Summary
هنا يصف لنا وضع بروتوكول لتنفيذ السيستيرنا ماجنا كانوليشن (CMc)، طريقة كسبها لتوصيل تتبع وركائز وإشارات الجزيئات في السائل الدماغي النخاعي (CSF). جنبا إلى جنب مع مختلف طرائق التصوير، تمكن اللجنة العسكرية المركزية نظام جليمفاتيك وتقييم ديناميات الخدمات القطرية، فضلا عن التسليم على مستوى الدماغ للمركبات المختلفة.
Abstract
السيستيرنا ماجنا كانوليشن (CMc) هو إجراء مباشر يتيح الوصول المباشر إلى السائل الدماغي النخاعي (CSF) دون الأضرار المنطوق للجمجمة أو حمة الدماغ. في تخديره من القوارض، تعرض الأم الجافية بتشريح حادة في عضلات الرقبة يسمح إدخال قنية في السيستيرنا ماجنا (سم). مرفق حقنه القنية، وتتألف أما من غرامة إبرة مشطوف أو البورسليكات الشعرية، عبر أنبوب البولي إيثيلين (PE). باستخدام مضخة الحقن، جزيئات يمكن ثم حقن في المعدلات التي تسيطر عليها مباشرة في مجلس الوزراء، ومستمر مع الحيز تحت العنكبوتية. من الفضاء تحت العنكبوتية، يمكننا تتبع تدفقات الخدمات القطرية بالتدفق الحراري في الفضاء ارتشاح حول اختراق الشرايين، التي يحدث فيها تبادل ذائبة مع السائل الخلالي (قوي الأمن الداخلي). اللجنة العسكرية المركزية يمكن أن يؤديها للحقن الحادة بعد الجراحة مباشرة، أو لغرس المزمن، مع حقن لاحق في تخديره أو مستيقظا، تتحرك بحرية القوارض. كوانتيتاتيون التوزيع الراسم في حمة الدماغ يمكن أن يؤديها ابيفلوريسسينسي، والفحص المجهري 2-فوتون، والتصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي)، اعتماداً على الخواص الفيزيائية-الكيميائية للجزيئات حقن. وهكذا، يقدم CMc بالاقتران مع مختلف تقنيات التصوير أداة قوية لتقييم نظام جليمفاتيك وديناميات الخدمات القطرية والدالة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تستخدم اللجنة العسكرية المركزية كقناة لإيصال سريع، على صعيد الدماغ إشارات الجزيئات وركائز الاستقلابية التي يمكن أن لا خلاف ذلك عبر حاجز الدم في الدماغ (BBB).
Introduction
الاستحمام السائل الدماغي النخاعي (CSF) في الجهاز العصبي المركزي (CNS) في جميع أنحاء النظام البطين وعلى طول المسافات تحت العنكبوتية، مساحة محددة تشريحيا في التواصل مع البطينين، الذي يحيط المخ والحبل الشوكي. واحدة من المهام الرئيسية للخدمات القطرية لتوفير توجيه لإزالة نواتج الأيض والذوائب من حمة الدماغ. هو تيسير التخليص عبر جليمفاتيك اكتشفت مؤخرا نظام1، الدماغ التناظرية إلى اللمفاوي المحيطي. هنا، يمكننا وصف ومناقشة السيستيرنا ماجنا كانوليشن (CMc)، طريقة كسبها للتسليم المباشر من الجزيئات في إطار الخدمات القطرية. اللجنة العسكرية المركزية هو الأسلوب الرئيسي لدراسة الدالة جليمفاتيك. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا تطبيق CMc لدراسة ديناميات الخدمات القطرية وتسليم سريع، على صعيد الدماغ الدماغ غير الدم جزيئات نفاذية الحاجز (BBB) إلى حمة الدماغ، على امتداد مساحة ارتشاح.
اللجنة العسكرية المركزية يستغل المبادئ الفسيولوجية لديناميات حركة الخدمات القطرية من خلال الجهاز العصبي المركزي لتسليم الجزيئات الراسم المسمى أو المخدرات إلى مساحة مملوءة بالسائل الدماغي النخاعي السيستيرنا ماجنا (سم). يتم حقن جزيئات من خلال قنية مزروع في تغطية قذالي سمك الغشاء دورال جزيئات سم. ثم يقوم بتدفق معظم الخدمات القطرية إلى حمة الدماغ عبر الفضاء بارافاسكولار1. عامل التتبع أو التباين تحقن عبر اللجنة العسكرية المركزية يتبع حركة الخدمات القطرية، الذي يتيح تقييم حركة الخدمات القطرية، وتدفق جليمفاتيك بقياس مستويات كثافة الجزيئات المسماة التي أدخل حمة الدماغ. اللجنة العسكرية المركزية متوافق مع تقنيات التصوير المختلفة بما في ذلك ابيفلوريسسينسي، والفحص المجهري 2-فوتون، والتصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي). أيضا، يمكن أن يكون هذا التقييم يقوم على حد سواء في فيفو أو السابقين فيفو. الأهم من ذلك، يسمح للجنة العسكرية المركزية لتصور النظام جليمفاتيك تحت التخدير أو أثناء النوم الطبيعي، وكذلك في الحيوانات مستيقظا، تتحرك بحرية.
تقنية CMc يمكن استخدامها لدراسة الجوانب المختلفة لديناميات السوائل في إطار الخدمات القطرية، ولكن ثبت أن تكون مفيدة بشكل خاص لدراسة النظام جليمفاتيك. محركات النشاط جليمفاتيك التدفق الحراري للخدمات القطرية من الفضاء بيريارتيريال عبر قنوات المياه (أقب-4) أقوابورين-4، التي هي المربوطة في غشاء أستروسيتيك التفاف الأوعية الدموية اندفيت. التدفق الحراري يتيح تبادل الخدمات القطرية والسائل الخلالي (قوي الأمن الداخلي) داخل حمة الدماغ. ثم تتم إزالة السائل الدماغي النخاعي/قوي الأمن الداخلي التي تحتوي على النفايات الأيضية والذوائب من حمة الدماغ عبر2،الفضاء بيريفينوس3. في نهاية المطاف، CSF/قوي الأمن الداخلي تصل إلى المحيط الخارجي عن طريق وصف مؤخرا الأوعية اللمفاوية دورال4،5. لقد ثبت نظام جليمفاتيك الحاسمة لإزالة نواتج الأيض النفايات الضارة مثل اميلويد بيتا2. علاوة على ذلك، يتم إزالة جليمفاتيك البصر في الشيخوخة6، بعد إصابة الدماغ7، وفي نماذج حيوانية لمرض السكري8 و9من مرض الزهايمر. جدير بالذكر أن نشاط جليمفاتيك هو الدولة التابعة، عرض نشاط أعلى كثيرا أثناء النوم أو التخدير بالمقارنة مع اليقظة1. وفي الواقع، يحمل صغار الحيوانات تخديره من النشاط جليمفاتيك أعلى. وهكذا، الكمي التجريبي للنشاط جليمفاتيك أمر بالغ الأهمية عند دراسة دورها في الصحة والمرض.
وتناولت عدة دراسات ديناميات الخدمات القطرية وفي التبادل مع سائل خلالي (قوي الأمن الداخلي) في حمة الدماغ. ومع ذلك، الأساليب التي يتم تسليم الجزيئات المسماة الغازية بدلاً من ذلك، تسبب تلف الدماغ حمة والتغيرات في الضغط داخل الجمجمة (برنامج المقارنات الدولية) (انظر استعراض10). بعض الأمثلة داخل البطيني أو حقن إينترابارينتشيمال التي تنطوي على اوديما أو الحفر للدغ ثقب في الجمجمة. أظهرت هذه الإجراءات لتغيير برنامج المقارنات الدولية، وبالتالي تعطيل وظيفة جليمفاتيك2. أيضا، هذه الأساليب الغازية حمل أستروجليوسيس وزيادة إيمونوريكتيفيتي عقب-4 في منطقة حمة تلف الدماغ وفي المناطق المحيطة بها11،12. كما أستروسيتيس وعقب-4 عناصر رئيسية للنظام جليمفاتيك، اللجنة العسكرية المركزية هو الأسلوب المفضل لدراساتها. المزايا الرئيسية للجنة العسكرية المركزية بالمقارنة بمزيد من الإجراءات الغازية هي الحفاظ على حمة الجمجمة والدماغ سليمة، تجنب التعديلات برنامج المقارنات الدولية وأستروجليوسيس، على التوالي. وهكذا، يفتح CMc بالاقتران مع أدوات التصوير المختلفة لمجموعة واسعة من الإمكانيات لدراسة نظام جليمفاتيك، ليس فقط، بل أيضا الديناميات وآليات لتدفق السوائل في التوازن، وكذلك في نماذج حيوانية للأمراض العصبية.
الإجراء السيستيرنا ماجنا كانولاتيون (CMc) يتيح الوصول السهل والمباشر للسائل الدماغي النخاعي (CSF). عن طريق حقن جزيئات مختلفة (مثل تتبع الفلورسنت، عوامل التباين التصوير بالرنين المغناطيسي) يمكن تعقب تحركاتهم داخل حجرة الخدمات القطرية المجرب وتقييم نشاط النظام جليمفاتيك. البروتوكول التالي يصف كلا المركزية الحادة، لحقن مباشرة بعد الجراحة، وغرس المزمن من القنية، فيه الحيوان للشفاء من العملية الجراحية لحقن لاحق. الفرق الأكثر أهمية بين غرس الحاد والمزمن غرس المزمنة يسمح لدراسة النشاط جليمفاتيك في الفئران مستيقظا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت وفقا للتوجيه 2010/63/الأوروبية لبحوث الحيوان جميع الإجراءات وأقرها "المجلس التجارب الحيوانية" في إطار وزارة البيئة والغذاء (2015-15-0201-00535).
1-إجراءات كانوليشن
- إعداد القنية
ملاحظة: تجنب لمس القنية مع قفازات غير معقمة.- قطع تلميح المعدنية مشطوف الحواف ز 30 إبرة الأسنان استخدام حامل إبرة.
- استخدام حامل إبرة، إعداد القنية بإدراج تلميح المعدنية مشطوف (حوالي 0.3 سم) بطول 30 سم PE10 الأنابيب (أنابيب البولي إثيلين 0.024 "التطوير التنظيمي × 0.011" معرف) مليئة قام (126 ملم كلوريد الصوديوم، 2.5 ملم بوكل، 1.25 ملم نة2بو4 ، 2 مم MgSO4، 2 مم كاكل2، الجلوكوز 10 مم، 26 مم ناكو3؛ الرقم الهيدروجيني 7.4 عند الغاز مع 95% O2 و 5% CO2).
- مسح القنية مع قام باستخدام حقنه 1 مل مزودة بإبرة ز 30 (30 x ½ "0.3 × 12).
-
إجراء العمليات الجراحية
ملاحظة: كانوليشن سم المزمنة يسمح الحيوانات للتعافي من العملية الجراحية. حقن سم مصنوعة من اليوم التالي لغرس القنية، والأهم من ذلك، يمكن أن يؤديها في الحيوانات أما تخديره أو مستيقظا. حيث أن هذه عملية جراحية في انتعاش، إجراءات ينبغي أن يتم تحت ظروف معقمة.- وزن الماوس (C57BL/6JRj، من كلا الجنسين، 8 أسابيع) وتخدير أنه خليط من الكيتامين و xylazine (100 مغ/كغ؛ 10 مغ/كغ، على التوالي) عن طريق الحقن داخل (القائمة). إذا لزم الأمر، ريدوسي الماوس بجرعة نصف الكيتامين (50 مغ/كغ) أثناء العملية الجراحية. وبدلاً من ذلك، ل cannulation المزمن، تخدير الماوس بوضعه في دائرة التعريفي isoflurane في isoflurane 2.5-3 في المائة، في حوالي 1 لتر في الدقيقة س2. وفي هذه الحالة، استخدم مخروط الآنف للحفاظ على التخدير إيسوفلوراني 1.5-2% خلال الجراحة.
- عند رشة تو وقف ردود الفعل، والتنفس يصبح بطيئا ومطردا، ضع الحيوان في إطار ستيريوتاكسيك فوق وسادة تدفئة.
- تطبيق مرهم العيون. كرر أثناء الجراحة كلما كان ذلك ضروريا.
- حلق الرأس والرقبة من الماوس وإزالة الفراء، وتعقيم الجلد أولاً مسحه الكحول وثم مرتين مع الكلورهيكسيدين (0.5 في المائة) أو محلول اليود (2%). كرر عملية التعقيم مرتين أخريين.
ملاحظة: تغيير ثني الجراحية لإزالة الحطام والشعر بعد الحلاقة. ثم ثني الحيوان لحماية الميدان العقيمة. - ل cannulation المزمن، إدارة 0.5-1 مل ليدوكائين/bupivacaine (1 ملغ/مل و 0.25 مغ/مل، على التوالي) تحت الجلد (الليبي) في موقع شق. إدارة البوبرينورفين (0.05 مغ/كغ؛ الليبي) للتسكين بعد الجراحة.
- إصلاح الماوس في إطار ستيريوتاكسيك. بعد التأكد من التثبيت، أما إينتراورال أو بواسطة القوس زيجوماتيك، إمالة الرأس قليلاً حيث أن ذلك يشكل زاوية مقدارها 120 درجة للجسم (الشكل 1E).
- العثور على جزء من الجمجمة بارزة فورا فوق عضلات الرقبة-كريست والقفويه. رفع الجلد السطحية باستخدام زوج من ملاقط، وقطع قطعة على شكل لوز من الجلد حوالي 1 سم على طول خط الوسط. استخدام مسحات القطن أو العين سبيرز للتحكم في أي نزيف الناتجة عن ذلك.
- استخدام كريست والقفويه كنقطة مرجعية، سحب بعيداً في النسيج الضام سطحية لفضح عضلات الرقبة أدناه.
- فصل العضلات في خط الوسط عن طريق تشغيل بعناية الملقط أسفل منتصف الموقع شق في المحور الأمامي الخلفي. مع زوج من منحنى الملقط في كل ناحية، الانضمام إلى النصائح في الوسط بالقرب من أسفل الجمجمة وسحب عضلات جانبا.
ملاحظة: هذا ينبغي فضح سم، الذي يظهر كمثلث مقلوب صغيرة، حددها في المخيخ أعلاه ولب أدناه، خلف الغشاء الشفاف دورال (الشكل 1 باء وجيم 1). - استخدام مسحه عين جراحية الرمح أو القطن، مسح الغشاء دورال تغطي سم.
-
إدخال القنية في مجلس الوزراء
- إزالة القنية من المحاقن قام مملوءة، إبقاء الإبرة ز 30 يعلق على نهاية الجزء الخلفي من الأنبوب.
- إرفاق الإبرة ز 30 مقطر مملوءة بالمياه 100 ميليلتر حقنه متصلة بمضخة الحقن.
- إدراج فقاعة هواء تقريبا 1 سم في القنية بسحب الهواء بمساعدة مضخة الحقن.
- باستخدام مضخة الحقن، سحب 12 ميكروليتر من المرغوب فيه السائل الدماغي النخاعي الراسم إلى القنية.
- فهم القنية، مليئة بالتتبع CSF، قرب الإبرة المغطاة بأنبوب مع زوج من ملاقط المنحنى الذي عقد في اليد المهيمنة. ضع الإصبع الأوسط من اليد غير المهيمنة على شريط الإذن للجانب الآخر وثابتا لاستخدامها لاحقاً كاستراحة القنية.
- إدراج القنية بزاوية مقدارها 45 درجة بالنسبة إلى رأس الماوس، يمر في مركز سم، حددت بجانبه الثلاثي ينظر إليها عن طريق بلده دوراً. تجنب أي اختراق المخيخ أو لب. ضمان فقط إدراج الإبرة بعمق 1-2 مم، أي إلى النقطة حيث يتم شطبه كلياً بلده دوراً. الإفراج عن الملقط عقد القنية، واسمحوا قنية الراحة من ناحية غير المهيمنة.
ملاحظة: نهاية مشطوف الإبر الأسنان يتطلب تطبيق بعض القوة لاختراق الغشاء دورال تغطي سم. - إذا لزم الأمر، الجاف لإيقاف أي تسرب السائل النخاعي على الاختراق باستخدام مسحات الرمح أو القطن جراحة عين.
- قطره 2-3 قطرات الصمغ cyanoacrylate على الغشاء دورال المحيطة القنية. إضافة قطره من الغراء مسرع لعلاج الغراء فورا. وتغطي الجمجمة وابرة مع خليط من الأسمنت الأسنان (حوالي 0.5 ملغ) والصمغ cyanoacrylate (3-5 قطرات). بعد ذلك مباشرة، تطبيق قطره مسرع الغراء لعلاج.
- ل cannulation المزمن، قطع الأنابيب (ترك حوالي 2-3 سم يعلق على القنية) وختم ذلك مع لحام جراحية الإبقاء على مستويات الضغط داخل الجمجمة (برنامج المقارنات الدولية)، بمنع تسرب السائل النخاعي عن طريق الأنابيب.
- ل cannulation المزمن، إدارة والايبوبروفين (5 ملغ/كغ؛ الليبي)
- ل cannulation المزمن، ضع الماوس في قفص، إبقائها على منصة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم حتى الحيوان هو تعافي تماما من التخدير.
ملاحظة: الحيوانات ينبغي أن تكون منفردة داخل اقفاصها لضمان بقاء القنية سليمة. ضمان أن الآنف الواضح للأسرة عن طريق وضع الماوس على منشفة ورقية أو الركيزة الصلبة الأخرى.
ملاحظة: في اليوم التالي، عندما يتم استرداد الحيوانات من العملية الجراحية للإدراج قنية، أنها يمكن أن تكون حقن تتبع السائل الدماغي النخاعي. للحقن تحت التخدير، إدارة خليط من الكيتامين/إكسيلازيني (100 مغ/كغ؛ 10 مغ/كغ، على التوالي؛ القائمة) وانتقل إلى الخطوات المذكورة في القسم 2. للحقن في الحيوانات مستيقظا، انتقل إلى القسم 3.
2-حقن السائل الدماغي النخاعي تتبع عبر قنية سم مزروع الحادة في تخديره من الحيوانات
ملاحظة: للحقن لتتبع الخدمات القطرية عبر قنية سم مزروع الحادة في الحيوانات تخديره، فورا بعد الخطوة 8 من القسم السابق، انتقل إلى حقن السائل الدماغي النخاعي التتبع كما هو موضح أدناه.
- ابدأ باستخدام مضخة الحقن، الحقن في تتبع "سم من السائل الدماغي النخاعي" بمعدل 1 ميكروليتر/دقيقة لمدة 5 أو 10 دقائق، أسفر عن إجمالي حجم ميليلتر 5 أو 10 ميليلتر، على التوالي. في نهاية الحقن، السماح بالتتبع CSF أن تعمم في جميع أنحاء الدماغ لمدة 30 دقيقة مع قنية دون عائق.
- بعد 30 دقيقة، قطع أنابيب متصلة القنية (حوالي 4 سم المسافة من الحافة إبرة) وختم نهايته باستخدام لحام العمليات جراحية.
- تحت التخدير العميق، euthanize الحيوان بقطع الرأس. تشريح الدماغ بسرعة وإصلاح الأنسجة بالانغماس في بارافورمالدهيد 4% (PFA) المخفف في الفوسفات مخزنة المالحة (برنامج تلفزيوني؛ 0.01M؛ ودرجة الحموضة 7.4) بين عشية وضحاها (o/n) في 4 درجات مئوية.
3-حقن "السائل الدماغي النخاعي تتبع" عبر قنية "مزمن سم مزروع" في "الحيوانات مستيقظا"
- باستخدام مضخة الحقن، سحب ميليلتر 7 أو 12 ميليلتر من المرغوب فيه السائل الدماغي النخاعي الراسم في قنية تتألف من حوالي 30 سم أنابيب PE10 مع تلميح إبرة أسنان مشطوف من 0.5 سم.
- تقييد برفق الحيوان وقطع حوالي 1 سم من الأنابيب تعلق على القنية.
- لا يزال تحت تقييد لطيف، الاتصال بسرعة قنية مليئة بالسائل الدماغي النخاعي الراسم إلى قنية سم مزروع.
- استخدام مضخة الحقن، البدء الحقن في تتبع "سم من السائل الدماغي النخاعي" بمعدل 1 ميليلتر/دقيقة حقن 7 ميليلتر أو ميليلتر 12، لتحقيق وحدة تخزين نهائي للخدمات القطرية حقن الراسم ميليلتر 5 أو 10 ميليلتر، وبالتالي تعويض قام المتبقية في قنية مزروع. في نهاية الحقن، السماح بالتتبع CSF أن تعمم في جميع أنحاء الدماغ لمدة 30 دقيقة مع قنية دون عائق. ضمان بقاء الأنبوب المرفقة خلال فترات الحقن وتداولها.
- في نهاية وقت التداول الراسم السائل الدماغي النخاعي، تشرع للقتل الرحيم بقطع الرأس، مؤكدا أن الحيوان تم تخديره من عميق. تشريح الدماغ بسرعة وإصلاح الأنسجة بالانغماس في بارافورمالدهيد 4% (PFA) المخفف في الفوسفات مخزنة المالحة (برنامج تلفزيوني؛ 0.01M؛ ودرجة الحموضة 7.4) بين عشية وضحاها (o/n) في 4 درجات مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عند التثبيت من الفئران أو الجرذان في إطار ستيريوتاكسيك، يتم تشريح عضلات الرقبة حول منطقة كريست والقفويه صراحة لفضح السيستيرنا ماجنا (سم). الهيكل الثلاثي لسم سهولة معترف به بين الجزء والذيلية من المخيخ ولب (الشكل 1Aج-1). يتم إدراج القنية 1-2 مم في مجلس الوزراء بلطف ثقب الغشاء سمك القفوية (الشكل 1). الغشاء دوراً بنية صعبة وتحسين إدراج القنية عن إمالة الرأس الحيوان ° 120 بالنسبة للجسم. مع المعونة من مضخة حقن، ثم يتم حقن جزيئات مسماة بشكل مختلف في ماغنا تشيستيرنا أسعار الخاضعة للرقابة (الشكل 1E). بعد فاصل زمني للسماح بتداول الراسم السائل الدماغي النخاعي، هي euthanized الحيوانات. الدماغ هو تشريح بعناية وثابتة بالانغماس في 4% PFA س/ن في 4 درجات مئوية. آراء الظهرية العيانية للعقول التي تحصد من القوارض حقن سم تبين توزيع تتبع الخدمات القطرية في صهاريج تحت العنكبوتية من المخيخ ولمبة شمي في الفضاء بارافاسكولار على طول شرايين المخ الأوسط (MCAs) (الشكل 1F ). في الجزء البطني للدماغ، إظهار وجهات النظر العيانية السائل الدماغي النخاعي الراسم التوزيع على طول "دائرة ويليس" (الشكل 1). مقاطع نسيجية لحقن سم العقول كذلك تكشف عن توزيع بارافاسكولار تتبع داخل حمة الدماغ. الفئران التي حقنت تحت التخدير (الشكل 1 ح) (أو أثناء النوم الطبيعي، انظر1) تظهر زيادة ملحوظة في توزيع الراسم إلى حمة الدماغ بالمقارنة بحقن الفئران بينما مستيقظا وتتحرك بحرية في قفص على الصفحة الرئيسية (الشكل 1I).
رقم 1: حقن تتبع في ماغنا السيستيرنا. (أ) نظرة عامة التخطيطي رأس الماوس والدماغ تبين موقع السيستيرنا ماجنا (سم) بالنسبة للدماغ والجمجمة الهياكل. (ب) الصورة المجهرية سم عرضه بعد أن تم تشريح عضلات الرقبة المحيطة بها صراحة ودفعت إلى الجانبين. (ج) التكبير أعلى من منطقة صورت في ب (مستطيل أسود)، يبين الهيكل الثلاثي المقلوب سم (خط متقطع) وموقعه بالنسبة المحيطة الهياكل، أي كريست والقفويه، المخيخ، ولب. (د) فوتوميكروجرافي قنية إدراج المخطط (ه) سم. النظرة الجانبية للماوس الرأس الثابتة، ويميل قليلاً في زاوية مقدارها 120 درجة بالنسبة للجسم. اقحم مستطيل متقطع محدد يظهر مجال مخطط نظام عرض باراساجيتال من طريقة عرض باراساجيتال في المخ الماوس مع قنية إدراجها في مجلس الوزراء، كما هو مبين في هاء. حقنه، الذي يقترن بمضخة حقن، يستخدم لتوصيل الخدمات القطرية تتبع أو عوامل التباين إلى سم من خلال أنبوب متصل بإبرة ز 30 دقيقة. صور الممثل الدماغ كله الماوس في 30 دقيقة بعد نهاية حقن سم مع الراسم فلورسنت من الظهرية (F) والبطني (ز) الجوانب. (ح، الأول،) أقسام الدماغ الاكليلية الممثل كونتيرستينيد مع DAPI (4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي; 1 ميكروغرام/مل في برنامج تلفزيوني) من الفئران حقن سم تحت تخديره (ح) واليقظة (ط) 30 دقيقة بعد نهاية حقن سم مع تتبع الخدمات القطرية بمعدل 1 ميليلتر/دقيقة من 5 ميليلتر وحدة التخزين من خليط من المتقارن أوفالبومين-AF647 (الزراعة العضوية، 45kDa؛ 2% في قام) والمتقارن ديكستران-فيتك (التنفيذ المباشر، 3kDa؛ 2% في قام). مقياس الحانات، 5 ملم ب، ج، و، ز؛ 2 مم د، و 500 ميكرومتر ح, Cb أولاً, المخيخ؛ سم، السيستيرنا ماجنا؛ Ctx، قشرة؛ والمكشوف، لمبة شمي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد قدمنا بروتوكول الذي يصف إجراءات مفصلة السيستيرنا ماجنا كانوليشن (CMc)، التي توفر طريقة مباشرة لتسليم الجزيئات المسماة إلى حجرة السائل الدماغي النخاعي. اللجنة العسكرية المركزية يسمح التصور اللاحقة من ديناميات الخدمات القطرية، سواء في فيفو السابقين فيفو، استخدام أساليب التصوير المختلفة أو الأنسجة.
واحدة من المزايا الرئيسية لهذه التقنية CMc يكمن في الوصول المباشر إلى الفضاء تحت العنكبوتية دون الحاجة إلى كشف الدماغ عن طريق اوديما. التي لا تتطلب إطار الجمجمة أو اختراق حمة الدماغ مع طرف إبرة، يسمح CMc تسليم الجزيئات في حجرة الخدمات القطرية وتقييم نظام جليمفاتيك بإجراء مينيملي، مع اضطراب وجيزة فقط من الضغط داخل الجمجمة (برنامج المقارنات الدولية).
جدير بالذكر أن الحقن في مجلس الوزراء المتلقين للمعلومات من المصادر الرئيسية للخدمات القطرية، plexi شرويد الموجود في النظام البطين (الأفقي، البطينين الثالث والرابع). من البطينات الجانبية، تدفق السائل الدماغي النخاعي البطين الثالث عبر الثقب داخل البطيني (ثقبة مونرو) ومن البطينين الثالثة إلى الرابعة عبر قناة الدماغي (قناة سيلفيوس) إلى جذع المخ والحبل الشوكي (استعرض في3 ). الخدمات القطرية تصل إلى المسافة تحت العنكبوتية عبر مجلس الوزراء التي تتدفق من خلال الفتحة الوسطية (أو الثقبة ماجيندي)، وهكذا حقن CMc تجاوز النظام البطين بأكمله. ومع ذلك، بينما قد يكون هذا إشكالية في بعض نماذج من ديناميات الخدمات القطرية/قوي الأمن الداخلي عن طريق البطينين، الحقن المباشر لتتبع في البطينين يتطلب الإجراءات الجراحية الغازية مثل حفر ثقوب لدغ في نوافذ الجمجمة، وتطبيق حقن البطين تعطل إلى حد كبير برنامج المقارنات الدولية13. وبالمثل، يلغي الضغط ضخ تتبع في13،الفضاء تحت العنكبوتية14 في أيدينا تدفق تتبع الخدمات القطرية على طول المساحة بارافاسكولار. وفي المقابل، على الرغم من أن يستتبع CMc ثقب الغشاء دورال، برنامج المقارنات الدولية فقط القلق عابر و المستعادة بسرعة2.
استخدام اللجنة العسكرية المركزية، ويمكن قياس النشاط جليمفاتيك في تخديره من الحيوانات بعد CMc الحادة، وكذلك في الحيوانات مستيقظا، التقيد بفترة انتعاش 24 ساعة عند غرس القنية. اللجنة العسكرية المركزية الحادة مناسب لتركيبة مع 2-فوتون التصوير، والذي يقدم معلومات مفصلة عن النشاط جليمفاتيك داخل القشرة إلى عمق حوالي 200 ميكرومتر1،2. الأهم من ذلك، يتيح CMc الحادة أيضا في الاستفادة من دعم دراسات التصوير بالرنين المغناطيسي غير متحيزة، حيث يتبع توزيع التتبع بشكل حيوي، بالنسبة لصورة أساس فردية المكتسبة قبل البدء بحقن السائل الدماغي النخاعي الراسم15، 16 , 17-ينبغي الاستعاضة "عن التصوير بالرنين المغناطيسي"، إبرة الأسنان المستخدمة للجنة العسكرية المركزية البورسليكات شعرية (حوالي 1 سم طول، نصيحة قطرها حوالي 20 ميكرومتر) يعلق على أنابيب PE.
وعلى النقيض من كانوليشن الحاد، يسمح CMc المزمنة المجرب أداء الخدمات القطرية الراسم الحقن في الحيوانات أثناء النوم الطبيعي أو تحت التخدير، فضلا عن في مستيقظا، تتحرك بحرية الحيوانات. وهذا عامل حاسم نظراً للنشاط جليمفاتيك الدولة تعتمد اعتماداً كبيرا على؛ تدفق الراسم إلى لحمه كثير أكبر في الحيوانات التي تم حقن تحت التخدير أو نائماً من الحيوانات التي تم ضخها في حالة يقظة1. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تلقي الحيوانات مع قنية مزمن مزروع الراسم الخدمات القطرية في قفص المنزل بهم، وبالتالي التقليل من عوامل التباس بسبب آثار الإجهاد والاستثارة في النشاط جليمفاتيك. لحقن المزمن تحت التخدير، خليط من الكيتامين/إكسيلازيني (100 مغ/كغ؛ 10 مغ/كغ، على التوالي) ويوصي. إيسوفلوراني بتركيزات أعلى من 1.5% يدفع تورم الدماغ ولا يعزز النشاط جليمفاتيك مقارنة بالدولة مستيقظا1. مبنى علما أن الحيوانات بعد زرع CMc، ينبغي أن تكون واحدة، بغية ضمان أن الحيوانات CMc مزروع لا ضرر القنية من بعضها البعض. أيضا، منذ غرس CMc المزمن إجراء العمليات جراحية انتعاش، فإنه ينبغي أن يجري تحت ظروف معقمة والحيوانات يجب أن تتلقى المسكنات بوستوبيراشونال.
الأهم من ذلك، يمكن استخدام اللجنة العسكرية المركزية كأسلوب لتقديم الخدمات القطرية تتبع في الفئران والجرذان، مع الحد الأدنى من التعديلات على البروتوكول. ينبغي أن تدار جرعة المسكنات المناسبة وحجم الحد الأقصى من الخدمات القطرية التتبع التي يتم حقنها في فئران 30 ميليلتر، نظراً للاختلافات في حجم البطين وتحت العنكبوتية المسافات بين النوعين.
على الرغم من بساطتها الإجرائية، مطلوب بعض التدريب والممارسة المجرب لأداء بنجاح اللجنة العسكرية المركزية. نظراً لسم تختلف في الحجم بين الأنواع والحيوانات الفردية، فمن المستحسن لممارسة الاعتراف بهيكلها. ممارسة الإجراء باستخدام "الأزرق إيفانز" (2% في قام) يسمح المجرب لتأكيد غرز الإبرة الصحيح. في بعض الأحيان، سوف تكون سفينة يقع مباشرة في خط الوسط لمجلس الوزراء، عندئذ ينبغي إدراج الإبرة المتاخمة للسفينة، ولكن أقرب ما يكون إلى خط الوسط. ينبغي ملاحظة هذه الحالات، لتأكيد لاحق أن تتبع توزع بالتساوي، على الرغم من وضع قبالة مركز طرف الإبرة. الأهم من ذلك، قذالي سمك الغشاء تغطي سم ميكانيكيا صعبة، وينبغي أن تطبق ضغطاً كافياً على إدراج تلميح إبرة مشطوف. ومع ذلك، من الأهمية بمكان إلا تؤدي الضغوط التي مورست في تغرق نصيحة إبرة في لب أو المخيخ. لتسهيل إدخال إبرة في مجلس الوزراء، ينبغي أن يميل الرأس الحيوانات نزولا بزاوية مقدارها 120 درجة بالنسبة للجسم، والتي تمتد الغشاء. الأهم من ذلك، ينبغي توخي الحذر لا لعرقلة التنفس بهذا الانحناء الرأس. إذا كان يجب إدخال تلميح إبرة المخيخ، تتبع سيتم الاحتفاظ في الأنسجة وتفشل لتوزيعها في جميع أنحاء الفضاء تحت العنكبوتية. الأضرار التي لحقت لب غالباً إلى الوفاة، بينما يمكن أن يؤدي الضرر المخيخ في كانوليشنز المزمن في السجود وشذوذ عامة في سلوك الحيوانات. للتقليل من مخاطر هذا الاحتمال، يمكن استخدام الإبر مع طول المجسم مشطوف الحواف أصغر.
عندما تتحرك العضلات في منطقة الرقبة ويغطي الغشاء دوراً لإدراج القنية في مجلس الوزراء، يمكن أن يحدث النزيف. ويمكن استخدام مسحات القطن لامتصاص النزيف، ولكن بدلاً من ذلك، يمكن تطبيق الحل كلوريد الحديد. كلوريد الحديد تأثير مرقئ18، ويؤدي أيضا تشنج عضلات الرقبة حول موقع شق، مما يساعد على الحصول على الصحيح إدخال الإبرة في الحديد سم. كما يجف كلوريد الجمجمة والغشاء دورال، عرض أفضل الأسطح لانضمام القنية. للجنة العسكرية المركزية، تطبيق 1-2 قطرات محلول كلوريد الحديد (10%) (حوالي 1 مل) في القطن مسحه والدأب في عضلات العنق وقمة والقفويه. ومع ذلك، قد كلوريد الحديد الموضعية تتسرب ربما عبر الغشاء إلى الخدمات القطرية، مع آثار غير معروفة في الدماغ التوازن. في حالة استخدام كلوريد الحديد مدعاة للقلق، واحد بدلاً من استخدام الكامشات الجرح للاحتفاظ بفتح الموقع شق. إزالة الكامشات الجرح بعد تطبيق الغراء cyanoacrylate يتجنب مرفق غير مقصود إلى موقع شق دقيق.
اللجنة العسكرية المركزية إجراء بسيط واستنساخه توصيل الجزيئات مباشرة إلى حجرة السائل الدماغي النخاعي. أن اللجنة العسكرية المركزية مينيملي، الأسلوب المفضل لتصور النظام جليمفاتيك ويمكن دمجها مع طرائق التصوير مختلفة مثل ابيفلوريسسينسي والفحص المجهري 2-فوتون أو التصوير بالرنين المغناطيسي. وهكذا، تمثل اللجنة العسكرية المركزية أداة عظيمة للدراسات ديناميات السوائل، أي الخدمات القطرية وقوى الأمن الداخلي، وأيضا لتطهير السائل المخ. بسبب التغطية العيانية للنظام جليمفاتيك، واللجنة العسكرية المركزية كامنة ستستخدم لتقديم جزيئات المخ على نطاق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل أيده نوفو نورديسك المؤسسة والمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية NINDS/المعاهد الوطنية للصحة (م). A.L.R.X. وار S.H هي المتلقية لزمالة ما بعد الدكتوراه ومنحة دكتوراه من مؤسسة Lundbeck، على التوالي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SOPIRA Carpule 30G 0.3 x 12mm | Kulzer | AA001 | |
| Polyethylene Tubing 0.024” OD x 0.011” ID | Scandidact | PE10-CL-500 | |
| 30G x ½” 0.3 x 12 mm Luer-Lock | Chirana T. Injecta | CHINS01 | |
| Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate) | Meda AS | no catalogue number, see link in comments | http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/ |
| Alcohol Swab 70% Isopropyl Alcohol 30 x 60mm | Vitrex Medical A/S | 520213 | |
| Viskoese Oejendraeber Ophtha | Ophtha | 145250 | |
| Wooden applicator, Double cotton bud (Ø appr. 4 - 5 mm, length appr. 12 mm) | Heinz Herenz | 1032018 | |
| Eye spears | Medicom | A18005 | |
| Ferric chloride 10% solution | Algeos | NV0382 | |
| Kimtech Science Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark Professional | 05511 | |
| Loctite Super Glue Precision 5g | Loctite | no catalogue number, see link in comments | http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html |
| Insta-Set CA Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-152 | |
| Dental Cement Powder | A-M Systems | 525000 | |
| Surgical weld | Kent Scientific Corporation | INS750391 | |
| Hamilton syringe GASTIGHT® , 1700 series, 1710TLL, volume 100 μL, PTFE Luer lock | Hamilton syringes | 1710TLL | |
| LEGATO 130 Syringe pump | KD Scientific | 788130 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS; 0.01M; pH 7.4) | Sigma Aldrich | P3813 | |
| Ovalbumin, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | O34784 | |
DAPI (diamidino-2-phenylindole) Solution (1 mg/mL) |
Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dextran, Fluorescein, 3000 MW, Anionic | Thermo Fisher Scientific | D3305 | |
| E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic System | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
| Euthanimal 200mg/mL (sodium pentobarbital) | ScanVet | 545349 | |
| Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine) | Intervet International BV | 511519 | |
| Rompin Vet 20 mg/mL (xylazin) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| Xylocain 20 mg/mL (lidocain) | AstraZeneca | 158543 | |
| Marcain 2.5 mg/mL (bupivacain) | AstraZeneca | 123918 | |
| Bupaq Vet 0.3 mg/mL (buprenorphine) | Richter Pharma AG | 185159 |
References
- Xie, L., et al. Sleep Drives Metabolite Clearance from the Adult Brain. Science. , 373-377 (2013).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci. Transl. Med. 4, 147ra111 (2012).
- Jessen, N. A., Munk, A. S. F., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner's Guide. Neurochem. Res. 40, 2583-2599 (2015).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. , (2015).
- Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J. Exp. Med. 212, 991-999 (2015).
- Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Ann. Neurol. 76, 845-861 (2014).
- Plog, B. A., et al. Biomarkers of Traumatic Injury Are Transported from Brain to Blood via the Glymphatic System. J. Neurosci. 35, 518-526 (2015).
- Jiang, Q., et al. Impairment of glymphatic system after diabetes. J. Cereb. Blood Flow Metab. , Under Revi (2016).
- Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiol. Dis. 93, 215-225 (2016).
- Orešković, D., Klarica, M. The formation of cerebrospinal fluid: Nearly a hundred years of interpretations and misinterpretations. Brain Res. Rev. 64, 241-262 (2010).
- Dusart, I., Schwab, M. E. Secondary Cell Death and the Inflammatory Reaction After Dorsal Hemisection of the Rat Spinal Cord. Eur. J. Neurosci. 6, 712-724 (1994).
- Eide, K., Eidsvaag, V. A., Nagelhus, E. A., Hansson, H. -A. Cortical astrogliosis and increased perivascular aquaporin-4 in idiopathic intracranial hypertension. Brain Res. , (2016).
- Pullen, R. G., DePasquale, M., Cserr, H. F. Bulk flow of cerebrospinal fluid into brain in response to acute hyperosmolality. Am. J. Physiol. 253, F538-F545 (1987).
- Ichimura, T., Fraser, P. A., Cserr, H. F. Distribution of extracellular tracers in perivascular spaces of the rat brain. Brain Res. 545, 103-113 (1991).
- Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. J. Clin. Invest. 123, 1299-1309 (2013).
- Ratner, V., et al. Optimal-mass-transfer-based estimation of glymphatic transport in living brain. Proc. SPIE--the Int. Soc. Opt. Eng. 9413, (2015).
- Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. J. Neurosci. 35, 11034-11044 (2015).
- Nouri, S., Sharif, M. R., Sahba, S. The effect of ferric chloride on superficial bleeding. Trauma Mon. 20, e18042 (2015).
