Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Durchführung der Cisterna Magna Kanülierung (CMc), minimalinvasiv, Tracer, Substrate und Signalmoleküle in den Liquor cerebrospinalis (CSF) zu liefern. In Kombination mit verschiedenen Bildgebungsverfahren ermöglicht CMc Glymphatic System sowie CSF Dynamik Bewertung und Gehirn-weite Lieferung verschiedener Verbindungen.
Abstract
Cisterna Magna Kanülierung (CMc) ist ein einfaches Verfahren, das direkten Zugriff auf die cerebrospinale Flüssigkeit (CSF) ohne operativen Schäden an den Schädel oder das Gehirn Parenchym ermöglicht. Bei anästhesierten Nagetieren ermöglicht die Belichtung der Dura Mater durch stumpfe Dissektion der Nackenmuskulatur das einführen der Kanüle in die Cisterna Magna (CM). Die Kanüle, komponiert, entweder durch einen feinen abgeschrägten Nadel oder Borosilikatglas Kapillare, ist über einen Schlauch Polyethylen (PE) eine Spritze befestigt. Über eine Spritzenpumpe, können Moleküle dann kontrollierten Preisen direkt in die CM injiziert werden kontinuierlich mit den Subarachnoidalraum ist. Aus dem Subarachnoidalraum können wir CSF Fluten durch konvektive Strömung in den perivaskulärer Raum um eindringende Arteriolen verfolgen, wo gelöste Austausch mit der interstitiellen Flüssigkeit (ISF) erfolgt. CMc kann für akute Injektionen unmittelbar nach der Operation oder für eine chronische Implantation, mit späteren Injektion betäubt oder wach, erfolgen frei beweglichen Nagetiere. Quantifizierung der tracerverteilung im Gehirn Parenchym erfolgt durch Epifluoreszenz, 2-Photonen-Mikroskopie und Magnetresonanz-Bildgebung (MRI), abhängig von den physikalisch-chemischen Eigenschaften der injizierten Moleküle. CMc in Verbindung mit verschiedenen bildgebenden Verfahren bietet damit ein leistungsfähiges Werkzeug für die Beurteilung des Glymphatic Systems und CSF Dynamik und Funktion. CMc kann darüber hinaus genutzt werden, als Kanal für schnelle, Gehirn-weite Lieferung der Signalisierung Moleküle und metabolische Substrate, die die Blut-Hirn-Schranke (BBB) sonst nicht überqueren konnte.
Introduction
Liquor cerebrospinalis (CSF) taucht das zentrale Nervensystem (ZNS) in das Ventrikelsystem und entlang der Subarachnoidalblutung Räume, ein anatomisch definierten Raum im Kontinuum mit der Ventrikel, die das Gehirn und das Rückenmark umgibt. Eine der Hauptfunktionen des GFK ist eine Route für die Abfertigung von Metaboliten und gelösten Stoffen aus der Anwesenheit von zur Verfügung zu stellen. Abstand wird über die kürzlich entdeckten Glymphatic System1, das Gehirn, die analog zu den peripheren lymphatischen Systems erleichtert. Hierin, wir beschreiben und erläutern die Cisterna Magna Kanülierung (CMc), eine minimal-invasive Methode für die direkte Übergabe von Molekülen in den Liquor. CMc ist die zentrale Methode zur Untersuchung der Glymphatic-Funktion. CMc kann darüber hinaus auch für das Studium der CSF Dynamik und für eine schnelle, Gehirn-weite Lieferung nicht Blut Hirn-Schranke (BBB) durchlässig Moleküle in das Gehirn Parenchym, entlang der perivaskulärer Raum angewendet werden.
Die CMc nutzt physiologische Grundsätze der CSF Bewegungsdynamik durch die CNS, beschriftete Tracer Moleküle oder Drogen in den CSF gefüllten Raum der Cisterna Magna (CM) zu liefern. Moleküle sind über eine Kanüle in die Atlas-okzipitalen dural Membran-Abdeckung, die die CM. Moleküle dann von CSF Masse fließen über den Paravascular Platz1in der Anwesenheit durchgeführt werden implantiert eingespritzt. Tracer oder Kontrast-Agent über die CMc injiziert folgt der Bewegung des CSF, wodurch die Beurteilung der CSF Bewegung und Glymphatic Zustrom durch Quantifizierung Intensitätsstufen beschrifteten Moleküle, die die Anwesenheit von eingeben. CMc ist kompatibel mit verschiedenen bildgebenden Verfahren einschließlich Epifluoreszenz, 2-Photonen-Mikroskopie und Magnetresonanz-Bildgebung (MRI). Auch diese Beurteilung kann in Vivo und ex Vivodurchgeführt. Wichtig ist, ermöglicht CMc die Visualisierung des Systems der Glymphatic unter Narkose oder im natürlichen Schlaf sowie bei wachen, frei beweglichen Tieren.
Die CMc-Technik kann genutzt werden, um verschiedene Aspekte der Strömungsmechanik im Liquor zu studieren, sondern erweist sich als besonders nützlich für das Studium des Glymphatic-Systems sein. Glymphatic Aktivität treibt die konvektive Strömung von CSF aus dem Periarterial Raum über Wasserkanäle Aquaporin-4 (AQP-4), die in der Membran der astrocytic vaskulären Umhüllung Endfeet angebunden sind. Die konvektive Strömung ermöglicht den Austausch von CSF und interstitielle Flüssigkeit (ISF) in das Gehirn Parenchym. CSF/ISF, Stoffwechselschlacken und gelösten Stoffen enthalten wird dann aus der in Anwesenheit von über den perivenöse Platz2,3entfernt. Letzten Endes erreicht CSF/ISF die Peripherie über die kürzlich beschriebenen dural Lymphgefäße4,5. Das Glymphatic System wurde entscheidend für die Abfertigung von schädlichen Abfällen Metaboliten wie Amyloid-β2gezeigt. Darüber hinaus ist Glymphatic Clearance beeinträchtigt Altern6, nach Schädel-Hirn-Verletzung-7, und in Tiermodellen der Diabetes-8 und der Alzheimer-Krankheit9. Bemerkenswert ist Glymphatic Aktivität Zustand abhängig, während Schlaf oder Anästhesie im Vergleich zu Wachheit1deutlich höheren Aktivität zeigen. In der Tat zeigen junge narkotisierten Tiere die höchste Glymphatic-Aktivität. Experimentellen Quantifizierung der Glymphatic Tätigkeit ist somit entscheidend ihre Rolle in Gesundheit und Krankheit zu studieren.
Mehrere Studien haben CSF Dynamik und ihren Austausch mit interstitielle Flüssigkeit (ISF) in das Gehirn Parenchym angesprochen. Die Methoden, die durch die beschrifteten Moleküle geliefert werden sind jedoch eher invasiv, Hirnschäden Parenchym und Änderungen in der intrakraniellen Druck (ICP) auslösen (siehe Bewertung10). Einige Beispiele sind intraventrikuläre oder Intraparenchymal Einspritzungen die Kraniotomie oder Bohren von einen Grat beinhalten Loch in den Schädel. Diese Verfahren wurden gezeigt, ICP, so stören Glymphatic Funktion2zu ändern. Auch solche invasiven Methoden induzieren Astrogliosis und AQP-4 Immunoreactivity in dem Hirnareal Parenchym beschädigt und seine Umgebung11,12zu erhöhen. Wie Astrozyten und AQP-4 Schlüsselelemente des Glymphatic Systems, ist die CMc die Methode der Wahl für seine Studien. Die wichtigsten Vorteile von CMc im Vergleich zu mehr invasiven Verfahren sind die Aufrechterhaltung einer intakten Schädel und Gehirn Parenchym, ICP Umbauten und Astrogliosis, bzw. zu vermeiden. So öffnet CMc in Verbindung mit anderen imaging-Tools für eine breite Palette von Möglichkeiten, nicht nur das Glymphatic-System, sondern auch die Dynamik zu studieren und Mechanismen der Flüssigkeitsströmung in Homöostase sowie in Tiermodellen der neurologischen Erkrankungen.
Cisterna Magna Kanülierung (CMc) Verfahren ermöglicht einfachen und direkten Zugriff auf die cerebrospinale Flüssigkeit (CSF). Durch die Injektion von verschiedener Molekülen (z.B. Fluoreszenz Tracer, MRT-Kontrastmittel) kann der Experimentator verfolgen ihre Bewegung innerhalb der CSF-Fach und die Aktivität des Glymphatic Systems zu bewerten. Das folgende Protokoll beschreibt sowohl die akuten CMc für Injektionen unmittelbar nach der Operation, und chronische Implantation der Kanüle, in der das Tier erholt sich von dem chirurgischen Eingriff für eine spätere Injektion. Der wichtigste Unterschied zwischen der akuten und chronischen Implantation ist, dass die chronische Implantation für das Studium der Glymphatic Aktivität bei Mäusen wach.
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Protocol
Alle Verfahren wurden gemäß der Europäischen Richtlinie 2010/63/EU für Tierversuche durchgeführt und waren von der Tier-Experimente-Rat unter das dänische Ministerium für Umwelt und Ernährung (2015-15-0201-00535) genehmigt.
1. Verfahren zur Kanülierung
- Kanüle Vorbereitung
Hinweis: Berühren Sie die Kanüle mit unsterilen Handschuhen.- Brechen Sie die abgeschrägte Metallspitze einer 30G dental Nadel Nadel Halterung befestigen.
- Mit einem Nadelhalter, bereiten die Kanüle durch Einfügen der abgeschrägten Metallspitze (ca. 0,3 cm) in einer 30 cm Länge von PE10 Schläuche (Polyethylen-Schlauch 0,024" OD x 0,011" ID) gefüllt mit ACFS (126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4 , 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 10 mM Glukose, 26 mM Nahco33; pH 7.4 Wenn vergast mit 95 % O2 und 5 % CO2).
- Spülen Sie die Kanüle mit ACFS mit einer 1 mL Spritze mit einer 30G-Nadel (30 x ½" 0,3 x 12) ausgestattet.
-
Chirurgischer Eingriff
Hinweis: Die chronische CM Kanülierung kann die Tiere wieder aus dem chirurgischen Eingriff. CM-Injektionen sind am Tag nach der Implantation der Kanüle gemacht und können vor allem bei narkotisierten oder wach Tieren durchgeführt werden. Da dies eine Wiederherstellungs-Operation ist, sollten die Verfahren unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.- Die Maus (C57BL/6JRj, beiderlei Geschlechts, 8 Wochen) wiegen und mit einer Mischung aus Ketamin und Xylazin zu betäuben (100 mg/kg; 10 mg/kg, beziehungsweise) mittels Injektion intraperitoneal (i.p.). Falls erforderlich, redose die Maus mit einer halben Dosis von Ketamin (50 mg/kg) während des chirurgischen Eingriffs. Alternativ für chronische Kanülierung betäuben Sie Maus, indem man sie in eine Isofluran Induktion Kammer bei 2,5-3 % Isofluran, in ca. 1 L/min O2. In diesem Fall verwenden Sie einen Nase Kegel, um Isofluran-Narkose bei 1,5-2 % während der Operation zu erhalten.
- Wenn Zehe Prise aufhören Reflexe, und die Atmung langsam, aber stetig wird, platzieren Sie das Tier in einem stereotaktischen Rahmen über ein Heizkissen.
- Ophthalmologische Salbe anwenden. Während der Operation bei Bedarf wiederholen.
- Rasieren Sie des Kopfes und Halses der Maus entfernen Sie Fell und Sterilisieren Sie exponierten Haut zuerst mit einem Alkoholtupfer und dann zwei Mal mit Chlorhexidin (0,5 %) oder Jod-Lösung (2 %). Wiederholen Sie die Sterilisation noch zweimal.
Hinweis: Ändern Sie den chirurgischen Faltenwurf um Schmutz und Haare nach der Rasur zu entfernen. Dann legen Sie das Tier um den sterilen Bereich zu schützen. - Für die chronische Kanülierung verwalten 0,5 - 1 ml Lidocain/Bupivacain (1 mg/ml und 0,25 mg/ml, beziehungsweise) subkutan (s.c.) an der Schnitt-Stelle. Verwalten Sie Buprenorphin (0,05 mg/kg; s.c.) für postoperative Analgesie.
- Befestigen Sie die Maus in der stereotaktischen Rahmen. Neigen Sie nach Sicherstellung Fixierung, entweder Intraural oder durch den Jochbogen den Kopf leicht, so dass es mit dem Körper (Abbildung 1E) einen Winkel von 120° bildet.
- Der Teil des Schädels hervorstehenden unmittelbar oberhalb der Nackenmuskulatur - occipital Kamm zu finden. Heben Sie die darüber liegende Haut mit der Pinzette, und schneiden Sie eine Mandel geformte Stück Haut von ca. 1 cm entlang der Mittellinie. Mit Wattestäbchen oder Auge Speere, eine daraus resultierende Blutung zu kontrollieren.
- Mit dem okzipitalen Kamm als Bezugspunkt, Auseinanderziehen der oberflächlichen Bindegewebes um die Nackenmuskulatur unten verfügbar zu machen.
- Trennen Sie die Muskeln an der Mittellinie, indem man sorgfältig die Zange in der Mitte des Standortes Schnitt in der vorderen zur hinteren Achse. Begleiten Sie mit ein paar gebogene Pinzetten in jeder Hand die Spitzen in der Mitte im unteren Bereich des Schädels und ziehen Sie die Muskeln beiseite.
Hinweis: Dies sollte die CM aussetzen die erscheint als ein kleines umgekehrtes Dreieck, beschrieben durch das Kleinhirn über und der Medulla unten, hinter dem transluzenten dural Membran (Abbildung 1 b und 1 C). - Wischen Sie mit einem chirurgischen Auge Speer oder Baumwolle Tupfer, die durale Membran, die die CM.
-
Einführen der Kanüle in den CM
- Entfernen Sie die Kanüle aus der ACFS gefüllten Spritze, halten die 30G Nadel an das hintere Ende des Schlauches befestigt.
- Ein destilliertes Wasser gefüllten 100 µL Spritze verbunden mit einer Spritzenpumpe zuordnen Sie 30G Nadel.
- Legen Sie eine Luftblase von ca. 1 cm in die Kanüle durch den Austritt von Luft mit Hilfe einer Spritze-Pumpe.
- Über eine Spritzenpumpe, 12 μL des gewünschten CSF Tracer in die Kanüle zurückziehen.
- Fassen Sie die Kanüle, gefüllt mit dem CSF-Tracer in der Nähe von Rohr-bedeckten Nadel mit einem gebogenen Pinzette in der dominanten Hand gehalten. Der Mittelfinger der nichtdominanten Hand auf das Ohr-Bar von der gegenüberliegenden Seite und hält es für die spätere Verwendung als Auflage für die Kanüle fest.
- Stecken Sie die Kanüle in einem Winkel von 45° gegenüber der Maus-Kopf vorbei in die Mitte des CM, gekennzeichnet durch seine dreieckige Aspekt gesehen durch die Dura. Vermeiden Sie jede Durchdringung des Kleinhirns oder der Medulla. Stellen Sie sicher, dass die Nadel wo Abschrägung vollständig unter die Dura ist nur bis zu einer Tiefe von 1-2 mm, d. h. bis zu dem Punkt eingefügt wird. Lassen Sie die Pinzette halten die Kanüle und lassen Sie die Kanüle auf die nicht-dominante Hand ruhen.
Hinweis: Das abgeschrägte Ende der zahnärztlichen Nadeln erfordert die Anwendung einer Kraft, die durale Membran, die die CM zu durchbohren. - Ggf. Trocknen Sie GfK Leck bei der Penetration mit einem chirurgischen Auge Speer oder Baumwolle Tupfer ab.
- Tropfen Sie 2-3 Cyanacrylat-Klebstoff auf die dural Membran umgibt die Kanüle. Geben Sie einen Tropfen Klebstoff-Beschleuniger, den Kleber sofort zu heilen. Decken Sie die Schädel und Nadel mit einer Mischung aus dental Zement (ca. 0,5 mg) und Cyanacrylat-Klebstoff (3-5 Tropfen). Sofort danach geben Sie einen Tropfen Kleber Schnellinfo zu heilen.
- Schneiden Sie für chronische Kanülierung den Schlauch (Abfahrt ca. 2-3 cm befestigt an der Kanüle) und versiegeln Sie es mit einer chirurgischen Schweißnaht die Hirndruck (ICP) Ebenen beibehalten, CSF Leckage durch den Schlauch zu verhindern.
- Verwalten Sie für chronische Kanülierung Carprofen (5 mg/kg; s.c.)
- Platzieren Sie für chronische Kanülierung den Mauszeiger in einem Käfig, halten es über ein Heizkissen auf Körpertemperatur zu halten, bis das Tier vollständig aus der Narkose erholt ist.
Hinweis: Die Tiere sollten einzeln untergebracht werden, in ihren Käfigen zu versichern, dass die Kanüle intakt bleibt. Stellen Sie sicher, dass die Nase frei von Einstreu ist, indem Sie die Maus auf einem Papiertuch oder anderen festen Substrat.
Hinweis: Am nächsten Tag, wenn der chirurgische Eingriff zum einführen der Kanüle Tiere erholt sind, können sie mit CSF Tracer injiziert werden. Injektionslösung in Narkose verabreichen eine Mischung von Ketamin/Xylazin (100 mg/kg; 10 mg/kg, beziehungsweise; i.p.) und fahren Sie mit Abschnitt 2beschriebenen Schritte. Fahren Sie für die Injektion in wach Tiere mit Abschnitt 3.
2. Injektion von CSF Tracer über akute implantierten CM Kanüle bei narkotisierten Tieren
Hinweis: Für die Injektion von CSF Tracer über akute implantierten CM Kanüle bei narkotisierten Tieren unmittelbar nach Schritt 8 aus vorherigen Abschnitt fort, CSF Tracer Injektion wie unten beschrieben.
- Starten Sie mithilfe einer Spritzenpumpe die Injektion in die CM der CSF Tracer mit einer Rate von 1 μl/min für 5 oder 10 min, was zu einem Gesamtvolumen von 5 µL oder 10 µL bzw.. Am Ende der Injektion erlauben Sie die CSF-Tracer im gesamten Gehirn für 30 min mit der Kanüle ungestört zirkulieren.
- Schneiden Sie nach 30 min den Schlauch an der Kanüle (ca. 4 cm Abstand von der Spitze der Nadel) angeschlossen und versiegeln Sie seinem Ende mit einer chirurgischen Naht zu.
- Tiefe Narkose einschläfern des Tieres durch Enthauptung. Schnell das Gehirn sezieren und beheben das Gewebe durch Eintauchen in 4 % Paraformaldehyd (PFA) in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung verdünnt (PBS, 0.01M, pH 7,4) über Nacht (o/n) bei 4 ° C.
3. Injektion von CSF Tracer über chronisch implantierten CM Kanüle in wach Tiere
- Über eine Spritzenpumpe, 7 µL oder 12 µl des gewünschten CSF Tracer in eine Kanüle, bestehend aus ca. 30 cm PE10 Schläuche mit einer abgeschrägten dental Nadelspitze 0,5 cm zurückziehen.
- Das Tier vorsichtig zurückhalten und Schneiden von ca. 1 cm des Schlauches an der Kanüle befestigt.
- Noch unter sanften Ruhigstellung, verbinden Sie schnell die Kanüle gefüllt mit CSF Tracer an der Kanüle CM implantiert.
- Über eine Spritzenpumpe, beginnen die Injektion in die CM der CSF-Tracer mit einer Rate von 1 µL/min injizieren 7 µL oder 12 µL zu einem Endvolumen von CSF gespritzt Tracer 5 µL oder 10 µL der ACFS noch in die implantierten Kanüle kompensieren. Am Ende der Injektion erlauben Sie die CSF-Tracer im gesamten Gehirn für 30 min mit der Kanüle ungestört zirkulieren. Sicherstellen Sie, dass das Rohr während der Injektion und Zirkulation verbunden bleibt.
- Am Ende des CSF Tracer Zirkulation Zeit gehen Sie zur Sterbehilfe durch Enthauptung, versicherte, dass das Tier tief betäubt ist. Schnell das Gehirn sezieren und beheben das Gewebe durch Eintauchen in 4 % Paraformaldehyd (PFA) in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung verdünnt (PBS, 0.01M, pH 7,4) über Nacht (o/n) bei 4 ° C.
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Representative Results
Bei der Fixierung von Mäusen oder Ratten in einem stereotaktischen Rahmen sind die Nackenmuskulatur rund um die Region occipital Kamm unverblümt seziert, um die Cisterna Magna (CM) verfügbar zu machen. Die dreieckige Struktur des CM ist leicht zwischen dem kaudalen Teil des Kleinhirns und der Medulla (Abbildung 1A-1 C) anerkannt. Die Kanüle wird 1-2 mm in die CM eingefügt, durch sanft piercing die blockfreien-okzipitalen Membran (Abbildung 1). Die Dura-Membran ist eine harte Struktur und das einführen der Kanüle wird durch Kippen der Koepfe von 120° im Verhältnis zum Körper verbessert. Mit Hilfe einer Einspritzpumpe sind anders gekennzeichneten Moleküle dann in die Cisterna Magna kontrollierten Preisen (Abbildung 1E) injiziert. Nach einem Intervall CSF Tracer Zirkulation zu ermöglichen werden Tiere eingeschläfert. Das Gehirn ist sorgfältig seziert und fixiert durch Eintauchen in 4 % PFA o/n bei 4 ° C. Makroskopische dorsale Ansichten der Gehirne von CM-injiziert Nagetiere geerntet zeigen die Verteilung der CSF Tracer in den Subarachnoidalraum Zisternen des Kleinhirns, in den Riechkolben und im Paravascular Raum entlang der mittleren zerebralen Arterien (MCAs) (Abbildung 1F ). Im ventralen Teil des Gehirns zeigen makroskopischen CSF tracerverteilung entlang der Kreis von Willis (Abbildung 1). Histologischen Abschnitte CM injiziert Gehirne weiter zeigen die Paravascular Verteilung der Tracer in der Anwesenheit von. Mäuse injiziert in Narkose (Abbildung 1 H) (oder im natürlichen Schlaf, siehe1) zeigen eine bemerkenswerte Steigerung im tracerverteilung in der Anwesenheit von im Vergleich zu Mäusen injiziert während wach und frei beweglichen in ihrem Hause Käfig (Abbildung 1I).
Abbildung 1: Injektion von Tracern in der Cisterna Magna. (A) schematische Übersicht über die Maus Kopf und Gehirn zeigt den Speicherort der Cisterna Magna (CM) in Bezug auf das Gehirn und kranialen Strukturen. (B) Mikrophotographie von exponierten CM nachdem der umliegenden Nackenmuskulatur unverblümt seziert und an den Seiten gedrängt wurden. (C) höhere Vergrößerung des Bereichs dargestellt in B (schwarzes Rechteck), zeigt die umgekehrte Dreiecksstruktur der CM (gestrichelte Linie) und die Lage in Bezug auf die umliegenden Strukturen, d.h. okzipitalen Crest, Kleinhirn und Medulla. (D) Mikrofotografie der Kanüle eingefügt in das CM. (E) Schema der seitlichen Blick auf die Maus fester Kopf, leicht schräg in einem Winkel von 120° im Verhältnis zum Körper. Einschub der gestrichelte Rechteck abgegrenzt Bereich zeigt das Schema einer parasagittalen Ansicht Regelung parasagittalen Blick auf das Gehirn der Maus mit der Kanüle in das CM eingefügt wie in E. beschrieben Eine Spritze, die an einer Einspritzpumpe gekoppelt ist, wird verwendet, um CSF Tracer oder Kontrastmittel in die CM durch ein Rohr verbunden mit einer feinen Nadel 30 G zu liefern. Repräsentative Bilder des ganzen Mäusegehirns bei 30 min nach dem Ende des CM-Injektion mit einer fluoreszierenden Tracer von der dorsalen (F) und ventralen (G) Aspekten gesehen. (H, I,) Repräsentative koronalen Gehirn Abschnitte mit DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole; 1 µg/mL mit PBS-Puffer) von Mäusen injiziert mit CSF Tracer in CM unter narkotisierten (H) und Wachheit (I), 30 min nach dem Ende des CM-Injektion mit einer Rate von 1 µL/min von 5 µL counterstained Band aus einer Mischung von Ovalbumin-AF647-Konjugat (OA, 45kDa, 2 % in ACFS) und Dextran-FITC-Konjugat (DEX, 3kDa, 2 % in ACFS). Maßstabsbalken, 5 mm für B, C, F, G; 2 mm für D und 500 µm für H, I. Cb, Kleinhirn; CM, Cisterna Magna; CTX, Rinde; und OB, Riechkolben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Wir haben ein Protokoll vorgelegt, die ein detailliertes Verfahren für Cisterna Magna Kanülierung (CMc), die bietet eine einfache Methode beschreibt um markierte Moleküle an das CSF-Fach zu liefern. CMc ermöglicht die spätere Visualisierung der CSF Dynamik, in Vivo und ex Vivo, mittels verschiedener bildgebender Verfahren oder Histologie.
Einer der Hauptvorteile der CMc-Technik liegt in einen direkten Zugang zum Subarachnoidalraum ohne die Notwendigkeit, das Gehirn von Kraniotomie aussetzen. Durch nicht erfordern ein kranialen Fenster oder Eindringen von der Anwesenheit von mit einer Nadelspitze, ermöglicht CMc die Lieferung von Molekülen in der CSF-Fach und die Bewertung des Glymphatic Systems durch ein minimal-invasives Verfahren mit nur kurze Störung der intrakraniellen Druck (ICP).
Bemerkenswert ist die Injektion in die CM hinter die Hauptquellen des CSF, die Aderhaut Plexi befindet sich in das Ventrikelsystem (seitliche, dritten und vierten Ventrikel). Von der seitlichen Ventrikel, CSF fließt an den dritten Ventrikel über die intraventrikuläre Foramina (Foramen Monro) und von der dritten bis vierten Ventrikel über die zerebrale Aquädukt (das Aquädukt von Sylvius) im Hirnstamm und Rückenmark (rezensiert in3 ). CSF erreicht den Subarachnoidalraum über die CM fließt durch die mittlere Öffnung (oder Foramen Magendie) und somit CMc Injektionen umgehen der gesamten Ventrikelsystem. Während dies in einigen Modellen der CSF/ISF Dynamik durch die Ventrikel problematisch sein kann, jedoch direkter Einspritzung von Tracern in die Ventrikel invasive chirurgische Verfahren wie Burr Bohrungen in die Schädel-Fenster und die Anwendung der ventrikuläre Injektionen stören erheblich den ICP-13. Ebenso schafft Druck Injektion des Tracers in den Subarachnoidalraum13,14 in unseren Händen das Flussmittel von CSF Tracern entlang den Paravascular Raum. Im Gegensatz dazu obwohl CMc Punktion der duralen Membran mit sich bringt, ICP ist nur vorübergehend gestört und ist schnell wieder2.
Mit der CMc, kann Glymphatic Aktivität bei narkotisierten Tieren nach akuten CMc sowie in wach Tiere, beobachten eine 24-Stunden Erholungszeit nach Kanüle Implantation gemessen werden. Akute CMc eignet sich für Kombination mit 2-Photon imaging bietet detaillierte Informationen über Glymphatic Tätigkeit im Kortex bis zu einer Tiefe von ca. 200 µm1,2. Wichtig ist, bietet akute CMc auch den Vorteil der Unterstützung von unvoreingenommener MRI Studies, wo tracerverteilung dynamisch, im Vergleich zu einer einzelnen Basis-Image erworben vor der Einleitung von CSF Tracer Injektion15, gefolgt ist 16 , 17. für MRI, die zahnärztliche Nadel zum CMc verwendet sollte ersetzt werden durch eine Borosilikat Kapillare (ca. 1 cm Länge, Durchmesser von ca. 20 µm) auf das PE-Rohr befestigt.
Chronische CMc erlaubt im Gegensatz zur akuten Kanülierung den Experimentator CSF Tracer Injektion bei Tieren im natürlichen Schlaf oder unter Narkose durchführen, als auch in wach, frei beweglichen Tieren. Dies ist ein entscheidender Faktor, da Glymphatic Aktivität hoch Zustand abhängig ist; Tracer Zustrom auf das Parenchym ist viel größer, bei Tieren, die unter Betäubung injiziert wurden oder sich im Ruhezustand als bei Tieren, die im Wachzustand1injiziert wurden. Darüber hinaus können Tiere mit einer chronisch implantierten Kanüle CSF Tracer in ihrem Hause Käfig erhalten minimiert Störfaktoren aufgrund der Auswirkungen von Stress und Erregung auf Glymphatic Tätigkeit. Für chronische Injektionen unter Narkose, eine Mischung von Ketamin/Xylazin (100 mg/kg; 10 mg/kg, beziehungsweise) wird empfohlen. Isofluran bei Konzentrationen über 1,5 % induziert Gehirn Schwellung und fördert nicht Glymphatic Aktivität im Vergleich zu den Wachen Zustand1. Beachten Sie, dass nach der Implantation CMc Tiere einzelne untergebracht, um sicherzustellen, dass CMc implantiert Tiere die Kanüle von einander nicht beschädigt werden. Auch, da die CMc chronische Implantation ein chirurgischer Eingriff Erholung ist, es sollte unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden und Tiere sollten postoperative Schmerzmittel erhalten.
Wichtig ist, CMc als Methode einsetzbar, um CSF Tracer bei Mäusen als auch bei Ratten, mit minimalen Änderungen des Protokolls zu liefern. Geeignete Anästhesie verabreicht werden sollte und die maximale Lautstärke des CSF-Tracer, die bei Ratten injiziert ist 30 µL, aufgrund der Unterschiede in der Größe der ventrikulären und subarachnoidale Räume zwischen den beiden Arten.
Trotz seiner prozessualen Einfachheit ist einige Ausbildung und Praxis erforderlich für den Experimentator, CMc erfolgreich durchzuführen. Da die CM in der Größe zwischen Arten und einzelne Tiere variiert, ist es ratsam, die Anerkennung seiner Struktur zu praktizieren. Üben das Verfahren mit Evans Blue (2 % in ACFS) ermöglicht den Experimentator, richtige Nadel einfügen zu bestätigen. Gelegentlich wird ein Schiff direkt an der Mittellinie des CM, sein, worauf die Nadel direkt neben dem Schiff eingefügt werden soll, aber so nah wie möglich an der Mittellinie. Diesen Fällen sollte, um spätere Bestätigung darauf hingewiesen, dass Tracer gleichmäßig, trotz der außermittig Platzierung der Nadelspitze verteilt sind. Wichtig ist, die Atlas-Occipital-Membran, die die CM ist mechanisch hart, und genügend Druck angewandt werden, um die abgeschrägte Nadelspitze einzufügen. Es ist jedoch wichtig, dass der Druck nicht stürzen die Nadelspitze in der Medulla oder das Kleinhirn führt. Zur Erleichterung der Nadel einführen in die CM sollte der Kopf der Tiere nach unten in einem Winkel von 120° im Verhältnis zum Körper gekippt werden, die die Membran erstreckt. Wichtig ist, sollte Vorsicht nicht zu Atmung behindern von diesem Kopf Flexion. Wenn die Nadelspitze das Kleinhirn eingeben sollte, Tracer im Gewebe verbleiben und nicht in den Subarachnoidalraum zu verteilen. Schäden an der Medulla ist häufig tödlich, während Kleinhirn Schäden in chronischen Hohlräumen in Erschöpfung und allgemeine Auffälligkeiten im Verhalten der Tiere führen kann. Zur Minimierung des Risikos der dieser Eventualität können Nadeln mit einer kleineren schräge Länge verwendet werden.
Wenn die Muskeln im Hals-Bereich zu verschieben, der erstreckt sich die Dura-Membran um die Kanüle in den CM einzufügen, kann Blutungen auftreten. Wattestäbchen können verwendet werden, um die Blutung zu absorbieren, sondern alternativ Eisenchlorid Lösung angewendet werden kann. Eisenchlorid hat eine blutstillende Wirkung18und löst auch die Versteifung der Nackenmuskulatur um die Schnitt-Stelle, damit die um korrekte Einsetzen der Nadel in die CM. Eisenchlorid zu erhalten, die Chlorid auch Schädel und dural Membran austrocknet, bessere Oberflächen für die Haftung der Kanüle zu präsentieren. Beantragen Sie CMc 1-2 Tropfen Eisenchlorid-Lösung (10 %) (ca. 1 mL) in einem Baumwoll Tupfer und tupfen Sie die Nackenmuskulatur und der okzipitalen Kamm. Topische Eisenchlorid kann jedoch möglicherweise durch die Membran in den Liquor mit unbekannten Auswirkungen auf Gehirn Homöostase sickern. Wenn die Verwendung von Eisenchlorid ein Anliegen ist, kann man stattdessen Wunde Retraktoren verwenden, die Schnitt-Website offen zu halten. Schonende Entfernung der Wunde Retraktoren nach dem Auftragen des Cyanacrylat-Klebstoff vermeidet ungewollte Bindung an die Schnitt-Website.
CMc ist eine einfache und reproduzierbare Verfahren Moleküle direkt in das CSF-Fach zu liefern. Da CMc minimal-invasiv ist, ist die bevorzugte Methode für die Visualisierung des Glymphatic Systems und ist kombinierbar mit verschiedenen Bildgebungsverfahren wie Epifluoreszenz und 2-Photonen-Mikroskopie oder MRI. Daher stellt CMc ein großes Werkzeug für Studien der Fluiddynamik, nämlich CSF und ISF, und auch des Gehirns flüssige Abfertigung. Aufgrund der makroskopischen Berichterstattung des Glymphatic Systems hat CMc das Potenzial, verwendet werden, um Moleküle Gehirn-weite zu liefern.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die Novo Nordisk Stiftung und National Institute of Neurological Disorders und Schlaganfall, NINDS/NIH (M.N) unterstützt. A.L.R.X. und S.H-R sind Empfänger von ein Postdoc-Stipendium und ein Promotionsstipendium der Lundbeck-Stiftung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SOPIRA Carpule 30G 0.3 x 12mm | Kulzer | AA001 | |
| Polyethylene Tubing 0.024” OD x 0.011” ID | Scandidact | PE10-CL-500 | |
| 30G x ½” 0.3 x 12 mm Luer-Lock | Chirana T. Injecta | CHINS01 | |
| Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate) | Meda AS | no catalogue number, see link in comments | http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/ |
| Alcohol Swab 70% Isopropyl Alcohol 30 x 60mm | Vitrex Medical A/S | 520213 | |
| Viskoese Oejendraeber Ophtha | Ophtha | 145250 | |
| Wooden applicator, Double cotton bud (Ø appr. 4 - 5 mm, length appr. 12 mm) | Heinz Herenz | 1032018 | |
| Eye spears | Medicom | A18005 | |
| Ferric chloride 10% solution | Algeos | NV0382 | |
| Kimtech Science Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark Professional | 05511 | |
| Loctite Super Glue Precision 5g | Loctite | no catalogue number, see link in comments | http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html |
| Insta-Set CA Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-152 | |
| Dental Cement Powder | A-M Systems | 525000 | |
| Surgical weld | Kent Scientific Corporation | INS750391 | |
| Hamilton syringe GASTIGHT® , 1700 series, 1710TLL, volume 100 μL, PTFE Luer lock | Hamilton syringes | 1710TLL | |
| LEGATO 130 Syringe pump | KD Scientific | 788130 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS; 0.01M; pH 7.4) | Sigma Aldrich | P3813 | |
| Ovalbumin, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | O34784 | |
DAPI (diamidino-2-phenylindole) Solution (1 mg/mL) |
Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dextran, Fluorescein, 3000 MW, Anionic | Thermo Fisher Scientific | D3305 | |
| E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic System | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
| Euthanimal 200mg/mL (sodium pentobarbital) | ScanVet | 545349 | |
| Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine) | Intervet International BV | 511519 | |
| Rompin Vet 20 mg/mL (xylazin) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| Xylocain 20 mg/mL (lidocain) | AstraZeneca | 158543 | |
| Marcain 2.5 mg/mL (bupivacain) | AstraZeneca | 123918 | |
| Bupaq Vet 0.3 mg/mL (buprenorphine) | Richter Pharma AG | 185159 |
References
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