Kvantificering af overfloden og opladning niveauer af overførsel RNA'er i Escherichia coli

Summary

Her præsenterer vi en metode til direkte måling af transfer RNA opladning niveauer fra renset Escherichia coli RNA samt en måde at sammenligne relative niveauer af transfer RNA eller nogen andre korte RNA, på tværs af forskellige prøver baseret på tilsætning af spike-i celler, der udtrykker en reference genet.

Abstract

Transfer RNA (tRNA) er en væsentlig del af den translationel maskiner i enhver organisme. tRNAer binder og overføre aminosyrer at oversætte ribosomet. De relative niveauer af forskellige tRNAer og forholdet mellem aminoacylated tRNA til samlede tRNA, kendt som niveauet opladning er vigtige faktorer i fastlæggelsen af nøjagtighed og hastighed af oversættelse. Derfor, overflod og opladning niveauer af tRNAer er vigtige variabler at måle når man studerer proteinsyntese, for eksempel på forskellige betingelser, stress. Her, beskriver vi en metode til høst tRNA og direkte måling af den relative forekomst og den absolutte opladning niveau af specifikke tRNA arter i Escherichia coli. TRNA er høstet på en sådan måde, at den labile bånd mellem tRNA og dens aminosyre er bevaret. RNA er derefter underkastes gelelektroforese og Northern blotting, hvilket resulterer i separation af de ladede og tomt tRNAer. Niveauer af specifikke tRNAer i forskellige prøver kan sammenlignes på grund af tilsætning af spike celler til normalisering. Før RNA oprensning tilføje vi 5% af E. coli celler, at overproducere den sjældne tRNA^selC til hver prøve. Mængden af tRNA arter af interesse i en stikprøve er derefter normaliseret til mængden af tRNA^selC i samme prøve. Tilsætning af spike celler før RNA oprensning har fordel over tilsætning af renset spike-i RNA'er, der også står for eventuelle forskelle i celle lysis effektivitet mellem prøver.

Introduction

I følgende præsenterer vi en metode til kvantificering af specifikke tRNAer og måling af deres opladning niveauer af nordlige blotting. Metoden er baseret på en teknik, først udviklet af Varshney et al. ¹. ved høst celler i trichloreddikesyre (TCA) og holde prøverne ved 0 ° C i hele RNA oprensning, ester obligation mellem tRNA og aminosyren er bevaret^2,3,4. Aminoacylated tRNAer kan skelnes fra deres nonacylated kolleger ved gelelektroforese og nordlige blotting, grund til en nedsat bevægelighed af aminoacylated tRNA i gelen, forårsaget af kovalent bundne aminosyre⁵. Derudover præsenterer vi en protokol til normalisering tRNA mængder ved tilsætning af spike-i celler overekspression af sjældent brugte tRNA^{selC 4}.

tRNAer er nogle af de mest udbredte molekyler i cellen bakteriel og en helt vitale del af oversættelse maskiner. tRNAer binder aminosyrer og overføre dem til at oversætte ribosomer. Bindingen af aminosyrer til tRNAer (aminoacylation eller opladning) lettes af aminoacyl tRNA synthetases. Den relative forekomst af forskellige ladede tRNAer er vigtig for at sikre troskab af proteinsyntesen, fordi underrepræsentation af cognate opkrævet tRNA for en given messenger RNA (mRNA) codon øger sandsynligheden for, at en nær cognate tRNA vil fejlagtigt levere sin aminosyre til den voksende polypeptid kæde på ribosom⁶. Betydningen af ladede tRNA afspejles i den omfattende svar af E. coli celle en alvorlig nedgang i Opladningsniveauet for en tRNA; den strenge svar. Under den strenge svar syntesen af tRNAer, ribosomale RNA'er og de fleste mRNAs er sænket til fordel for transskription af specifikke mRNAs tilknyttet aminosyre biosyntese og stress overlevelse og vækst af celler er sænket drastisk⁷ . Desuden har de seneste arbejde af os og andre vist, at E. coli aktivt nedbryder fleste af sine tRNA svar på understreger, at begrænser oversættelse^4,8, tyder på, at justering af tRNA niveauer kan være vigtigt for at håndtere sådanne belastninger. Således, pålidelige målinger af tRNA mængder og opladning niveauer vil være et vigtigt redskab for at fuldt ud forstå bakteriel stress svar.

E.coli er almindeligt anvendt til at udtrykke rekombinante protein og på grund af forskelle i codon skik mellem arter, suboptimal udtryk er et problem, der ofte står over for⁹. Dette kan omgås ved udtryk for yderligere tRNAer nødvendig for at oversætte den rekombinante mRNA¹⁰. Målinger af tRNA opladning niveauer i disse stammer kan guide fejlfinding bestræbelser og hjælpe med at optimere protein udtryk.

Denne metode giver også mulighed for påvisning af "mischarging"; en tRNA-molekyle aminoacylated med en ikke-cognate aminosyre. Aminoacylation af forskellige aminosyrer kan forårsage en tRNA overflytte med lidt forskellige hastigheder gennem polyacrylamidgeler^1,11. I nogle tilfælde kan metoden også bruges til at skelne mellem forskellige ændring mønstre på ellers identiske tRNAer³.

En anden etableret biokemiske procedure for undersøgelse af tRNA opladning niveauer er periodate oxidation. Metoden er baseret på den iagttagelse, at aminoacylated tRNA er beskyttet mod periodate oxidation og tomt tRNA er ikke. Efter periodate oxidation behandling genopladning af tRNA bruges til at beregne opladningsniveauet af den høstede RNA. Dog har genopladning af flere tRNAer vist sig at være påvirket af den behandling, hvilket giver nogle unøjagtighed¹². Metoden, der præsenteres her foranstaltninger opladning direkte fra oprensede RNA, således udelukke eventuelle afvigelser fra kemisk eller enzymatisk reaktioner. En begrænsning af denne metode er, at kun én tRNA arter opdages på et tidspunkt, så selv om den samme nordlige duppes kan strippet og reprobed for flere tRNAer, det er tidskrævende og noget besværlige at indsamle data på mange tRNAer.

En pålidelig måde at normalisere prøver til hinanden er afgørende i undersøgelser, hvor målet er at sammenligne de relative niveauer i et molekyle på tværs af forskellige prøver. Her har vi indføre en normalisering procedure for RNA hvor en lille alikvot af E. coli celler overekspression af sjældne tRNA^selC er tilføjet som en spike-i til alle de eksperimentelle prøver før RNA oprensning. Denne metode er nyttig ikke kun ved behandlingen af tRNAer men for relativ kvantificering af enhver art af RNA når opsætningen af eksperimenterende er sådan, at ingen endogene RNA kan have tillid til at være præsentere på den samme cellulære koncentration i alle prøver. For eksempel, bruges niveau af en "husholdning" RNA-lignende ribosomale RNA ofte som en endogen reference at sammenligne de relative mængder af et andet RNA mellem forskellige prøver¹³. Men dette er til megen nytte, hvis den cellulære koncentration af reference RNA varierer mellem prøver, som kan være tilfældet for ribosomale RNA, hvis prøveudtagningen sker under en stress reaktion^15,16,17 eller under indtræden i stationær fase¹⁷. Tilsætning af spike celler til de eksperimentelle prøver før RNA oprensning giver en solid og præcis måde af normalisering uafhængigt af opsætningen for prøveudtagning. En anden måde at standardisering er tilføjelsen af en eller flere spike-i RNA'er til de eksperimentelle prøver efter RNA oprensning. Men denne metode ikke tager højde for eventuelle forskelle i RNA opsving mellem prøver.

Ved hjælp af E. coli celler at overexpress reference RNA som spike-i celler (Se figur 1) i et eksperiment på E. coli har den ulempe, at det fremgår desuden af en lille mængde af eksogene E. coli alt RNA til den prøver. Vi korrigere for denne tilsætning ved at analysere en prøve, der indeholder kun spike-i celler sideløbende med de eksperimenterende prøver (se den nordlige duppes i figur 2, lane mærket "selC"). Protokollen præsenteret er udviklet til E. coli K-12 men er tilbøjelige til at være gældende for de fleste bakteriearter.

Protocol

1. forberedelse af bakteriel kulturer.

1. Vokse alle kulturer i Erlenmeyerkolben kolber med en kultur/kolbe volumen-forholdet på højst 1/6. I en typisk eksperimentel opsætning, vokse kulturer på 37.0 ° C og ryster på 160 rpm i morpholinepropanesulfonic syre (MOPPER) minimal medium ¹⁸ suppleret med den foretrukne carbon kilde, for eksempel 0,2% glukose, for mindst 10 på hinanden følgende generationer før RNA høst.
2. Dagen før RNA høst, fortynde en forvokset kultur af den ønskede stamme i MOPS minimal medium på en sådan måde, at det vil nå den ønskede OD ₄₃₆ ønskede samtidig den følgende dag. Beregning af volumen af forvokset kultur skal bruges til podning af formlen:
   
   NOTE: her, OD _nye betegner den ønskede OD ₄₃₆ Efter inkubationen V _ny betegner volumen af den fortyndede kultur, OD _gamle betegner OD ₄₃₆ forvokset kultur fortyndet fra, G betegner antallet af generationer kultur vil vokse, fra den tid af fortynding (t ₁) til den tid, det er nødvendigt dagen efter (t ₂) og kan beregnes som: tid forskel (i min) mellem t ₁ og t ₂ divideret med generationstid (i min). For at sikre stabil vækst på tidspunktet for prøveudtagningen, G bør ≥ 10; V _gamle angiver omfanget af den ud dyrket kultur, der skal overføres til den friske medium. Denne ligning er en tilnærmelse, der ikke tager højde for enhver mellemliggende fase; et fænomen ofte observeret efter fortynding af en ud dyrket kultur i friske medier.
   1. Vækstbetingelser varierer afhængigt af formålet med forsøget, men for at begrænse celle til celle variation i tRNA niveauer og til at øge reproducerbarheden, (anbefales) vokse kulturer til steady state før prøvetagning ¹⁹.

2. Forberedelse af spike celler

Bemærk: E. coli-stamme MAS1074, som udtrykker selC genet kodning tRNA ^selC under kontrol af en isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)- inducerbar promotor bruges som spike-i-stamme.

1. Dilute en forvokset kultur af MAS1074 til en OD ₄₃₆ på 0,05 i MOPS minimal medium suppleret med 100 µg/mL ampicillin og 0,2% glukose. Vokse kultur ved 37 ° C ryster på 160 rpm.
   Bemærk: Se diskussion for brug af en alternativ referencestamme.
2. På OD ₄₃₆ ~ 0,1, føje IPTG til en endelig koncentration på 1 mM til inducerer udtryk af tRNA ^selC. Vokse kultur til OD ₄₃₆ ~0.5 (~ 3-4 h vækst) og flytte kultur kolben til isbad. Holde spike-i cellekultur på is, indtil alle prøverne for RNA oprensning er blevet høstet.

3. Høst af eksperimentelle prøver.

1. Pre varm (37 ° C), en udjævnet 100 mL Erlenmeyer-kolbe (eller lignende) indeholdende 4 mL 10% (w/v) trichloreddikesyre (TCA) for hver prøve ved at placere det i en opvarmet vandbad.
   Bemærk: forsigtighed, TCA nedbrydes ved opvarmning, producere giftige og ætsende dampe herunder brint chlorid og chloroform. Opløsning i vand er en stærk syre; det reagerer voldsomt med baser og er ætsende for mange metaller. Passende forholdsregler bør tages, når du bruger denne væske.
2. Umiddelbart inden cellen høst, måle og registrere OD ₄₃₆ kultur.
3. For at høste cellerne, overføre 4 mL af kultur til en pre opvarmet kolbe, som indeholder TCA.
Proeven blandes
4. af hvirvlende kolben i hånden for 5 s. blanding med TCA straks deaktiverer alle enzymaktiviteter og dermed bevarer Opladningsniveauet for tRNAer.
   Bemærk: Hvis flere prøver skal indsamles, holde høstede prøver i TCA på is indtil alle prøver er blevet indsamlet.

4. Tilsætning af spike celler

Bemærk: forberedelse af spike celler er beskrevet i trin 2.

1. Når alle prøver for RNA forberedelse har været indsamlet, tilføje 5% spike-i celler (baseret på OD) til hver prøve.
   Bemærk: Spike-i cellekultur nødvendige mængde beregnes ved formlen:
   
   hvor V _spike angiver mængden af spike-i cellekultur behov, V _exp angiver mængden af høstede eksperimentelle cellekultur (uden TCA), OD _exp betegner OD ₄₃₆ af den eksperimentelle cellekultur på tidspunktet for høsten i TCA. OD _spike betegner OD ₄₃₆ af spike-i cellekultur. Hvis flere prøver er høstet på forskellige ODs, mængden af spike-i celler tilføjet bør tilpasses ud fra formlen ovenfor for hver proeve.
2. At kvantificere bidrag fra spike-celler til RNA arter af interesse, forberede en prøve, kun med spike-i celler ved at blande 4 mL spike-i celler med 4 mL TCA. Forberede RNA fra denne prøve på samme måde som de andre prøver.
3. Valgfrit, tage en anden kolbe, som indeholder kun den eksperimentelle prøve, uden spike-celler, og omfatter det for at kvantificere bidrag af tRNA eksperimentelle prøven ^selC niveauer; de endogene niveauer af tRNA ^selC i E. coli K-12 er negligibly lavt.

5. Forberedelse af RNA

Bemærk: The RNA forberedelse protokollen beskrevet her er det væsentlige som beskrevet af Varshney et al. ¹; For at undgå deacylation af aminoacylated tRNAer under rensningen er det vigtigt at holde prøverne på sure pH-værdi på 0 ° C i løbet af rensning. Brug ren sterile rør/kolber til at holde prøver og løsninger, og forberede alle løsninger med laves (18.2 MΩ·cm resistivitet) vand.

1. Pour 8 mL af hver prøve i en is-kølet centrifugerør. Centrifugeres prøver i 10 min på 9.500 x g på 4 ° C. helt Fjern supernatanten og resuspend i 0,3 mL koldt 0,3 M natriumacetat, pH 4.5 og 10 mM EDTA.
2. Overføre hver prøve til et koldt 1.5 mL microcentrifuge rør og tilføje 0,3 mL phenol ekvilibreres med den samme buffer.
   Bemærk: forsigtighed, phenol producerer giftige dampe og er stærkt ætsende.
3. Vortex hver prøve 10 x 15 s med mindst 1 min mellem hver vortex. I mellem vortexing holde prøverne på 0 ° C. Brug de hyppige pauser til at sikre, at prøverne forbliver kolde.
4. Centrifuge prøver for 15 min på 20.000 x g ved 4 ° C. overførsel vand fase (øverste fase) til nye 1,5 mL microcentrifuge rør. Tilføje 0,3 mL koldt phenol og vortex 4 x 15 s som før.
5. Centrifugeres i 10 min på 20.000 x g ved 4 ° C. overførsel vand fase til nye, koldt 1.5 mL microcentrifuge rør indeholdende 2,5 gange mængden af 96% ethanol (~ 750 µL). Bundfald RNA ved at inkubere rør i 1 time ved-20 ° C eller natten over ved-80 ° C.
6. Centrifuge prøver for 30 min på 20.000 x g ved 4 ° C. supernatanten og tilsættes omhyggeligt 1 mL koldt 70% ethanol uden at forstyrre RNA pellet. Forsigtigt vendes en gang for at vaske indersiden af rør med ethanol.
   Bemærk: Pellet kan være svært at se på dette trin.
7. Centrifugeres i 10 min på 20.000 x g ved 4 ° C. helt Fjern supernatanten og lufttørre pellet, indtil ingen ethanol er tilbage. Resuspenderes af kraftigt vortexing i 20 µL koldt 10 mM natrium acetat pH 4.5 og 1 mM EDTA.
   Bemærk: Over tør ikke pellet som det vil blive vanskeligt at resuspend.
8. Valgfrit, vurdere koncentrationen af RNA ved måling af absorbans på 260 nm.
9. Valgfrit, vurdere kvaliteten af de oprensede RNA ved agarosegelelektroforese gel elektroforese ²⁰.
10. Butik prøver på-80 ° C.
    Bemærk: Protokollen kan blive standset her.

< p klasse= "jove_title" > 6. Forberedelse af kemisk deacylated kontrolprøve

Bemærk: for at skelne bandet af aminoacylated duppes tRNA fra modstykket deacylated på nordlige, en kemisk deacylated alikvot er udarbejdet af alkalisk behandling. Til de fleste formål, er det tilstrækkeligt at deacylate en enkelt prøve for hver nordlige skamplet.

1. Tø RNA prøve på is. Overføre en 4 µL alikvot af RNA prøven til et nyt rør. Tilføje 46 µL Tris-HCl pH 9,0. Der inkuberes i 2 timer ved 37 ° C.
2. Tilføje 15 µL 0,3 M natriumacetat ved pH 4.5 og efterfølgende Tilsæt 125 µL af 96% ethanol. Bundfald RNA ved-20 ° C i 1 h.
3. Centrifugeres i 30 min. ved 20.000 x g ved 4 ° C. helt Fjern supernatanten og resuspend i 4 µL koldt 10 mM natrium acetat pH 4,5 og 1 mM EDTA.
   Bemærk: Protokollen kan være midlertidigt her, hvis prøven opbevares ved-80 ° C.

7. Gel elektroforese og nordlige blotting

1. Mix 4 µL prøve (ubehandlet eller kemisk deacylated) med 6 µL loading bufferen (0,1 M natriumacetat (pH 5,0), 8 M urinstof, 0,05% bromophenol blå og 0,05% xylen cyanol).
   Bemærk: Husk at medtage den prøve, der indeholder kun spike-i celler, den kemisk deacylated prøve (og prøve uden spike-i celler, hvis man var parat).
2. Indlæses prøver på en 0,4 mm tyk 6,5% polyacrylamid gel (19:1 acrylam - ide:bisacrylamide) indeholdende 8 M urinstof i 0,1 M natrium acetat buffer (pH 5,0). Bruge 60 cm lang geler for korrekt adskillelse af tRNA arter.
3. Særskilt RNA ved elektroforese på 10 V/cm gel ved 4 ° C, indtil den blå bromophenol når bunden af gel (~ 20 h).
4. Området fra xylen cyanol farvestof og 20 cm ned mod bromophenol blå farvestof bruges til blotting (afstanden mellem de to farvestoffer bør være 25-30 cm). Forsigtigt adskille to glasplader, således at gelen forbliver på et af dem. Et tyndt stykke filtrerpapir er skåret til størrelsen af den ønskede blotting område og anbragt oven på del af gel, der vil blive brugt til blotting. De dele af gelen, ikke er omfattet af filtrerpapir er afskåret og kasseret. bruge filtret til løft forsigtigt gel stykke fra glasplade.
   Bemærk: Den store gel er meget skrøbelig så håndterer med omhu.
5. Et positivt ladede nylon membran (f.eks. Hybond N ⁺ membran) er anbragt oven på gelen, og det er electroblotted på 20 V i 90 min ved hjælp af 40 mM Tris-vinylacetat (pH 8.1), 2 mM EDTA som overførsel buffer.
6. Bitmapgenkendelse RNA til membranen ved hjælp af UV-lys (0,12 Jørgensen/cm ²).
   Bemærk: Membranen kan nu opbevares ved stuetemperatur og protokollen kan blive standset her.

8. Design og kontrol af sonder

Bemærk: omhyggelig design og kontrol af nordlige skamplet sonder er afgørende for at opnå pålidelige resultater og undgå uønskede cross-hybridisering med andre RNA arter.

1. Brug korte syntetiske oligonukleotider som sonder. Designe sonde sekvens på en måde, at det er et supplement til den mest unikke del af sekvensen af tRNA af interesse - det er ofte anticodon sløjfen.
   Bemærk: En liste over forventede tRNA sekvenser fra forskellige organismer kan findes i den genomisk tRNA Database (GtRNAdb) ²¹.
2. Juster længden af sekvens til at opnå en forudsagt smeltende temperatur på 55-65 ° C.
3. BLAST (grundlæggende lokale Alignment Søg Tool) valgt sekvens mod genomet sekvens af den bakterielle stamme, der anvendes i forsøget, for at kontrollere, at sekvensen er unik for den valgte tRNA, som beskrevet i ²².
   Bemærk: Tabel 1 viser foreslåede sonde sekvenser for flere forskellige tRNAer af E. coli K12. Hvis sonden er specifikke for tRNA af interesse, kun to bands er synlig på den nordlige skamplet (opladet og tomt tRNA) og kun ét band er synlige i vognbane med deacylated prøven (tomt tRNA). Hvis mere end to bands er til stede, eller hvis yderligere validering af sonden specificitet ønskes, se diskussion.

9. Hybridisering af nordlige skamplet

NOTE: I de følgende trin, membranen er sekventielt hybridiseret med sonder supplement til de ønskede specifikke tRNAer, herunder en sonde specifikke for referencen tRNA ^selC.

1. Membranen i en hybridisering tube og tilføje 6 mL hybridisering løsning (0,9 M NaCl, 0,05 M NaH ₂ PO ₄ (pH 7,7), 5 mM EDTA, 0,5% (w/v) SDS, 100 mg/mL af forskydes og denatureret sild sæd DNA og 5 x Denhardt ' s løsning (100 x Denhardt ' s løsning = 2% bovint serumalbumin, 2% polyvinylpyrrolidon 40, og 2% Ficoll)).
2. Pre krydse membran i buffer for 1 h roterende på 42 ° C. tilføje 30 pmol radioaktive oligo-DNA sonde 5 ' - ende - mærket med ³² P (forberedt som beskrevet af Sambrook et al. ²³)
   Bemærk: forsigtig, højenergi beta emissioner fra ³² P kan præsentere en betydelig hud og øje dosis hazard. Passende forholdsregler bør tages, når ved hjælp af ³² s. radioaktivt affald skal bortskaffes efter passende institutionelle sikkerhed protokoller.
3. Ruger sonde med membran overnight roterende på 42 ° C. Fjern sonden ved hjælp af en engangs 10 mL pipette.
   Bemærk: Hvis opbevares i en fryser sonden kan genbruges.
4. i røret hybridisering vaske membran snart i 50 mL 0,3 M NaCl, 30 mM natriumcitrat, 0,1% (w/v) SDS ved stuetemperatur.
   Bemærk: Denne første vask indeholder meget ubundne sonde og skal håndteres som højradioaktivt.
5. Repeat trin 9.4 én gang og derefter flytte membranen til en flad plastikbeholder eller bakke herunder låg. Dække membran med vask løsning (0,3 M NaCl, 30 mM natriumcitrat, 0,1% (w/v) SDS) og Inkuber i 30 min. ved stuetemperatur.
6. Ændre opløsningen vask og fortsætte vask, indtil en tilfredsstillende signal / støjforhold er opnået (ofte 3-4 ændringer af vask løsning). Bruger en Geiger-Müller røret at opdage hvordan støj signal forhold ændres ved at måle stråling fra et tomt område af membranen og sammenligne det til området hvor sonden har hybridiseret specifikt til tRNA.
7. For at være i stand til at fratage sonde fra membranen efter eksponering, sikre, at (vigtigt) membranen ikke tørre ud før de stripping procedure. Placer membranen i en tynd plastpose eller wrap det stramt ved hjælp af plastik wrap og forsegle det for at være lufttæt af tape eller svejsning. Placer den lukkede membran på en phosphorimaging skærm.
   Bemærk: Den krævede eksponeringstid på skærmbilledet phosphorimaging er bestemt af den specifikke aktivitet af sonden, mængden af RNA aftestede for, og hybridisering effektiviteten af sonden og kan variere meget; fra et par minutter til flere dage. Med erfaring giver intensiteten af den stråling opdaget på membran med Geiger-Müller-rør en god indikation af den krævede eksponeringstid. Pålidelig kvantificering, er det vigtigt, at skærmen ikke er overeksponeret.
8. Scan phosphorimaging skærmen ved hjælp af en laserscanner og gemme filen i " .gel " format.
   Bemærk: Et højt signal-støj-forhold er nødvendige for pålidelig kvantificering. Sondering for en tRNA bør resultere i to bands; én indeholdende aminoacylated tRNA (langsommere migration) og én indeholdende deacylated tRNA (hurtigere overførsel). Se figur 2.

10. Stripping membranen

NOTE: før membranen kan blive undersøgt for en anden tRNA, tidligere sonden først skal fjernes ved stripning membranen.

1. Varme nok stripping buffer (15 mM NaCl, 1,5 mM natriumcitrat, 0,1% (w/v) SDS) til at dække membranen og hæld det over membranen. Inkuber den i 15 min. ved stuetemperatur.
2. Gentag trin 10.1 indtil ingen stråling kan opdages med en Geiger-Müller røret; membranen kan nu blive re hybridiserede følge trinene beskrevet i afsnit 9.

11. Kvantificere tRNA og opladning niveauer

1. belastning .gel fil i imaging software (Se Tabel af materialer). Tegne en lodret streg langs hver af de prøve baner på en sådan måde, at det spænder over det meste af bredden af banen, men udelukker kanterne af bandene, hvor signalet kan være ujævn, som vist i figur 3A.
2. Visualiser tæller fra hver lane ved at klikke på " analyse "-> " oprette graf ". Manuelt definerer de to toppe, der repræsenterer de ladede og et tomt tRNA fra hver lane, som vist i figur 3B.
3. Få tæller fra hver top ved at klikke på " analyse "-> " område rapport ", og optage område under hver af de to toppe.
4. Når skamplet har været aftestede tRNA ^selC og mindst én tRNA af interesse, normalisere niveauet af tRNA af interesse for tRNA ^selC.
   1. Beregne andelen af tRNA med oprindelse fra spike-i celler i hver lane og trækkes fra det samlede signal i denne vognbane ved hjælp af ligningen:
      
      NOTE: her, Prøve _tRNA = signalet fra en enkelt vognbane af en membran aftestede for den ønskede tRNA; Prøven _selC = signalet fra den samme vognbane af samme membran aftestede for tRNA ^selC; Ref _tRNA = signalet fra den vognbane, der indeholder kun spike-i celle RNA af samme membran aftestede for den ønskede tRNA; Ref _selC = signalet fra den vognbane, der indeholder kun spike-i celle RNA af samme membran aftestede for tRNA ^selC.
   2. Til at normalisere, opdele den korrigerede tRNA-værdi fra hver vognbane af tRNA ^selC signal fra den samme vognbane.
      Bemærk: Bidrag til tRNA ^selC signal fra stikprøven celler er ubetydelig (Se figur 2, lane mærket "-selC ").
5. Beregne tRNA opladning niveau for hver lane ved at dividere signal af den top, der repræsenterer opladet tRNA med summen af signalet fra begge toppe (ladede + tomt).

Representative Results

Ved hjælp af fremgangsmåden beskrevet her, overflod og opladning niveauer af tre tRNAer blev målt i E. coli K-12 før og under aminosyre sult.

Arginin auxotroph stamme NF915⁴ (thr leu hans argH thi mtl supE44) blev dyrket for mindst ti generationer i MOPS minimal medium suppleret med 0,4% glycerol, 50 µg/mL threonin, leucin, arginin og 5 µg/mL histidin ved 37 ° C ryster på 160 rpm. Arginin sult blev indført ved filtrering af kultur og resuspension i frisk MOPS medium som ovenfor men uden arginin. Under arginin sult, proteinsyntese er stærkt reduceret, men fortsætter på et lavt niveau ved hjælp af argininog udgivet af omsætningen af eksisterende proteiner. Prøverne blev høstet på tidspunktet punkter angivet i figur 4. Når alle prøver er høstet i TCA, 5% af MAS1074 spike-i celler overekspression tRNA^selC, blev føjet til hver prøve, som illustreret i figur 1. RNA blev renset fra prøverne, adskilt af elektroforese og renset på en membran, som beskrevet i protokollen. Membranen var probed for tRNA^argVYZQ, tRNA^gltTUVW, tRNA^hisRog tRNA^selC, som det ses i figur 2. Stråling signalet fra hver lane var tal for hver af de fire sonder som illustreret i figur 3, og korrigeret og normaliserede, som beskrevet i afsnit 11. Resultaterne præsenteres i fig. 4. Figur 4A viser, at niveauet af alle de testede tRNA arter hurtigt falder under aminosyre sult, som for nylig rapporteret⁴. Figur 4B viser, at tRNA opladning niveauer opfører sig som forventet: de ladede brøkdel af den accept af arginin tRNA falder hurtigt efter udtagning af arginin fra vækstmediet, mens Opladningsniveauet for de andre tRNAer stige lidt efter sult fordi opkrævet tRNAer ophobes når deres sats på decharging på ribosomer falder på grund af manglende substrat for protein syntese⁴. Yderligere i perioden sult falder opladet tRNA fraktion til ca forud udsultning niveauer på grund af nedbrydningen af fleste af tRNA-poolen (figur 4A), hvilket resulterer i en større hastighed på decharging af de resterende tRNAer på ribosomer. Derimod øger de ladede brøkdel af tRNA^argVYZQ af mindst to grunde; 1) aktivering af den strenge svar betyder at mRNA, ikke opkrævet tRNA^arg, bliver den begrænsende faktor for oversættelse og 2) den samlede pulje af tRNA^arg er reduceret (figur 4A) så en større del af den samlede tRNA^arg kan blive opkrævet af den samme lille mængde arginin. Dette eksperiment viser, hvordan de samtidige målinger af tRNA overflod og tRNA opladningsniveauet giver høj kvalitetsoplysninger om betingelserne for proteinsyntese inde i cellen.

Figur 1. Tilsætning af spike celler til prøver. I dette eksempel er prøver fra en enkelt kultur af E. coli NF915 høstet i en tidsserie før og under aminosyre sult. En skematisk af vækstkurven af NF915 er vist, hvor de blå prikker angiver punkter i stikprøven høst. Y-axes er log skala. Prøver af den eksperimenterende kultur er høstet som beskrevet i afsnit 3. En skematisk af vækstkurven af spike-i-stamme MAS1074 er også vist, med punktet i stikprøven høst angivet som en blå prik. Pointen med figuren er at illustrere, at alle de eksperimentelle prøver (af E. coli NF915 i dette eksempel) modtager en alikvot af spike-i celler fra samme reference kultur. Til hver prøve, 5% af spike celler føjes til de eksperimentelle celler, beregnes baseret på OD af cellekulturer (Se afsnit 4). Efterfølgende er RNA renset fra alle prøver og anvendes til nordlige blots. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Fosfor imager scanning af en nordlige skamplet aftestede for de angivne tRNAer. Membranen indeholder RNA fra E. coli -stamme NF915 høstet på de angivne tidspunkter før og efter induktion af arginin sult (minutter). Derudover membranen indeholder to baner af prøver hvor spike celler er blevet udeladt (-selC DA og -selC), og en lane, der indeholder RNA fra spike-i celler kun (selC). -SelC DA prøven indeholder kemisk deacylated tRNA. De to bands, der repræsenterer de ladede og tomt tRNA arter er klart adskilt. Bemærk den ubetydelige signal fra tRNA^selC i banerne tilføjet uden spike-i celler. Den samme membran var successivt strippet og reprobed for de tRNAer, der er angivet til venstre. Den boxed område i den øverste skamplet angiver del af den skamplet, der er vist for de efterfølgende tRNA-probings. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Kvantificering af nordlige skamplet. tRNA overflod er målt ved hjælp af software. (A) A enkelt lane fra den nordlige skamplet ses i figur 2 aftestede for tRNA^argVYZQ. Den øverste og nederste pil angiver aminoacylated tRNA og deacylated tRNA, henholdsvis. De røde linjer kører parallelt med banen er tilføjet og bruges til at definere området for kvantificering. (B) kvantificering af signal inden for de to brudte røde linjer ses i (A) afbildet som en graf, hvor den vandrette akse viser afstanden fra toppen af linjen i (A) (i pixel), og den lodrette akse viser intensiteten af signalet (i tæller). De to toppe, indeholdende signal med oprindelse fra aminoacylated tRNA og deacylated tRNA, henholdsvis er defineret manuelt. De data, der eksporteres til yderligere analyse er den værdi, der svarer til området under hver af de to toppe. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Repræsentativt resultat: kvantificering af tRNA mængder end opladning niveauer i arginine sult. Kvantificering af bands på den nordlige skamplet, vist i figur 2. (A) relative overflod af tRNA^gltTUVW (rød), tRNA^argVYZQ (blå) og tRNA^hisR (grøn). Niveauet fundet på nul minutter (prøver høstet lige før igangsættelsen af sult) er angivet til 1. (B) opladning niveau af de samme tre tRNAer som i (A). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Sonden specificitet	Sonden sekvens
tRNAargVYZQ	5'-TCCGACCGCTCGGTTCGTAGC
tRNAgluTUVW	5'-CCTGTTACCGCCGTGAAAGGG
tRNAhisR	5'-CACGACAACTGGAATCACAATCC
tRNAleuPQVT	5'-GTAAGGACACTAACACCTGAAGC
tRNAleuU	5'-TATTGGGCACTACCACCTCAAGG
tRNAleuW	5'-CTTGCGGCGCCAGAACCTAAATC
tRNAleuX	5'-TATTTCTACGGTTGATTTTGAA
tRNAleuZ	5'-AAAATCCCTCGGCGTTCGCGCT
tRNAlysQTVWYZ	5'-TGCGACCAATTGATTAAAAGTCAAC
tRNAthrV	5'-TGGGGACCTCACCCTTACCAA
tRNAtyrTV	5'-TCGAACCTTCGAAGTCGATGA
tRNAselC	5'-ATTTGAAGTCCAGCCGCC

Tabel 1. Tabel over foreslåede sonde sekvenser for udvalgte tRNAer i E. coli K-12.

Discussion

Denne protokol beskriver hvordan man samtidig måle niveauet opladning af specifikke E. coli tRNAer og sammenligne de relative niveauer af tRNAer i forskellige prøver. De kritiske punkter i protokollen er 1) til at håndtere prøverne på en sådan måde, at de cellulære tRNA opladningsniveauet bevares, 2) til at normalisere tRNA mængder på en sådan måde, at relative tRNA niveauer i forskellige prøver kan sammenlignes pålideligt, og 3) for at sikre sp ecificity af de valgte sonder til tRNAer af interesse. Disse punkter behandles særskilt nedenfor.

tRNA rensning

TRNAer er renset fra E. coli i en blid måde, der er optimeret til at bevare deres cellulære opladningsniveauet. Det er vores erfaring, at denne protokol primært ekstrakter RNA'er kortere end 150 nt, således tRNA udgør en stor del af de oprensede RNA. Af denne grund anbefales det ikke at bruge denne protokol til at rense total RNA fra E. coli. Protokollen præsenteres her bør ligeledes være egnede til påvisning og kvantificering af andre RNA'er såsom små RNA (sRNA) uden nogen yderligere tilpasninger. Fordi RNA udvinding protokol beriger for korte RNA sekvenser bør det også finde anvendelse, selvom sRNA undersøgte udtrykkes kærlig.

Normalisering af spike-i celler

For at sammenligne niveauet af tRNA på tværs af forskellige prøver, er det nødvendigt at normalisere tRNA niveauer til niveauer af en udskrift, der findes i den samme gennemsnitlige antal pr. celle i alle prøverne, for at korrigere for prøve til prøve variationer i RNA Recovery og gel ladning. Til dette formål spike vi prøver med 5% af reference celler, der overexpress den sjældne tRNA^selC før RNA oprensning. Spike-i metode er at foretrække over ved hjælp af en endogen RNA som reference, fordi det tillader sammenligning af tRNA niveauer på tværs af betingelser hvor ingen endogene RNA'er kendes med sikkerhed findes i den samme cellulære koncentration. Ved hjælp af E. coli celler som spike-i har Ulempen at 5% ekstra E. coli RNA er føjet til alle de eksperimentelle prøver, hvor den bidrager til signal af RNA af interesse. Denne skævhed er regnskabsmæssigt ved herunder en prøve der indeholder kun de spike-celler på alle nordlige skamplet, og korrigere RNA værdier som beskrevet i trin 11.4.1. Udtryk for tRNA^selC i vildtype celler er så lav i forhold til andre tRNAer (Se figur 2) at det gør ikke en betydelig forskel i kvantificering og dermed kan blive forsømt. Men i referencestamme MAS1074, hvor selC er udtrykt ved en T7 promotor på en høj kopi plasmid, vi anslår, at mindst 1.000-fold mere tRNA^selC er produceret i 1 mM IPTG end der produceres af vildtype E. coli K-12 under enhver tilstand. MAS1074 ophører med at vokse efter to generationer af fuld IPTG induktion. På det tidspunkt kultur til kultur forskelle i induktion af tRNA^selC er små, og ikke en bekymring for denne protokol som alle delprøver af spike celler til et enkelt eksperiment er taget fra den samme induceret kultur af MAS1074. Som et alternativ til MAS1074 kan celler fra en organisme, hvis RNA ikke vil krydsreagere med hybridisering sonden bruges som spike-i celler. Sulfolobus solfataricus celler har med held været brugt som spike-in for eksperimenter med E. coli tRNA⁴. Dog E. coli spike-i celler er sandsynligvis mere præcist afspejler graden af celle lysering af eksperimentelle celler, som det er usikkert, hvorvidt S. solfataricus lyses med samme effektivitet som E. coli. Også er voksende S. solfataricus mere kedelige, da de vokser på 85 ° C med en generationstid på ~ 16 h.

At sikre specificiteten af udvalgte tRNAer

Hvis både aminoacylated og deacylated tRNA er blevet skal renset to bands registreres på den nordlige membran. Afstanden mellem de to bands varierer afhængigt af den specifikke tRNA under efterforskning, og er en kombineret konsekvens af forskellen i størrelse, polære egenskaber og konformation, som en bestemt aminosyre forårsager når det binder en bestemt tRNA⁵ . For eksempel, afstanden mellem aminoacylated og deacylated tRNA er større for tRNA^argVYZQ end for tRNA^gltTUVW, som det ses i figur 2. Som følge af den store størrelse af gel bruges her til at adskille RNA, er opløsningen høj nok at skelne opladet tRNA fra tomt, men også at skelne de fleste af de forskellige tRNAer fra hinanden på grund af deres forskelle i længde, sekvens sammensætning, og modifikation mønstre. Selv isoaccepting tRNAer kan skelnes som vist for leucin accepterer tRNAer². Bemærk at i dette studie ikke var muligt at skelne tRNA^leuPQV fra tRNA^leuT, som forskel i sekvensen er dog kun én G T substitution.

Hvis mere end to bands vises på den nordlige membran kunne det være en konsekvens af krydsreaktion af sonde med andre RNA'er. Stigende strengheden af vask trin (trin 9.5) ved at øge temperaturen kan normalt løse dette. Vask 30 min. ved 55 ° C er normalt tilstrækkeligt. Hvis stigende vask strenghed ikke fjerner cross-hybridisering, kan løsningen være at designe en ny sonde, der er et supplement til en anden (ofte delvist overlappende) del af tRNA sekvens. Yderligere bånd kan også være fremførsel fra en tidligere sonde, som følge af utilstrækkelig stripning af membranen. For at forhindre dette, skal du gøre en stribe kontrol ved at udsætte membranen før re sondering. Hvis bands vises på kontrol scanning membranen skal muligvis yderligere stripping. Det er normalt muligt at re sonde en membran mindst 8 - 10 gange, men efter flere sonder kan det være svært at fratage helt. Hvis dette er tilfældet, kan membranen opbevares i et par måneder før re sondering som ³²P henfalder hurtigt.

Yderligere kontrol af sondens specificitet opnås ved at udføre en nordlig skamplet med celler høstet under et sæt betingelser hvor udskrift af interesse forventes at blive påvirket på en forudsigelig måde. For eksempel bør inducerbar udtryk for tRNA fra et plasmid, eller aminosyre sult for den beslægtet aminosyre, resultere i en forbedret relative udtryk eller en lavere opladning niveau, henholdsvis af tRNA af interesse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Urea	Merck	57-13-6	Purity >99%
Polyacrylamide	Serva	79-06-7
Bis (N,N'-Methylene-bis-acrylamide)	BIO-RAD	161-0201
Trichloroacetic acid (TCA)	Sigma	76-03-9
Phenol	Merck	108-95-2
IPTG
Glucose
Sodium Acetate
EDTA
Ethanol
Tris
Hydrochloric acid
Sodium Chloride
NaH2PO4
Sodium Citrate
SDS
Herring Sperm DNA	Sigma	100403-24-5
BSA
Polivinylpyrrolidone
Ficoll
P32 γATP	Perkin Elmer
DNA oligos (probes)	TAG Copenhagen
Hybond N+ membrane	GE Healthcare	RPN203B
Crosslinker
Electroblotter	BIO-RAD
Typhoon FLA 7000 Scanner	GE Healthcare	28955809
Spectrophotometer
Hydridization oven
Geiger-Müller tube
Phosphor imager screen	GE Healthcare
Hybridization tube
Culture Flasks
1.5 ml microcentrifuge tubes
20 ml centrifuge tubes
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
ImageQuant	GE Healthcare
Excel	Microsoft