Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

כימות של רמות של RNAs העברה ב- Escherichia coli השפע וטעינה

Published: August 22, 2017 doi: 10.3791/56212
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Copenhagen

Summary

כאן אנו מציגים שיטה למדידת ישירות RNA העברה טעינה רמות מטוהרים Escherichia coli RNA, כמו גם כדרך להשוות בין רמות היחסי של העברת RNA, או כל RNA קצרים אחרים, מדגמים שונים בהתבסס על התוספת של ספייק-in תאים המבטאים גנים התייחסות.

Abstract

רנ א העברה (tRNA) היא חלק חיוני של מכונות translational ב מכל יצור. tRNAs לאגד, להעביר חומצות אמינו הריבוזום התרגום. רמות היחסי של tRNAs שונים, ואת היחס בין aminoacylated tRNA ל tRNA סה כ, המכונה רמת הטעינה, הם גורמים חשובים בקביעת את הדיוק ואת המהירות של תרגום. לכן, השפע ואת רמות טעינה של tRNAs הם משתנים חשובים כדי למדוד כשלמדתי סינתזה של חלבון, לדוגמה בתנאים מתח שונים. כאן, אנו מתארים שיטה קציר tRNA ומדידת ישירות את השפע היחסי והן לרמה טעינה המוחלטת של מינים tRNA ספציפי של Escherichia coli. סינתזת האיסוף-כך הקשר יציב בין סינתזת של חומצת אמינו שלה נשמר. ה-RNA ואז נענשים בג'ל, צפון סופג, שתוצאתה הפרדה tRNAs טעון, לא טעונים. ניתן להשוות את הרמות של tRNAs ספציפיים בדגימות שונות בשל התוספת של ספייק תאים עבור נרמול. לפני טיהור RNA, נוסיף 5% של תאים e. coli תאגידי ענק בינלאומיים tRNAselC נדירים כדי כל דגימה. כמות המינים tRNA עניין במדגם ואז מנורמל לסכום של tRNAselC במדגם זהה. תוספת של ספייק תאים לפני טיהור RNA יש היתרון על תוספת של מטוהרים ספייק-in RNAs זה הוא גם מהווה ההבדלים יעילות פירוק התא בין הדגימות.

Introduction

הבאות, אנו מציגים שיטה לכימות tRNAs ספציפיים, מדידת הטעינה שלהם רמות על ידי סופג בצפון '. השיטה מבוססת על טכניקה שפותחה על ידי. Varshney et al. 1. מאת קציר תאים לתוך חומצת חומץ טריכלור (TCA) ולשמור את הדגימות ב-0 מעלות צלזיוס במהלך הטיהור RNA, אסתר הקשר בין של tRNA, חומצת אמינו ביותר הוא שנשמרת2,3,4. Aminoacylated tRNAs ניתן להבדיל בין המקבילים nonacylated על ידי אלקטרופורזה בג'ל סופג בצפון, בשל ניידות ירידה של aminoacylated סינתזת הג'ל, הנגרמת על ידי חומצת אמינו מאוגד covalently5. בנוסף, אנו מציגים עבור נרמול tRNA כמויות על ידי תוספת של ספייק תאים overexpressingselC tRNA נדירות 4פרוטוקול.

tRNAs הם חלק המולקולות הנפוץ ביותר של התא חיידקי לבין תפקיד חיוני ביותר של מכונות תרגום. tRNAs לאגד חומצות אמינו ומעבירים אותם אל הריבוזומים התרגום. הכריכה של חומצות אמינו כדי tRNAs (aminoacylation או טעינה) בהנחייתם של aminoacyl tRNA synthetases. שפע יחסי של tRNAs טעון שונים חשוב להבטחת נאמנותם של סינתזת חלבונים, כי underrepresentation של cognate טעונה ש-trna עבור codon RNA שליח נתון (mRNA) מגבירה את הסבירות tRNA בקרבת מקום ל- cognate בטעות לספק שלו חומצת אמינו פוליפפטיד גוברת על הריבוזום6. החשיבות של tRNA טעונה באה לידי ביטוי נרחב התגובה של תא החיידק ירידה חמורה ברמות טעינה של tRNA; התגובה מחמירים. במהלך התגובה מחמירים הסינתזה של tRNAs, ribosomal RNAs mRNAs רוב הוא הוריד לטובת שעתוק של mRNAs ספציפיים הקשורים ההישרדות ביוסינטזה ומתח חומצת אמינו, קצב גדילת התאים היא יורדת באופן דרמטי7 . יתר על כן, עבודה על-ידי, ואחרים הראו כי e. coli פעיל מבזה הרוב המכריע של tRNA שלה בתגובה מדגיש כי להגביל תרגום4,8, רומז כי ייתכן ההתאמה של רמות tRNA חשוב להתמודדות עם לחצים כזה. לפיכך, אמין מדידות של רמות tRNA abundances וטעינה יהיה כלי חשוב להבנת מלא תגובות הלחץ חיידקי.

E. coli הוא נפוץ לבטא חלבון רקומביננטי, עקב הבדלים השימוש codon בין המינים, שיוצרת הביטוי הוא בעיה בפני9. זה אוכל מצויין הביטוי של tRNAs נוספים הדרושים כדי לתרגם את ה-mRNA רקומביננטי10. מדידות של tRNA טעינה רמות זנים כאלה יכול להנחות המאמצים לפתרון בעיות ולעזור למטב את ביטוי חלבון.

שיטה זו גם מאפשרת הגילוי של "mischarging"; מולקולת tRNA aminoacylated חומצה אמינו בלתי-cognate. Aminoacylation על ידי חומצות אמינו שונות עלולה לגרום של tRNA להעברת במהירויות שונות במקצת דרך לזיהוי ג'לים1,11. במקרים מסוימים, השיטה יכולה לשמש גם כדי להבחין בין דפוסי השינוי שונה על tRNAs אחרת זהה3.

עוד הקים הליך הביוכימי עבור החקירה של tRNA טעינה רמות הוא periodate חמצון. השיטה מסתמכת על התצפית כי aminoacylated tRNA מוגן מפני periodate חמצון ואינו tRNA לא טעונים. אחרי periodate חמצון טיפול לחידוש tRNA משמש להערכת רמת הטעינה הרנ א שנקטפו. עם זאת, לחידוש מספר tRNAs הוכח להיות מושפעות הטיפול ובכך לספק כמה דיוקים12. השיטה המוצגת כאן אמצעים טעינה ישירות מ- RNA מטוהרים, ובכך לא כולל שום הטיות של תגובות כימיות או אנזימטיות. מגבלה אחת של שיטה זו היא ובדיו tRNA אחד בלבד מזוהה בכל פעם, כך למרות הצפוני אותו כתם יכול להיות חשוף reprobed עבור tRNAs מרובות, זה במידת מה ההגדרה המפורטת לאסוף נתונים על tRNAs רבים.

דרך אמינה של נורמליזציה דוגמאות לשני חיוני בלימודי שבו המטרה היא להשוות בין רמות היחסי של מולקולה מדגמים שונים. כאן נסקור תהליך הנורמליזציה של רנ א שבו aliquot קטן של תאים e. coli overexpressing את סינתזת נדירselC נוסף של ספייק-in כל הדגימות ניסיוני לפני טיהור RNA. שיטה זו שימושית לא רק בעת בחינת tRNAs אך על כימות היחסי של כל המינים של RNA כאשר הגדרת הניסוי הוא כזה כי אין RNA אנדוגני ניתן לבטוח יהיה להציג ריכוז הסלולר זהה כל הדגימות. לדוגמה, הרמה של "משק", כמו ה-RNA ribosomal RNA משמשת לעתים קרובות כמו הפניה אנדוגני להשוות כמויות יחסיות של RNA אחר בין שונים דוגמאות13. אבל זה לא ממש עוזר אם ריכוז RNA הפניה הסלולר משתנה בין דגימות, יכול להיות המקרה ribosomal RNA אם הדגימה מתרחשת במהלך16,17 15,התגובה מתח או במהלך כניסתו נייחים שלב17. התוספת של ספייק תאים כדי הדגימות ניסיוני לפני טיהור RNA מספק דרך מלא ומדויק של נרמול עצמאית של ההתקנה הדגימה. דרך נוספת של סטנדרטיזציה היא התוספת של אחד או יותר בספייק RNAs כדי הדגימות ניסיוני לאחר טיהור RNA. עם זאת, שיטה זו לא בחשבון ההבדלים ב RNA שחזור בין הדגימות.

באמצעות תאים e. coli overexpress את ההפניה RNA כמו ספייק תאים (ראה איור 1) בניסוי ב e. coli הוא החיסרון שנוצר זה בנוסף של כמות קטנה של אקסוגני e. coli סה כ RNA ל דוגמאות. אנחנו תקן עבור תוספת זו על-ידי ניתוח מדגם המכיל רק ספייק תאים במקביל הדגימות ניסיוני (ראה הצפוני כתם במסלול איור 2, עם התווית "selC"). פרוטוקול הציג זה פותח עבור e. coli K-12 אך צפוי להיות ישימים עבור רוב המינים חיידקי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-הכנת תרביות חיידקים.

  1. לגדול כל התרבויות Erlenmeyer מבחנות עם יחס נפח תרבות/הבקבוקון של לכל היותר 1/6. הגדרה ניסויית טיפוסית, צומחים התרבויות ב 37.0 ° C, ומנענע ב 160 סיבובים לדקה morpholinepropanesulfonic חומצה (MOPS) מינימלי בינוני 18 בתוספת מקור פחמן מועדף, לדוגמה 0.2% גלוקוז, במשך לפחות 10 דורות רצופים לפני הקטיף רנ א.
  2. יום לפני הקציר RNA, לדלל תרבות outgrown של המתח הרצוי במדיום מינימלי המגבים באופן כזה כי הוא יגיע OD הרצוי של 436 בזמן הרצוי ביום המחרת. חישוב הנפח של תרבות גדולים מדי לשימוש עבור חיסון באמצעות הנוסחה:
    Equation 1
    הערה: כאן, OD החדש מציין את יתר הרצוי 436 לאחר דגירה, V חדש מציין את אמצעי האחסון של התרבות מדולל, OD הישן מציין את יתר 436 של התרבות outgrown מדולל מ, G מציין את מספר דורות התרבות יגדל, החל הזמן של דילול (t 1) לזמן זה צורך יום אחרי (t 2), יכול להיות מחושב כמו: זמן ההפרש (בדקות) בין t 1 ו- t 2 חלקי הזמן דור (בדקות). כדי להבטיח צמיחה יציבה בזמנו של הדגימה, G צריך להיות ≥ 10; V הישן מציין את אמצעי האחסון של התרבות מבוגר יותר יש להעביר המדיום טריים. המשוואה הזו היא הערכה לא להסביר כל שלב לג; תופעה נצפתה לעיתים קרובות לאחר דילול של תרבות יותר בוגר בתקשורת טריים.
    1. תנאי הגידול ישתנו בהתאם מטרת הניסוי, אבל כדי להגביל לתא וריאציה ברמות tRNA וכדי להגדיל את הפארמצבטית של התוצאות, (מומלץ) לגדול התרבויות לייצב למצב שלפני דגימה 19.

2. הכנה של תאים ספייק

הערה: המתח e. coli MAS1074, אשר מבטאת את הגן selC קידוד tRNA selC תחת השליטה של איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)- יזם inducible משמש המתח ספייק-ב.

  1. Dilute תרבות outgrown של MAS1074 יתר 436 0.05 ב MOPS בינונית מזערי בתוספת 100 אמפיצילין µg/mL ו- 0.2% גלוקוז. לגדול התרבות ב 37 מעלות צלזיוס רועדת-160 סיבובים לדקה.
    הערה: ראה את הדיון לשימוש של זן התייחסות חלופית.
  2. OD-436 ~ 0.1, להוסיף IPTG ריכוז סופי של 1 מ מ לזירוז הביטוי של tRNA selC. לגדול התרבות יתר 436 ~0.5 (~ 3-4 h של צמיחה) לעבור את הבקבוקון תרבות אמבטיית קרח. לשמור על התרבות התא ספייק-אין על הקרח עד כל דוגמאות לטיהור RNA נקצצו.

3. הקציר של דגימות ניסיוני.

  1. חם מראש (37 מעלות צלזיוס) אחד הכתיר 100 מ ל Erlenmeyer את הבקבוק (או דומה) המכילה 4 מ ל 10% (w/v) חומצת חומץ טריכלור (TCA) עבור כל דגימה על-ידי הצבתו באמבט מים מחומם.
    הערה: זהירות, TCA מפרקת על חימום, מפיק אדים רעילים, מאכל כולל מימן כלורי, כלורופורם. הפתרון במים הוא חומצה חזקה; הוא מגיב באלימות עם בסיסים, שמשחית מתכות רבות. נאות אמצעי זהירות יש לנקוט בעת שימוש הנוזל.
  2. מייד לפני הקציר תא, למדוד ולהקליט את יתר 436 של התרבות.
  3. למסוק את התאים, להעביר 4 מ"ל של תרבות בקבוקון ומחוממת מראש הכולל TCA.
  4. לערבב את הדגימה על ידי מתערבל את הבקבוקון בעבודת יד 5 ס' מיקסינג עם TCA מיד מבטלת פעילויות אנזימטיות הכל, ובכך שומרת על רמות טעינה של tRNAs.
    הערה: אם מספר דוגמאות יש לאסוף, לשמור דגימות שנקטפו ב- TCA על הקרח עד כל דוגמאות שנאסף.

4. תוספת של תאים ספייק

הערה: הכנה של תאים ספייק מתואר בשלב 2.

  1. כאשר כל דגימות להכנה RNA נאספו, להוסיף 5% ספייק תאים (מבוסס על יתר) כל דגימה.
    הערה: הנפח של תרבית תאים ספייק-אין צורך מחושבת באמצעות הנוסחה:
    Equation 2
    שם V ספייק מציין את עוצמת הקול של תרבית תאים ספייק-אין צורך, V exp מציין את אמצעי האחסון של תרבית תאים ניסיוני שנקטפו (ללא TCA), OD exp מציין את יתר 436 של התרבות תאים ניסיוני בזמן הקציר לתוך TCA. OD ספייק מציין את יתר 436 של התרבות ספייק-בתא. אם מספר דוגמאות נקצרים-לקיחת שונים, הנפח של ספייק תאים נוסף צריך להיות מותאם על פי הנוסחה לעיל עבור כל דגימה.
  2. לכמת את התרומה מתאי ספייק-in המינים RNA של עניין, להכין מדגם בלבד המכילה תאים ספייק על-ידי ערבוב מ ל 4 תאים ספייק 4 מ ל TCA. להכין RNA מהדגימה הזה באותה הדרך הדגימות אחרים.
  3. אופציונלית, לקחת את הבקבוק אחר המכיל רק את הדגימה ניסיוני, ללא תאים ספייק, ולכלול אותו כדי לכמת את התרומה של המדגם ניסיוני ל tRNA רמות selC; הרמות אנדוגני של tRNA selC ב E. coli K-12 נמוכים החזרה.

5. הכנה של RNA

הערה: פרוטוקול הכנה RNA המתוארים כאן הוא בעיקרו המתוארת על-ידי. Varshney et al. 1; כדי להימנע deacylation של tRNAs aminoacylated במהלך טיהור, חשוב לשמור את הדוגמאות ב- pH חומצי ב-0 מעלות צלזיוס לאורך כל הקורס של טיהור. צינורות סטרילי נקי/צלוחיות להחזיק את דוגמאות ופתרונות ושימוש להכין כל הפתרונות עם הנדסה גנטית (18.2 MΩ·cm resistivity) מים-

  1. יוצקים 8 מ ל כל מדגם לתוך שפופרת קרח צונן צנטריפוגה. צנטריפוגה דגימות 10 דקות ב 9,500 g x-4 ° C. לחלוטין להסיר תגובת שיקוע ו resuspend ב 0.3 mL קר 0.3 M סודיום אצטט, pH 4.5 ו-10 מ מ EDTA.
  2. להעביר כל מדגם צינור microcentrifuge קר 1.5 מ"ל ולהוסיף פנול 0.3 mL equilibrated עם המאגר אותו.
    הערה: זהירות, פנול מייצר גזים רעילים והוא מאוד שמשחית העור.
  3. מערבולת כל לדגום 10 x 15 s לפחות 1 דקות בין כל מערבולת. בין vortexing שומרים את הדגימות ב 0 מעלות צלזיוס להשתמש ההפסקות בתדירות גבוהה כדי להבטיח כי הדגימות יישארו קר.
  4. צנטריפוגה דגימות למשך 15 דקות ב 20,000 g x 4 ° C. העברת השלב מים (שלב העליון) כדי microcentrifuge 1.5 mL החדש צינורות. הוספת פנול קר 0.3 mL ו- s מערבולת 4 x 15 כבעבר.
  5. צנטריפוגה 10 דקות ב 20,000 g x 4 ° C. העברת השלב מים כדי microcentrifuge חדש, קר mL 1.5 צינורות המכיל פי 2.5 הנפח של 96% אתנול (µL ~ 750). לזרז את הרנ א מאת המקננת הצינורות עבור h 1 ב-20 ° C או ללון ב-80 מעלות צלזיוס
  6. צנטריפוגה דגימות למשך 30 דקות ב 20,000 g x-4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע והוסף בזהירות 1 מ"ל אתנול 70% קר מבלי להפריע בגדר RNA. בעדינות ' היפוך ' פעם אחת כדי לשטוף את הקרביים של הצינורות עם אתנול.
    הערה: בגדר יכולה להיות קשה לראות בשלב זה.
  7. צנטריפוגה 10 דקות ב 20,000 g x 4 ° C. לחלוטין להסיר את תגובת שיקוע, מילה נהדרת בגדר עד אתנול לא נשאר. Resuspend בגדר מאת נמרצות vortexing ב- 20 µL קר 10 מ"מ סודיום אצטט pH 4.5 ו- 1 מ"מ EDTA.
    הערה: לא יתר לייבש בגדר כפי יהפוך שקשה resuspend.
  8. אופציונלית, להעריך את הריכוז של ה-RNA על ידי מדידת ספיגת ב-260 nm.
  9. אופציונלית, להעריך איכות RNA מטוהרים agarose ג'ל אלקטרופורזה 20-
  10. מאגר דגימות ב-80 מעלות צלזיוס
    הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.
< p class= "jove_title" > 6. הכנת מבחינה כימית deacylated הבקרה מדגם

הערה: כדי להבחין בין הלהקה של aminoacylated tRNA המקביל deacylated על הצפון כתם, מבחינה כימית deacylated aliquot מוכן על ידי טיפול אלקליין. עבור מרבית המטרות, זה מספיק כדי deacylate דוגמה אחת עבור כל כתם הצפוני.

מדגם
  1. להפשיר הרנ א על קרח. העברה של aliquot 4 µL המדגם RNA צינור חדש. הוסף µL 46 טריס-HCl pH 9.0. תקופת דגירה של 2 h ב 37 º C
  2. להוסיף 15 µL של 0.3 M סודיום אצטט ב- pH 4.5, להוסיף לאחר מכן µL 125 של 96% אתנול. לזרז RNA ב-20 ° C עבור ה 1
  3. צנטריפוגה למשך 30 דקות ב 20,000 g x 4 ° C. לחלוטין להסיר את תגובת שיקוע ו resuspend ב 4 µL 10 מ מ קר סודיום אצטט pH 4.5 ו- 1 מ מ EDTA.
    הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן, אם המדגם מאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס

7. ג'ל אלקטרופורזה החיוורים ומכתים בצפון

  1. µL לערבב 4 מדגם (ללא טיפול או כימית deacylated) עם µL 6 טעינת מאגר (0.1 M סודיום אצטט (pH 5.0), שמונה מ' שתנן, 0.05% bromophenol כחול, ו 0.05% קסילן cyanol).
    הערה: לזכור לכלול המדגם שמכילה רק ספייק תאים, מבחינה כימית deacylated מדגם (וגם את הדגימה בלי ספייק תאים, אם אחד לא היה מוכן).
  2. לטעון את הדוגמאות על 0.4 מ מ עבה 6.5% לזיהוי ג'ל (19:1 acrylam - ide:bisacrylamide) המכילה אוריאה 8 M 0.1 M סודיום אצטט מאגר (pH 5.0). השתמש ג'לים ארוך 60 ס מ על הפרדה נאותה של מינים tRNA.
  3. נפרד הרנ א על ידי אלקטרופורזה-ג'ל V/ס מ 10-4 מעלות צלזיוס, עד bromophenol הכחול מגיע לתחתית של הג'ל (~ 20 h).
  4. האזור של קסילן cyanol לצבוע ו- 20 ס מ למטה לכיוון הכחול bromophenol צבע משמש עבור סופג (המרחק בין שני צבעים צריך להיות 25-30 ס"מ). הפרד בזהירות את שתי הזכוכיות, כך הג'ל נשאר על אחד מהם. פיסת נייר סינון דק חתוך לגודל של blotting באזור הרצוי, הממוקמת מעל החלק של הג'ל שישמש עבור סופג. החלקים של הג'ל שאינם מכוסים על-ידי מסנן נייר חתוך, שנזרקו. להשתמש נייר הסינון בזהירות להרים את החתיכה ג'ל הרחק לוח הזכוכית.
    הערה: הג'ל גדול שברירית מאוד אז לטפל.
  5. קרום ניילון הטעון חיובית (למשל ממברנה N Hybond +) מונחת על גבי הג'ל וזה electroblotted בגיל 20 V במשך 90 דקות באמצעות 40 מ מ טריס-אצטט (pH 8.1), 2 מ מ EDTA כמו מאגר העברה.
  6. Crosslink הרנ א למוח באמצעות UV-אור (0.12 J/cm 2).
    הערה: ניתן לאחסן את הקרום עכשיו בטמפרטורת החדר, ניתן להשהות את הפרוטוקול פה.

8. תכנון ואימות של הגששים

הערה: זהיר תכנון ואימות של הגששים חשופה הצפוני הוא חיוני כדי להשיג תוצאות אמינות והימנע הצלב-הכלאה בלתי רצויים עם מינים אחרים רנ א.

  1. שימוש oligonucleotides סינתטי קצר כמו הגששים. לעצב את רצף בדיקה בדרך כי זה משלים את החלק הייחודי ביותר של הרצף של tRNA עניין - בדרך כלל מדובר הלולאה anticodon.
    הערה: רשימת רצפי tRNA החזוי של אורגניזמים שונים ניתן למצוא את סינתזת גנומית מסד נתונים (GtRNAdb) 21-
  2. התאם אורך הרצף להשיג החזוי של נמס בטמפרטורה של 55-65 מעלות צלזיוס.
  3. הפיצוץ (בסיסי מקומי חיפוש הכלי יישור) הנבחר רצף נגד רצף הגנום של המתח בקטריאלי בשימוש הניסוי, כדי לוודא כי הרצף הוא ייחודי tRNA שנבחר, כמתואר ב- 22-
    הערה: טבלה 1 מציגה רצפי בדיקה המוצע עבור מספר tRNAs שונים של e. coli K12. אם המכשיר הוא ספציפי tRNA עניין, רק שתי להקות גלויים על האבן החשופה הצפוני (tRNA טעון, לא טעונים), הלהקה היחיד הוא גלוי בנתיב עם הדגימה deacylated (tRNA לא טעונים). אם יותר משתי להקות קיימים או אם נוסף רצוי אימות היחודיות בדיקה, ראה דיון.

9. הכלאה של כתם בצפון

הערה: בשלבים הבאים, הקרום ברצף hybridized עם הגששים משלים tRNAs הספציפי הרצוי, כולל בדיקה מסוימת עבור ההפניה tRNA selC.

  1. למקם את הקרום בשפופרת הכלאה, להוסיף 6 מ ל הכלאה פתרון (0.9 M NaCl, 0.05 M NaH 2 PO 4 (pH 7.7), 5 מ מ EDTA, 0.5% (w/v) מרחביות, 100 מ"ג/מ"ל של לכסנתם, שפגע בסימני הרינג זרע DNA ו 5 x Denhardt ' פתרון s (100 x Denhardt ' s פתרון = אלבומין שור 2%, פוליוינילפירולידון 2% 40 ו- 2% Ficoll)).
  2. Hybridize מראש את הקרום במאגר עבור h 1 מסתובב ב 42 ° C. להוסיף 30 pmol רדיואקטיבי oligo-DNA בדיקה 5 ' - end - שכותרתו עם 32 P (שהוכן כפי שתואר על ידי. Sambrook et al. 23)
    הערה: זהירות, פליטת אנרגיה גבוהה בטא 32 P יכול להציג על העור ניכר, עין במינון הזארד. נאות אמצעי זהירות יש לנקוט כאשר באמצעות 32 פסולת רדיואקטיבית פ צריך להיות מסולק לפי הפרוטוקולים בטיחותי מוסדי מתאים.
  3. דגירה החללית עם קרום לילה מסתובב ב 42 ° C. הסר המכשיר באמצעות פיפטה של 10 מ"ל חד פעמיות-
    הערה: אם לאחסן במקפיא המכשיר ניתן להשתמש בהם.
  4. בצינור הכלאה, לשטוף את הקרום זמן קצר ב 50 מ של 0.3 M NaCl, 30 מ מ סודיום ציטרט, 0.1% (w/v) מרחביות בטמפרטורת החדר.
    הערה: זו שטיפת הראשון מכיל הרבה לא מאוגד בדיקה, חייבים להיות מטופלים כמו רדיואקטיבי.
  5. חזור על צעד 9.4 פעם אחת ולאחר מכן להעביר את הקרום מיכל פלסטיק שטוחים או מגש כולל מכסה. מכסה את הקרום עם הפתרון כביסה (0.3 M NaCl, 30 מ מ סודיום ציטרט, 0.1% (w/v) מרחביות), דגירה זה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. לשנות את הפתרון כביסה ולהמשיך את הכביסה עד אות מספק יחס הרעש התקבל (לעיתים קרובות שינויים 3-4 פתרון לרחוץ). להשתמש שפופרת גייגר-מילר כדי לזהות כיצד הרעש אות יחס משתנה על ידי מדידת הקרינה של אזור ריק של הקרום ולהשוות אותם לאזור שבו המכשיר יש hybridized במיוחד כדי tRNA.
  7. כדי להיות מסוגל לפרק את המכשיר מהקרום לאחר החשיפה, ודא כי (חשוב) הקרום לא יתייבש לפני ההליך חשפנות. למקם את הקרום דק שקית פלסטיק או לעטוף אותו בחוזקה באמצעות פלסטיק לעטוף ויסגור שזה יהיה אוויר חזק על ידי קלטת או ריתוך. מקם את הקרום אטום על מסך phosphorimaging.
    הערה: זמן החשיפה הדרוש על המסך phosphorimaging נקבעת על-ידי פעילות ספציפיים של החללית, הכמות של RNA ובחן for, ואת היעילות הכלאה של החללית, וכן יכולים להשתנות במידה רבה; בין מספר דקות עד מספר ימים. עם ניסיון, עוצמת הקרינה זוהה על הקרום עם שפופרת גייגר-מילר נותן סימן טוב זמן החשיפה הדרוש. על כימות אמין, זה חשוב כי המסך לא חשיפת.
  8. לסרוק את המסך phosphorimaging משתמש בסורק לייזר ולשמור את הקובץ ב- " הג'ל " תבנית.
    הערה: אות גבוהה יחס הרעש הוא הכרחי עבור כימות אמין. בודק את tRNA יביא שתי להקות; אחד aminoacylated המכיל tRNA (העברה איטי), אחד deacylated המכיל tRNA (העברה מהירה יותר). ראה איור 2-

10. מפשיטים את הקרום

הערה: לפני הקרום פתור עבור tRNA אחר, המכשיר הקודם קודם להסירו על ידי הפשטת את הקרום.

  1. חום מספיק הפשטת מאגר (15 מ"מ NaCl, 1.5 מ מ סודיום ציטרט, 0.1% (w/v) מרחביות) כדי לכסות את הקרום ואשפוך אותם הקרום. דגירה זה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. חזור על שלב 10.1 עד אין קרינה יכולה להתגלות עם שפופרת גייגר-מילר; הקרום עכשיו יכול להיות מחדש hybridized ביצוע השלבים המתוארים בסעיף 9-

11. לכימות tRNA וטעינה רמות

  1. לטעון הקובץ הג'ל לתוך ההדמיה תוכנה (ראה את הטבלה של חומרים). לצייר קו אנכי לאורך כל אחד המסלולים מדגם בצורה כזו כי זה משתרע על פני רוב רוחב השביל אך אינה כוללת את הקצוות של הלהקות שבו האות יכול להיות אחיד, כפי שמוצג איור 3 א.
  2. Visualize נחשב ליין כל על ידי לחיצה " ניתוח "-> " ליצור גרף ". להגדיר באופן ידני את שתי הפסגות המייצגים את הטעון של tRNA לא טעונים כל ליין, כפי שמוצג באיור 3B.
  3. לקבל ספירות מפסגת כל על-ידי לחיצה על " ניתוח "-> " הדו ח ", ולהקליט את האזור תחת כל אחד שתי הפסגות.
  4. כאשר יש כבר ובחן את האבן החשופה tRNA selC, סינתזת אחד לפחות של עניין, לנרמל את הרמות של tRNA עניין tRNA selC.
    1. לחשב את הפרופורציה של tRNA שמקורם התאים ספייק-אין כל ליין ולחסר האות הכולל בנתיב הזה באמצעות המשוואה:
      Equation 3
      הערה: הנה, לטעום tRNA = האות המתקבל נתיב אחד קרום ובחן עבור סינתזת הרצוי; מדגם selC = האות המתקבל באותו הנתיב של קרום זהה ובחן עבור tRNA selC; Ref tRNA = האות המתקבל השביל המכיל רק ספייק-ב תא RNA של קרום זהה ובחן עבור סינתזת הרצוי; Ref selC = האות המתקבל השביל המכיל רק ספייק-ב תא RNA של קרום זהה ובחן עבור tRNA selC.
    2. לנרמל, לחלק את הערך tRNA מתוקן כל ליין ע י האות selC tRNA מ באותו הנתיב.
      הערה: התרומה של האות selC tRNA מתאי שנדגם הוא זניח (ראה איור 2, ליין הנקרא "-selC ").
  5. לחשב את סינתזת טעינה ברמת עבור כל ליין על-ידי חלוקת האות השיא המייצג tRNA טעון עם הסכום של האות מ שתי הפסגות (טעון + לא טעונים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות ההליך המתואר כאן, השפע וטעינה רמות של tRNAs שלושה נמדדו ב e. coli K-12 לפני ובמהלך חומצת אמינו הרעבה.

Auxotroph ארגינין זן NF9154 (חמישי leu שלו טוב thi mtl supE44) הוא גודל לפחות עשרה דורות במדיום מינימלי MOPS בתוספת גליצרול 0.4% 50 תראונין µg/mL, לאוצין, ארגינין, µg 5/mL היסטידין ב 37 מעלות צלזיוס רועדת 160 סיבובים לדקה. ארגינין הרעבה הוצג על-ידי סינון של התרבות, resuspension טריים בינוני MOPS כמו לעיל, אך ללא ארגינין. במהלך ארגינין רעב, סינתזה של חלבון מצטמצם מאוד, אך ממשיכה ברמה נמוכה באמצעות ארגינין שפרסם המחזור של חלבונים קיימים. דוגמאות נבצרו בזמנו נקודות ציינו באיור4. לאחר כל דוגמאות נקטפו לתוך TCA, 5% מהתאים MAS1074 ספייק-in overexpressing tRNAselC, נוספה כל מדגם כמופיע ב איור 1. RNA הייתה לטהר מדגימות, כשהם מופרדים באמצעות אלקטרופורזה, מחק על גבי קרום כמפורט בפרוטוקול. הקרום נבדקה tRNAargVYZQ, tRNAgltTUVW, סינתזתלרגל זכייתו בפרסשל tRNAselC, כפי שניתן לראות באיור2. האות קרינה כל ליין היה לכמת עבור כל אחד הגששים ארבע כמו מאויר איור 3, ואת המתוקן מנורמל כמתואר בסעיף 11. התוצאות מוצגות באיור4. איור 4A מציג הרמות של כל המינים שנבדקו tRNA להקטין במהירות במהלך רעב חומצת אמינו, כפי שדווח לאחרונה4. איור 4B מראה כי את סינתזת טעינה רמות להתנהג בצורה בלתי צפויה: השבר טעונה של tRNA ארגינין-קבלת טיפות במהירות על הסרה של ארגינין מכל מדיום הגידול, ואילו רמות טעינה tRNAs אחרים להגביר מעט על רעב בגלל טעונה tRNAs לצבור כאשר התעריף decharging על הריבוזומים פוחתת עקב חוסר המצע סינתזת חלבון4. עוד יותר לתוך תקופת הרעבה, השבר tRNA טעונה מקטין לרמות כ קדם רעב בשל ההשפלה של הרוב של הבריכה tRNA (איור 4A), אשר גורמת ב שיעור גדול יותר של decharging של tRNAs הנותרים- הריבוזומים. לעומת זאת, השבר טעונה של tRNAargVYZQ מגביר לפחות משתי סיבות; 1) הפעלה של התגובה מחמירים משמעה mRNA, אינו מחויב tRNAarg, הופך להיות הגורם המגביל של תרגום 2) הבריכה הכולל של tRNAarg הוא מופחת (איור 4A) אז חלק גדול יותר של tRNA הכוללarg ניתן לחייב באותה מידה קטנה של ארגינין. הניסוי הזה מדגים איך המדידות בו זמנית שפע tRNA, רמות טעינה tRNA מספק מידע איכותי אודות תנאי סינתזת חלבונים בתוך התא.

Figure 1
איור 1. תוספת של ספייק תאים כדי דגימות. בדוגמה זו, דגימות תרבות של e. coli NF915 נקצרים בסדרה זמן לפני. ובמהלכו חומצת אמינו הרעבה. תיאור סכמטי של עקומת הגדילה של NF915 מוצג, שבו נקודות כחולות לציין את הנקודות של מדגם הקציר. Y-axes הם גודל יומן רישום. דוגמאות culture(s) ניסיוני נקצרים כמתואר בסעיף 3. תיאור סכמטי של עקומת גדילה של המתח ספייק ב- MAS1074 מוצג גם, עם הנקודה של קציר המדגם ציין כמו נקודה כחולה. הנקודה של הדמות היא כדי להמחיש כי כל הדגימות ניסיוני (של e. coli NF915 בדוגמה זו) מקבלים על aliquot של תאים ספייק מתרבות התייחסות זהה. כל מדגם, 5% של תאים ספייק מתווספים לתאי ניסיוני, מחושב בהתבסס על OD של התרבויות תא (ראה סעיף 4). לאחר מכן, ה-RNA הוא מכל הדוגמאות ונועד לשמש שהכלים בצפון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. פוספור imager סריקה של אבן חשופה הצפוני ובחן עבור tRNAs המצוין. הקרום מכיל רנ א בגלל הלחץ e. coli NF915 שנקטפו בנקודות זמן שצוין לפני ואחרי אינדוקציה מרעב ארגינין (דקות). בנוסף, הקרום מכיל שני מסלולים של דגימות שבו הושמט תאים ספייק (-selC DA ו- selC), נתיב המכיל RNA של ספייק-in של תאי היחידה (selC). המדגם - selC DA מכיל מבחינה כימית deacylated tRNA. שתי הלהקות המייצג את טעונה לא טעונים tRNA מינים מופרדים בצורה ברורה. הערה שהאות זניח של tRNAselC בסמטאות נוספים ללא תאים ספייק. קרום זהה במרוכז המושפל, reprobed עבור tRNAs המצוין בצד השמאל. באזור האבן החשופה העליון מסגרת מציין את החלק של האבן החשופה, אשר מוצג עבור probings tRNA עוקבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3. כימות של כתם הצפוני. שפע tRNA נמדד באמצעות תוכנה. (א) A נתיב אחד מן האבן החשופה הצפוני ראה איור 2 ובחן עבור tRNAargVYZQ. החץ העליון והתחתון מציינים את aminoacylated tRNA, את deacylated tRNA, בהתאמה. הקווים האדומים פועל במקביל עם השביל הוסיף ומשמשת להגדרת האזור על כימות. (B) כימות של האות בתוך הקווים האדומים שבור שני ראיתי ב- (א) מתואר בתור גרף, שבו הציר האופקי מציין את המרחק מהחלק העליון של הקו ב (א) (בפיקסלים), הציר האנכי מציג את עוצמת האות (סעיפים). שתי פסגות שמקורם אות המכיל aminoacylated tRNA, את deacylated tRNA, בהתאמה, הם מוגדרים באופן ידני. הנתונים המיוצאים לצורך ניתוח נוסף הוא הערך המתאים לאזור תחת כל אחד שתי הפסגות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
באיור 4. נציג תוצאה: כימות של tRNA abundancesd טעינה רמות במהלך ארגינין רעב. כימות של הלהקות האבן החשופה הצפוני באיור 2. (א) היחסית שפע של tRNAgltTUVW (אדום), tRNAargVYZQ (כחול), סינתזתלרגל זכייתו בפרס (ירוק). רמת ב אפס דקות (דוגמאות שנקטפו רק לפני תחילתה של רעב) מוגדרת ל- 1. (B) טעינה רמת tRNAs שלוש אותו כמו (א). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

בדיקה ירידה לפרטים בדיקת רצף
tRNAargVYZQ 5'-TCCGACCGCTCGGTTCGTAGC
tRNAgluTUVW 5'-CCTGTTACCGCCGTGAAAGGG
tRNAhisR 5'-CACGACAACTGGAATCACAATCC
tRNAleuPQVT 5'-GTAAGGACACTAACACCTGAAGC
tRNAleuU 5'-TATTGGGCACTACCACCTCAAGG
tRNAleuW 5'-CTTGCGGCGCCAGAACCTAAATC
tRNAleuX 5'-TATTTCTACGGTTGATTTTGAA
tRNAleuZ 5'-AAAATCCCTCGGCGTTCGCGCT
tRNAlysQTVWYZ 5'-TGCGACCAATTGATTAAAAGTCAAC
tRNAthrV 5'-TGGGGACCTCACCCTTACCAA
tRNAtyrTV 5'-TCGAACCTTCGAAGTCGATGA
tRNAselC 5'-ATTTGAAGTCCAGCCGCC

טבלה 1. טבלה של רצפי בדיקה הציע tRNAs שנבחר ב e. coli K-12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד בו זמנית את רמת הטעינה ספציפי e. coli tRNAs ולהשוות רמות היחסי של tRNAs בדגימות שונות. נקודות קריטיות של הפרוטוקול הם 1) להתמודד עם הדגימות בצורה כזאת, כי רמת טעינה סלולארית tRNA נשמרות, 2) לנרמל את סינתזת כמויות כך שניתן יהיה להשוות בצורה אמינה רמות היחסי tRNA בדגימות שונות, ו- 3) על מנת להבטיח את sp ecificity של הגששים שנבחר עבור tRNAs עניין. נקודות אלה מופנים בנפרד למטה.

tRNA טיהור

TRNAs כבר טהור של e. coli בצורה עדינה ממוטבת כדי לשמור על רמות הטעינה הסלולרית שלהם. . זה הניסיון שלנו כי פרוטוקול זה בעיקר תמציות RNAs קצר יותר 150 nt, ובכך tRNA מהווה חלק גדול RNA מטוהרים. מסיבה זו, מומלץ לא להשתמש בפרוטוקול זה לטהר RNA הכולל מ- e. coli. פרוטוקול המובאת כאן צריך גם להיות מתאימים זיהוי, כימות של RNAs אחרים כגון RNA קטנים (sRNA) ללא כל עיבודים נוספים. כי הפרוטוקול החילוץ RNA מעשירה עבור רצפי RNA קצר זה גם צריך למצוא שימוש גם אם sRNA תחת חקירה מתבטא נחותה.

נורמליזציה על ידי תאים ספייק

כדי להשוות את הרמות של tRNA מדגמים שונים, זה הכרחי כדי לנרמל את רמות tRNA על הרמות של תעתיק כי קיים במספר הממוצעת זהה בכל תא כל הדגימות, על מנת לתקן מדגם-כדי-sample וריאציות ב- RNA שחזור וטעינה ג'ל. למטרה זו, אנו ספייק הדגימות עם 5% של תאים הפניה overexpress tRNAselC נדיר לפני טיהור RNA. השיטה בספייק כעדיפה על פני שימוש של RNA אנדוגני אזכור, כי היא מתירה את ההשוואה של tRNA רמות על פני תנאי שבו אין RNAs אנדוגני ידועים בוודאות ב ריכוז הסלולר זהה. באמצעות תאים e. coli ספייק-in יש החיסרון 5% תוספת e. coli RNA מתווסף כל הדגימות ניסיוני, איפה היא תורמת האות של RNA עניין. הנטיה הזו מהצהוב מאת כולל מדגם המכיל רק את ספייק תאים על כל פירצה בצפון, תיקון את ערכי ה-RNA כפי שמתואר בשלב 11.4.1. הביטוי של tRNAselC בתאים פראי סוג הוא כל כך נמוך לעומת אחרים tRNAs (ראה איור 2) שזה לא עושה הבדל משמעותי בכימות, ובכך יכול להיות מוזנחים. עם זאת, בנימה הפניה MAS1074, היכן selC מתבטאת על ידי יזם7 T על פלסמיד העתק גבוהה, אנו מעריכים כי לפחות 1,000-fold tRNA יותרselC מיוצר בנוכחות 1 מ"מ IPTG מזה המיוצר על ידי wildtype אי החיידק K-12 בשום מצב. MAS1074 מפסיק לגדול לאחר שני דורות האינדוקציה IPTG מלאה. בנקודה זו, הבדלים-לתרבות אינדוקציה של tRNAselC קטן, לא דאגה עבור פרוטוקול זה כמו כל aliquots של ספייק תאים עבור ניסוי יחיד לקוחים מן התרבות המושרה זהה של MAS1074. כחלופה MAS1074, תאים מן אורגניזם RNA אשר לא cross-react עם החללית הכלאה יכול לשמש גם תאים ספייק. תאים Sulfolobus solfataricus בהצלחה שימשו ספייק-in עבור ניסויים עם e. coli tRNA4. עם זאת, תאים ספייק e. coli הם נוטים לשקף באופן מדויק יותר את מידת פירוק התא של תאי ניסיוני, גם ככה לא בטוח אם ס' solfataricus הנה קטעי. העיתונים עם אותה יעילות כמו e. coli. בנוסף, גידול solfataricus ס הוא מייגע יותר ככל שהם גדלים ב 85 מעלות צלזיוס עם זמן דור של h ~ 16.

הבטחת יחודיות של tRNAs הנבחר

אם הן aminoacylated והן deacylated tRNA עבר בהצלחה להקות בשתי מזוכך שיזוהו על הקרום בצפון. המרחק בין שתי הלהקות ישתנו בהתאם tRNA ספציפי תחת חקירה, והוא תוצאה משולבת של ההבדל בגודל, תכונות קוטביות, קונפורמציה הגורמת חומצת אמינו מסוימת כאשר הוא נקשר של tRNA מסוים5 . לדוגמה, המרחק בין aminoacylated את deacylated את סינתזת גדול עבור tRNAargVYZQ מאשר tRNAgltTUVW, כפי שניתן לראות באיור2. בשל גודלו של הג'ל המשמש כאן כדי להפריד את הרנ א, הפתרון הוא מספיק גבוה לבידול tRNA טעונה לא טעונים, אלא גם להבחין רוב tRNAs שונים אחד מהשני בשל השוני שלהם אורך, רצף קומפוזיציה, שינוי דפוסים. ניתן להבחין tRNAs isoaccepting אפילו כמתואר עבור לאוצין קבלת tRNAs2. עם זאת, שים לב כי במחקר זה לא ניתן היה להבחין tRNAleuPQV של tRNAleuT, כמו ההבדל ברצף הוא רק אחד G כדי החלפת T.

אם יותר משתי להקות מופיע על הקרום בצפון זה יכול להיות תוצאה של cross-reaction של המכשיר עם אחרים RNAs. הגדלת את לכתחילה של השלב לשטוף (שלב 9.5) על ידי הגדלת הטמפרטורה בדרך כלל לפתור את זה. שוטף 30 דקות ב 55 ° C מספיקה בדרך כלל. אם הגדלת לכתחילה לשטוף את אינה מסירה קרוס-הכלאה, הפתרון ניתן לעצב מכשיר בדיקה חדשה משלים חלק (לעיתים קרובות חלקית חופפים) אחר הרצף tRNA. להקות נוספות ניתן גם carry-over של בדיקה קודמת, כתוצאה בנוכחות לא מספקת של הקרום. כדי למנוע זאת, לעשות רצועת פקד על ידי חשיפת הקרום לפני בדיקה מחדש. אם מופיעות להקות בסריקה שליטה הקרום עשוי להזדקק בנוכחות אחר נוסף. בדרך כלל ניתן לחקור מחדש ממברנה לפחות 8 - 10 פעמים אך לאחר מספר רגשים יכול להיות קשה להתפשט לגמרי. אם זה המקרה, ניתן לאחסן את הקרום במשך כמה חודשים לפני הבדיקה מחדש כמו 32P נרקב מהר.

אימות נוספות היחודיות בדיקה יכולה להיות מושגת על ידי ביצוע הצפוניים של כתם עם תאים שנקטפו תחת מערכת של תנאים איפה בתמליל עניין צפוי שיושפעו באופן צפוי. לדוגמה, ביטוי inducible סינתזת פלסמיד או חומצת אמינו הרעבה של חומצת אמינו cognate ביותר, צריך לגרום רמת ביטוי יחסי משופרת או טעינה רמה נמוכה יותר, בהתאמה, של tRNA עניין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים מרית Warrer על סיוע טכני מעולה. עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הדנית למחקר עצמאי | מדעי הטבע [1323-00343B], קרן המחקר הלאומי הדני [DNRF120].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Urea Merck 57-13-6 Purity >99%
Polyacrylamide Serva 79-06-7
Bis (N,N'-Methylene-bis-acrylamide) BIO-RAD 161-0201
Trichloroacetic acid (TCA) Sigma 76-03-9
Phenol Merck 108-95-2
IPTG
Glucose
Sodium Acetate
EDTA
Ethanol
Tris
Hydrochloric acid
Sodium Chloride
NaH2PO4
Sodium Citrate
SDS
Herring Sperm DNA Sigma 100403-24-5
BSA
Polivinylpyrrolidone
Ficoll
P32 γATP Perkin Elmer
DNA oligos (probes) TAG Copenhagen
Hybond N+ membrane GE Healthcare RPN203B
Crosslinker
Electroblotter BIO-RAD
Typhoon FLA 7000 Scanner GE Healthcare 28955809
Spectrophotometer
Hydridization oven
Geiger-Müller tube
Phosphor imager screen GE Healthcare
Hybridization tube
Culture Flasks
1.5 ml microcentrifuge tubes
20 ml centrifuge tubes
Name Company Catalog Number Comments
Software
ImageQuant GE Healthcare
Excel Microsoft

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Varshney, U., Lee, C. -P., RajBhandary, U. L. Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase. J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).
  2. Sorensen, M. A. Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy. J Mol Biol. 307 (3), 785-798 (2001).
  3. Krüger, M. K., Sørensen, M. A. Aminoacylation of hypomodified tRNAGlu in vivo. J. Mol. Biol. 284 (3), 609-620 (1998).
  4. Svenningsen, S. L., Kongstad, M., Stenum, T. S., Muñoz-Gómez, A. J., Sørensen, M. A. Transfer RNA is highly unstable during early amino acid starvation in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 45 (2), 793-804 (2017).
  5. Enriquez, J. A., Attardi, G. Evidence for aminoacylation-induced conformational changes in human mitochondrial tRNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (16), 8300-8305 (1996).
  6. Parker, J. Errors and alternatives in reading the universal genetic code. Microbiol Rev. 53 (3), 273-298 (1989).
  7. Traxler, M. F., et al. The global, ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli. Mol Microbiol. 68 (5), 1128-1148 (2008).
  8. Zhong, J., et al. Transfer RNAs Mediate the Rapid Adaptation of Escherichia coli to Oxidative Stress. PLoS Genet. 11 (6), e1005302 (2015).
  9. Kane, J. F. Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol. 6 (5), 494-500 (1995).
  10. Baca, A. M., Hol, W. G. Overcoming codon bias: a method for high-level overexpression of Plasmodium and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli. Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).
  11. Li, S., Pelka, H., Schulman, L. The anticodon and discriminator base are important for aminoacylation of Escherichia coli tRNA (Asn). J Biol Chem. 268 (24), 18335-18339 (1993).
  12. Rizzino, A. A., Freundlich, M. Estimation of in vivo aminoacylation by periodate oxidation: tRNA alterations and iodate inhibition. Anal Biochem. 66 (2), 446-449 (1975).
  13. Dittmar, K. A., Sorensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation. EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).
  14. Zhou, K., et al. Novel reference genes for quantifying transcriptional responses of Escherichia coli to protein overexpression by quantitative PCR. BMC Mol Biol. 12 (1), 18 (2011).
  15. Jacobson, A., Gillespie, D. Metabolic events occurring during recovery from prolonged glucose starvation in Escherichia coli. J Bacteriol. 95 (3), 1030-1039 (1968).
  16. McCarthy, B. The effects of magnesium starvation on the ribosome content of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta (BBA)-Specialized Section on Nucleic Acids and Related Subjects. 55 (6), 880-889 (1962).
  17. Zundel, M. A., Basturea, G. N., Deutscher, M. P. Initiation of ribosome degradation during starvation in Escherichia coli. Rna. 15 (5), 977-983 (2009).
  18. Piir, K., Paier, A., Liiv, A., Tenson, T., Maivali, U. Ribosome degradation in growing bacteria. EMBO Rep. 12 (5), 458-462 (2011).
  19. Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced grown of Salmonella typhimurium. J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).
  20. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).
  21. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold spring harbor laboratory press. (1989).
  22. Sorensen, M. A., Jensen, K. F., Pedersen, S. High concentrations of ppGpp decrease the RNA chain growth rate. Implications for protein synthesis and translational fidelity during amino acid starvation in Escherichia coli. J Mol Biol. 236 (2), 441-454 (1994).
  23. Tian, C., et al. Rapid Curtailing of the Stringent Response by Toxin-Antitoxin Module-Encoded mRNases. J Bacteriol. 198 (14), 1918-1926 (2016).

Tags

ביוכימיה גיליון 126 Escherichia coli אלה חומצות ללא קידוד RNA RNA טיהור העברת RNA טעינה רמת aminoacylation כימות RNA חשופה בצפון.
כימות של רמות של RNAs העברה ב- <em>Escherichia coli</em> השפע וטעינה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stenum, T. S., Sørensen, M. A., … More

Stenum, T. S., Sørensen, M. A., Svenningsen, S. L. Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (126), e56212, doi:10.3791/56212 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter