-dessous.
purification de l’ARNt
Les ARNt sont purifiés d’e. coli dans une manière douce qui est optimisée pour maintenir leurs niveaux de charge cellulaire. C’est notre expérience que ce protocole extrait principalement RNAs inférieurs à 150 nt, ARNt constitue donc une fraction importante de l’ARN purifié. Pour cette raison, il est déconseillé d’utiliser ce protocole pour purifier l’ARN total d’Escherichia coli. Le protocole présenté ici devrait également convenir pour la détection et la quantification d’autres ARN tels que de petits ARN (sRNA) sans les adaptations supplémentaires. Parce que le protocole d’extraction de l’ARN enrichit de courtes séquences d’ARN, il devrait également trouver utilisation même si la sRNA incriminé est exprimé humbles.
Normalisation de spike-dans les cellules
Pour comparer les niveaux de l’ARNt dans différents échantillons, il est nécessaire de normaliser les niveaux de tRNA et les niveaux d’une transcription qui est présente dans le même nombre moyen par cellule chez tous les échantillons, afin de corriger les variations d’échantillon dans l’ARN récupération et gel de chargement. À cette fin, nous doper les échantillons avec 5 % des cellules de référence qui surexpriment le rare de tRNAselC avant purification RNA. La méthode spike est préférable au fil à l’aide d’un ARN endogène comme référence, parce qu’elle permet la comparaison des niveaux de l’ARNt dans des conditions où aucun ARN endogènes n’est connus avec certitude se trouvent à la même concentration cellulaire. À l’aide de cellules d’Escherichia coli comme l’épi-in présente l’inconvénient que 5 % supplémentaires d’e. coli RNA est ajouté à tous les échantillons de laboratoire, où il contribue au signal de l’ARN d’intérêt. Cette tendance s’explique par l’y compris un échantillon contenant uniquement les cellules épi-en sur chaque tache nordique et de corriger les valeurs de RNA comme indiqué au point 11.4.1. L’expression de l’ARNtselC dans les cellules de type sauvage est si bas par rapport aux autres ARNt (voir Figure 2) qu’il ne fait pas une différence significative dans la quantification et peut donc être négligée. Toutefois, la souche de référence MAS1074, où selC est exprimée par un promoteur de7 T sur un plasmide élevé de copies, nous estimons qu’au moins 1000 fois plus tRNAselC est produit en présence de 1 mM IPTG que celle provoquée par le type sauvage E. coli K-12 dans toutes les conditions. MAS1074 cesse de croître après deux générations d’induction d’IPTG complet. À ce moment-là, culture-à différences dans l’induction de l’ARNtselC sont petites, et pas un sujet de préoccupation pour ce protocole tant que toutes les parties aliquotes de spike-dans les cellules pour une seule expérience proviennent de la même culture induite des MAS1074. Comme alternative à MAS1074, les cellules de l’organisme dont RNA ne sera pas de réaction croisée avec la sonde d’hybridation peuvent servir de spike-dans les cellules. Sulfolobus solfataricus cellules ont été utilisés avec succès comme spike composant logiciel enfichable pour expérimente l’e. coli tRNA4. Cependant, épi-en cellules d’Escherichia coli sont susceptibles de mieux refléter le degré de la lyse cellulaire des cellules expérimentales, car on ne sait pas si S. solfataricus lyse avec la même efficacité que e. coli. Aussi, S. solfataricus de plus en plus est plus fastidieux à mesure qu’ils grandissent à 85 ° C avec un temps de génération de ~ 16 h.
Assurer la spécificité des ARNt sélectionnés
Si les deux tRNALeu et désacétylé tRNA a été avec succès purifiées deux bandes devraient être détectés sur la membrane du Nord. La distance entre les deux groupes vont dépendre de l’ARNt spécifiques sous enquête et est la conséquence combinée de la différence de taille, propriétés polaires et conformation qui un acide aminé particulier cause lorsqu’il lie à un ARNt donné5 . Par exemple, la distance entre le tRNALeu et le désacétylé tRNA est supérieur pour les ARNtargVYZQ qu’il est pour l’ARNtgltTUVW, comme on le voit à la Figure 2. En raison de la grande taille du gel utilisé ici pour séparer l’ARN, la résolution est suffisamment élevée pour distinguer sans inculpation des ARNt chargé mais aussi de distinguer la plupart des ARNt différents les uns des autres en raison de leurs différences dans la longueur, séquence composition et motifs de la modification. Isoacceptrices même ARNt se distingue comme indiqué pour la leucine acceptant les ARNt2. Toutefois, remarque que dans cette étude, il n’était pas possible de distinguer des ARNtleuPQV de tRNAleuT, que la différence de séquence est seulement un G à la substitution de T.
Si plus de deux bandes apparaissent sur la membrane du Nord, ça pourrait être une conséquence de la réaction croisée de la sonde avec autres ARN. Accroître la rigueur de l’étape de lavage (étape 9,5) en augmentant la température peut généralement résoudre ce problème. Lavage 30 min à 55 ° C suffit généralement. Si augmenter la rigueur de lavage ne supprime pas l’hybridation croisée, la solution peut être de concevoir une nouvelle sonde qui est complémentaire à une autre partie (souvent en partie de se chevaucher) de la séquence de l’ARNt. Bandes supplémentaires peuvent également être reportés d’une précédente sonde, à la suite de décapage insuffisant de la membrane. Pour éviter cela, faire un contrôle de la bande en exposant la membrane avant de re-sondage. Si les bandes apparaissent sur l’analyse de contrôle, que la membrane peut avoir besoin de décapage supplémentaires. Il est généralement possible de re-sonde une membrane au moins 8 - 10 fois, mais après plusieurs sondes, il peut être difficile à se déshabiller complètement. Si c’est le cas, la membrane peut être conservée pendant quelques mois avant de re-sondage comme 32P décroît rapidement.
Nouvelle vérification de la spécificité de la sonde peut être obtenue en effectuant un Northern blot avec cellules prélevées dans une situation où la transcription d’intérêt devront être affectés d’une manière prévisible. Par exemple, une expression inductible de l’ARNt par un plasmide, ou acides aminés famine pour l’acide aminé apparenté, devrait entraîner un niveau d’augmentation relative de l’expression ou d’un niveau de charge inférieur, respectivement, de l’ARNt d’intérêt.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Marit Warrer excellente assistance technique. Ce travail a été soutenu par le Conseil danois pour la recherche indépendante | Sciences naturelles [1323-00343B] et la Fondation National danois de recherche [DNRF120].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Urea | Merck | 57-13-6 | Purity >99% |
| Polyacrylamide | Serva | 79-06-7 | |
| Bis (N,N'-Methylene-bis-acrylamide) | BIO-RAD | 161-0201 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma | 76-03-9 | |
| Phenol | Merck | 108-95-2 | |
| IPTG | |||
| Glucose | |||
| Sodium Acetate | |||
| EDTA | |||
| Ethanol | |||
| Tris | |||
| Hydrochloric acid | |||
| Sodium Chloride | |||
| NaH2PO4 | |||
| Sodium Citrate | |||
| SDS | |||
| Herring Sperm DNA | Sigma | 100403-24-5 | |
| BSA | |||
| Polivinylpyrrolidone | |||
| Ficoll | |||
| P32 γATP | Perkin Elmer | ||
| DNA oligos (probes) | TAG Copenhagen | ||
| Hybond N+ membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
| Crosslinker | |||
| Electroblotter | BIO-RAD | ||
| Typhoon FLA 7000 Scanner | GE Healthcare | 28955809 | |
| Spectrophotometer | |||
| Hydridization oven | |||
| Geiger-Müller tube | |||
| Phosphor imager screen | GE Healthcare | ||
| Hybridization tube | |||
| Culture Flasks | |||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| 20 ml centrifuge tubes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| ImageQuant | GE Healthcare | ||
| Excel | Microsoft |
References
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